DETERMINACIÓN DE FENOLES (curva baja)

1. OBJETIVO
1.1. El presente instructivo describe en forma resumida el desarrollo del ensayo de
fenol bajo la norma de la referencia SMEWW-APHA-AWWA-WEF Part 5530
B,C 23rd Ed. 2017.

1.2. Garantizar un proceso de análisis preciso y veraz bajo un lenguaje común y

estándar para todos los analistas.

2. ALCANCE
Para la matriz de agua natural, agua para uso y consumo humano, agua salina y
agua residual.

3. DEFINICIONES
3.1. Fenol
Los fenoles, definidos como derivados hidroxilados de benceno y sus núcleos
condensados, pueden ocurrir en aguas residuales domésticas e industriales,
aguas naturales y suministros de agua potable. La cloración de tales aguas
puede producir clorofenoles de sabor desagradable y desagradable. Los
procesos de eliminación de fenol en el tratamiento del agua incluyen
supercloración, tratamiento con dióxido de cloro o cloramina, ozonización y
adsorción de carbón activado.
Los procedimientos analíticos ofrecidos aquí utilizan el método colorimétrico de
4-aminoantipirina que determina fenol, orto y meta fenoles sustituidos y, en
condiciones de pH adecuadas, esos para fenoles sustituidos en los cuales la
sustitución es un grupo carboxilo, halógeno, metoxilo o ácido sulfónico. El
método de 4-aminoantipirina no determina aquellos fenoles para-sustituidos
donde la sustitución es un grupo alquilo, arilo, nitro, benzoilo, nitroso o
aldehído. Un ejemplo típico de estos últimos grupos es paracresol, que puede
estar presente en ciertas aguas residuales industriales y en aguas superficiales
contaminadas.
El método de 4-aminoantipirina se administra en dos formas:
5530C: para una sensibilidad extrema, es adaptable para su uso en muestras
de agua que contienen menos de 1 mg de fenol/L. Concentra el color en una
solución no acuosa.
5530D: retiene el color en la solución acuosa. Debido a que las cantidades
relativas de varios compuestos fenólicos en una muestra dada son
impredecibles, no es posible proporcionar un estándar universal que contenga
una mezcla de fenoles. Por esta razón, el fenol (C 6H5OH) se ha seleccionado
como estándar para los procedimientos colorimétricos y cualquier color
producido por la reacción de otros compuestos fenólicos se informan como
fenol. Porque la sustitución generalmente reduce la respuesta, este valor
representa la concentración mínima de compuestos fenólicos.

3.2. Método de extracción de cloroformo

 DETERMINACIÓN DE FENOLES (curva baja)
Los fenoles destilables al vapor reaccionan con 4-aminoantipirina a pH 10.0 ±
0.1 en presencia de ferricianuro de potasio para formar un colorante antipirina
coloreado. Este colorante se extrae de una solución acuosa con CHCl 3 y la
absorbancia se mide a 460 nm. Este método cubre el rango de concentración
de fenol de 1.0 µg / L a más de 250 µg / L con una sensibilidad de 1 µg / L.

4. RESPONSABILIDADES
4.1. Analistas
Responsables de su elaboración, ejecución y cumplimiento del presente
instructivo.

4.2. Supervisor de Laboratorio

Responsable de su implementación y seguimiento del presente instructivo.

4.3. Jefe de Laboratorio o Director Técnico

Responsable de la aprobación y seguimiento cumplimiento del presente
instructivo.

5. DESCRIPCIÓN
5.1. Colección de muestra, preservación y almacenamiento
5.1.1 Se realiza la toma de muestra según los instructivos de muestreo:

 Muestreo de suelos

5.1.2 Los requisitos mínimos para el ensayo de Fenol son:

i. Recolectar como mínimo 250g de muestra en frasco de plástico o
vidrio pavonado.
ii. Almacene las muestras a 4 °C o menos, a menos que se analicen
dentro de las 4 h posteriores a la recolección.
iii. Almacenar la muestra por 28 dias a 4ºC después del análisis.
iv. Por cada 20 muestras o menos enviar un duplicado.
v. Para mayor detalle revisar el documento:

 Requisitos mínimos para ensayos de muestras

ambientales – Suelos.

5.2. Materiales, Equipos y/o Suministros

5.2.1 Espectrofotómetro para uso a una longitud de 460 nm provisto de una
celda de vidrio con paso de luz de 1.0 cm.
5.2.2 Balanza analítica con aproximación 0.0001 g.
5.2.3 Aparato de Destilacion con condensador.
5.2.4 Micropipetas Calibradas de 1, 5 y 10 mL.
5.2.5 Potenciómetro con lectura de pH con resolución minima de 0.05
unidades de pH y lectura en milivoltios
5.2.6 Matraces de 500 mL
5.2.7 Peras de decantación de 1000 mL.

5.3. Reactivos y/o estándares

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5.3.1 Prepare todos los reactivos con agua destilada libre de fenoles y cloro.
5.3.2 Solución de ácido fosfórico (H3PO4), 1 + 9: diluir 10 mL 85% de H3PO4 a
100 mL con agua.
5.3.3 Solución indicadora de anaranjado de metilo.
5.3.4 Reactivos especiales para destilados turbios:
i. Ácido sulfúrico (H2SO4), 1N.
ii. Cloruro de sodio (NaCl).
iii. Cloroformo (CHCl3) o cloruro de metileno (CH2Cl2).
iv. Hidróxido de sodio (NaOH), 2.5N - Diluir 41.7 mL 6N NaOH a 100
mL o disuelva 10 g de gránulos de NaOH en 100 ml agua.
5.3.5 Solución stock de fenol: disuelva 0.1g de fenol en agua destilada recién
hervida y enfriada y diluya a 100 mL. Normalmente, este pesaje directo
produce una solución estándar; Si se requiere una precisión extrema,
estandarice de la siguiente manera:
i. A 100 mL de agua en un matraz cónico con tapa de vidrio de 500
mL, agregue 50.0 mL de solución stock de fenol y 10.0 mL de
solución de bromuro bromato. Inmediatamente agregue 5 mL de
HCl concentrado y agite suavemente. Si el color marrón del bromo
libre no persiste, agregue porciones de 10.0 mL de solución de
bromuro de bromato hasta que lo haga.
ii. Mantenga el matraz tapado y déjelo reposar durante 10 minutos;
luego agregue aproximadamente 1g de KI. Por lo general, se
requieren cuatro porciones de 10 mL de solución de bromuro de
bromato si la solución de fenol de reserva contiene 1000 mg de
fenol/L.
iii. Prepare un blanco exactamente de la misma manera, usando agua
destilada y 10.0 mL de solución de bromato-bromuro. Titule el
blanco y la muestra con tiosulfato de sodio 0.025 M, usando una
solución de almidón indicador
iv. Calcule la concentración de solución de fenol de la siguiente
manera:

Fenol
mg de =7.842 [ ( AxB ) −C ]
L
Donde:
A = mL de Tiosulfato par el blanco
B = mL desolucion de Bromuro Bromato utilizada para la
muestra dividida por 10.
C = mL de Tiosulfato utilizado para la muestra

5.3.6 Solución intermedia de fenol: Diluya 1.00 mL de solución stock de fenol

en agua destilada recién hervida y enfriada a 100 mL; 1 mL = 10.0 µg
de fenol. Prepararse diariamente
 DETERMINACIÓN DE FENOLES (curva baja)
5.3.7 Solución de fenol estándar: Diluya 50.0 mL de solución intermedia de
fenol a 500 ml con agua destilada recién hervida y enfriada; 1 mL = 1,0
µg de fenol. Preparar dentro de las 2 h de uso.
5.3.8 Solución de bromuro de bromato: disuelva 2.784 g anhidro KBrO3 en
agua, agregue 10 g de cristales de KBr, disuelva y diluya1000 mL.
5.3.9 Ácido clorhídrico (HCl), conc.
5.3.10 Titulante de tiosulfato de sodio estándar 0.025M : disuelva 6.205 g de
Na2S2O3 5H2O en agua reactiva. Añadir 1,5 mL de NaOH 6 M o 0,4 g de
NaOH sólido y diluir a 1000 mL. Estandarizar con solución de biyodato
de potasio [KH(IO3)2] 0.0021M .Estandarice de la siguiente manera:
i. Disolver 2g de KI, exento en yodato en un Erlenmeyer con 100 a
150 ml de ague destilada.
ii. Agregar 1mL de H2SO4 3N o unas gotas de H2SO4 (c) y 20 mL de
solución patrón de biyodato.
iii. Diluyase a 200 mL y titulese el yodo liberado con tiosulfato de sodio
añadiendo almidon cuando se produzca un color amarillo palido.
iv. La titulación termina cuando la solución queda transparente.
v. Cuando las soluciones son de igual resistencia, se deben requerir
20.00 mL 0.025M Na2S2O3. Si no, ajuste la solución de Na2S2O3 a
0.025M.
vi. Calcule la concentración del tiosulfato Na2S2O3 de la siguiente
manera:
F C =V T ¿ ¿

Normalidad Na2 S 2 O3=Fc x N T

Donde:
F C = Factor de Corrección de Na2S2O3
V T = Volumen Teórico de [KH(IO3)2]
V exp = Promedio de Volumen Experimental de Na2S2O3
N T =¿ Normalidad Teórica de Solución Valorante

vii. La valoración es registrada en el formato:

 Valoracion de Solucion – Factor.

5.3.11 Solución de almidón: disuelva 2 g de almidón soluble y 0.2 g de ácido

salicílico (como conservante) en 100 mL de agua caliente destilada.
5.3.12 Hidróxido de amonio (NH4OH), 0.5N: Diluya 35 mL de NH4OH fresco
concentrado a 1 L con agua.
5.3.13 Solución tampón de fosfato: disuelva 104.5 g de K2HPO4 y 72.3 g de
KH2PO4 en agua y diluya a 1 L. El pH debe ser 6.8.
5.3.14 Solución de 4-aminoantipirina: disolver 2,0 g de 4-aminoantipirina en
agua y diluir a 100 mL. Prepárate a diario.
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5.3.15 Solución de ferricianuro de potasio: disolver 8,0 g de K 3Fe(CN)6 en
agua y diluir a 100 mL. Filtrar si es necesario. Almacenar en una botella
de vidrio marrón. Preparar fresco semanalmente.
5.3.16 Cloroformo (CHCl3).
5.3.17 Sulfato de sodio, Na2SO4 anhidro, granular.
5.3.18 Yoduro de potasio (KI), cristales.
5.3.19 Para el pesaje adecuado de los reactivos utilizando la balanza
analítica,revisar el instructivo:

 Manejo de la Balanza Analitica.

5.4. Tratamiento Preliminar de las muestras

5.4.1 Interferencias
i. Las interferencias como las bacterias que se descomponen con
fenol, las sustancias oxidantes y reductoras y los valores de pH
alcalino se tratan por acidificación Algunas aguas residuales
altamente contaminadas pueden requerir técnicas especializadas
para eliminar interferencias y para la recuperación cuantitativa de
compuestos fenólicos.
ii. Agentes oxidantes, como el cloro y los detectados por la liberación
de yodo en la acidificación en presencia de yoduro de potasio (KI):
retire inmediatamente después del muestreo agregando un exceso
de sulfato ferroso (FeSO4). Si no se eliminan los agentes oxidantes,
los compuestos fenólicos se oxidarán parcialmente. Compuestos de
azufre: elimínelos acidificando a pH 4.0 con H3PO4 y aireando
brevemente agitando. Esto elimina la interferencia del sulfuro de
hidrógeno (H2S) y el dióxido de azufre (SO2).

iii. Aceites y alquitranes: realice una extracción alcalina ajustándola a

un pH de 12 a 12.5 con gránulos de NaOH. Extraer el aceite y el
alquitrán de la solución acuosa con 50 mL de cloroformo (CHCl 3).
Deseche la capa que contiene aceite o alquitrán. Eliminar el exceso
de CHCl3 en una capa acuosa calentando sobre baño de agua
antes de continuar con el paso de destilación.

5.4.2 Condiciones ambientales

Sala de ensayo a temperatura ambiente el cual se especifica en:

 Instalaciones y Condiciones Ambientales

5.5. Ejecución del Ensayo

5.5.1 Los materiales de vidrio a ser utilizados en el análisis deberán lavarse de
acuerdo a lo indicado en:

 Control de Agua y Lavado de Materiales.

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5.5.2 Curva de Calibración
i. A partir de la solución estándar de Fenol preparar una serie de
patrones de fenol de 500 mL que contengan 5, 10, 20, 30, 40 y 50
µg de fenol.
ii. La curva baja de calibración se realiza de la siguiente manera:

Concentración
Volumen Masa de
estándar Alícuota Concentracion
de aforo fenol
intermedio
< µg fenol/ mL > <mL> <mL> mg Fenol/L < µg fenol >
1 0 500 0 0
1 2.5 500 0.005 2.5
1 10 500 0.02 10
1 20 500 0.04 20
1 40 500 0.08 40
1 50 500 0.10 50

iii. Los resultados y cálculos se realizan en el formato:

 Curva de Calibración
5.5.3 Procedimiento de Limpieza (Destilación)
i. Pese 25g de muestra en un vaso de precipitados, agregarle 500mL
deagua libre de fenoles y cloruros, ajuste el pH a
aproximadamente 4.0 con solución de H3PO4 usando un indicador
de naranja de metilo o un medidor de pH, y transfiéralo al aparato
de destilación. Use un cilindro graduado de 500 mL como receptor.
Para la lectura adecuada de pH utilizando el potenciómetro revisar
el instructivo:

 Manual del medidor de pH - Electrodo de Ion Selectivo

(ISE).

ii. Destilar 450 mL de la muestra hasta ebullición, luego detener la

destilación.
iii. Cuando cesa la ebullición agregue 50 mL de agua tibia al matraz
de destilación.
iv. Continuar la destilación hasta que se haya recogido un total de
500mL.
NOTA: Una destilación debe purificar la muestra adecuadamente.
v. Tratamiento cuando el primer destilado es turbio:
a. Acidifique con solución de H3PO4.
b. Destile como se describe en el párrafo iii al v.
vi. Tratamiento cuando el segundo destilado es turbio:
a. Extraiga una porción de 500 mL de la muestra original.
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b. Agregue 4 gotas de indicador de naranja de metilo y haga ácido
a naranja de metilo con H2SO4 1N.
c. Transfiera a un embudo separador y agregue 150 g de NaCl.
d. Agite con cinco porciones sucesivas de CHCl3, usando 40 mL
en la primera porción y 25 mL en cada porción sucesiva.
e. Transfiera la capa de CHCl 3 a un segundo embudo separador y
agite con tres porciones sucesivas de solución de NaOH 2.5N,
utilizando 4.0 ml en la primera porción y 3.0 mL en cada una de
las siguientes dos porciones.
f. Combine los extractos alcalinos, caliéntelos en un baño de agua
hasta que se haya eliminado el CHCl 3, enfríe y diluya a 500 mL
con agua destilada.
g. Proceda con la destilación como se describe en el párrafo iii al
v.
NOTA: CH2Cl2 puede usarse en lugar de CHCl 3, especialmente
si se forma una emulsión cuando la solución de CHCl 3 se extrae
con NaOH.
5.5.4 Procedimiento de Extracción de cloroformo
i. Seguidamente coloque 500 mL de destilado, o una porción
adecuada que contenga no más de 50 microgramos de fenol,
diluido a 500 mL, en un vaso de precipitados de 1 L.
ii. Agregue 12.0 mL de NH4OH 0.5N e inmediatamente ajuste el pH a
10.0 ± 0.1 con tampón fosfato. Transfiera a un embudo de
separación de 1 L.
iii. Agregue 3.0 mL de solución de aminoantipirina, mezcle bien.
iv. Agregue 3.0 mL de solución K3Fe(CN)6, mezcle bien y deje que se
desarrolle el color durante 15 minutos. La solución debe ser clara y
de color amarillo claro.
v. Extraer inmediatamente con 25 mL de CHCl3.
vi. Agite el embudo separador al menos 10 veces, deje que el CHCl 3
se asiente.
vii. Agite nuevamente 10 veces y deje que el CHCl 3 se asiente
nuevamente. Realizar el procedimiento por tercera vez.
viii. Filtre cada extracto de CHCl3 a través de papel de filtro embudos
de vidrio sinterizado que contengan una capa de 5 g de Na 2SO4
anhidro.
ix. Recolecte extractos secos en céldas limpias para mediciones de
absorbancia o en un recipiente de vidrio; no agregue más CHCl 3 ni
lave papeles de filtro o embudos con CHCl3.
x. Lea la absorbancia de la muestra y los estándares contra el blanco
a 460 nm.
xi. Para poder hacer uso correcto del espectrofotómetro, revisar el
siguiente instructivo:

 Manejo del Espectrofotómetro Ultravioleta – Visible.

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xii. Trazar la absorbancia en microgramos de concentración de fenol.

Verifique cada curva periódicamente para garantizar la
reproducibilidad.
xiii. Reportar en el Sistema LIMS.

5.6. Análisis de data, cálculo y expresión de resultados

5.6.1 Cálculo de fenol (SM5530 B, C)
µg fenol=¿

µg fenol / L=
[ ]
A
B
x 1000 o [ ]
mg fenol / L=
A
B

Donde:
Abs = Absorbancia de muestra.
AbsBK = Absorbancia de blanco.
b = Intercepto.
m = Pendiente.
A = µg de fenol en la muestra, a partir de la curva de calibración.
B = mL de muestra original.

5.6.2 El software para el cálculo se valida según lo establecido en documento:

 Control de Datos.

6. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD
6.1. Controles de calidad para la determinación Fenol (SM 5530 B,C)
6.1.1 Se realiza un Blanco de Método (Blanco).
6.1.2 Se realiza un Estándar Control (STD).
6.1.3 Se realiza un Control de verificación de curva (CCV).
6.1.4 Se realiza una adición de muestra (Adi).
6.1.5 Se realiza un duplicado de adición de muestra (Dup. Adi).

6.2. Para más información revisar los documentos:

 Controles de Calidad para ensayos – Agua.

 Seguimiento de la Validez de Resultados.

6.3. Los controles de calidad serán registrados en el formato:

 Gráficos de Control.

7. CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD Y SALUD OCUPACIONAL

7.1. En el desarrollo del análisis utilizar mandil, guantes, respirador para ácidos,
gafas protectoras de manera obligatoria.
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7.2. Tener extrema precausion al momento de manipular el fenol ya que es
altamente toxico.

8. GESTIÓN DE RESIDUOS
Los desechos líquidos que se tenga luego del análisis de Fenol deben ser eliminados
en sus galones los cuales deben encontrarse etiquetados correctamente.

9. FORMATOS

Tiempo de Custodia –
Código Documento
Registros
Gráficas de control

Curva de Calibración

Valoración de Soluciones – Factor

10. REFERENCIAS
12.1 Control de Datos.
12.2 Instalaciones y Condiciones Ambientales
12.3 Control de Agua y Lavado de Materiales.
12.4 Manejo de la Balanza Analítica.
12.5 Manejo del Espectrofotómetro Ultravioleta – Visible.
12.6 Manual del medidor de pH - Electrodo de Ion Selectivo (ISE).
12.7 Controles de Calidad para ensayos – Agua.
12.8 Requisitos Mínimos para ensayos de muestras Ambientales - Suelos.
12.9 Seguimiento de la Validez de Resultados.
12.10 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 23 rd Edition,
2017.

11. ANEXO
Anexo N° 1 Diagrama de Flujo: Determinación de Fenol (5530 B,C)