Curso: Fisiología y Genética Bacteriana Semestre: 2020 - II

Prácticas
Contenido
Aislamiento de mutantes auxotróficos mediante luz ultravioleta. Test auxonográfico para identificación de
mutantes auxotroficos. Procesamiento de los datos obtenidos y presentación de informe.

1. Introducción

Competencias
1. Aisla mutantes auxotroficos de Escherichia coli mediante la luz ultravioleta con responsabilidad social.
2. Identifica el tipo de mutante auxotrofico de E. coli aislado con el procedimiento anterior mediante la
aplicación del test auxonografico con responsabilidad social.

2. Material y Método

Materiales

Metodología (Procedimiento)

Preparación de inóculo de E. coli

Realizar el mismo procedimiento para obtener el inóculo bacteriano en fase logarítmica media (práctica
anterior y Curva de supervivencia a la radiación UV).
Centrifugar
Lavar 2 veces
Estandarizar a una concentración del tubo 1 del nefelómetro de Macfarland con buffer fosfato 0.2N pH
68-7.2.

Obtención de mutantes
Tomar 1.5 mL de Inóculo bacteriano para obtención de mutantes y colocarlo en placas estériles. Llevar a
fuente de luz UV hasta alcanzar el 0.1% de sobrevivientes (práctica anterior, Tiempo: 25/27/28/29
seg. ( 0.1%)
De cada placa irradiada tomar 1mL, inocular en un tubo de ensayo que contenga 15mL de caldo nutritivo
e incubar a 37°C por 12 horas.
Proceder al lavado de las células por dos veces con buffer fosfato a 4 500 rpm por 15 minutos. Al
sedimento del segundo lavado agregar 5 mL de Caldo Mínimo de Davies, agregar la CMI de Ampicilina
(práctica correspondiente) e incubar a 37°C por 2 horas 30 minutos. Centrifugar y resuspender el
paquete celular con 5 mL de Caldo Nutritivo, incubar a 37°C por 6 horas. Repetir este procedimiento por
dos veces.
Hacer suspensión en buffer fosfato hasta alcanzar una concentración equivalente al tubo N° 1 del
nefelómetro de Mac Farland.
Hacer diluciones hasta 10-6 y sembrar por el método de camada 0.1 mL de las 2 últimas diluciones sobre
placas que contengan Agar nutritivo e incubar a 37°C por 24 horas.

Selección de mutantes (Técnica de siembra en Réplica en placa)

Seleccionar las placas con colonias aisladas y sembrar por la técnica de réplica en placas (explicación
en clase) que contengan agar nutritivo (AN) y agar mínimo de Davies (AMD) e incubar a 37°C por 24
horas.
 Las lecturas de los cultivos para ubicar posibles mutantes, se realizará comparando la posición de las
colonias en las placas de AN con las de AMD.
Replicar los mutantes seleccionados en agar nutritivo para el Test auxonográfico.
Lectura y criterio de selección
E. coli mutante auxotrofico :Colonia que crece en AN y no en AMD
E. coli no mutante auxotrofico :Colonia que crece en ambas placas

3.Resultados

Figura 1. Identificación de mutantes.

Placa 3 Placa 4

Identificación E.coli mutante

auxotrofico tre-
 CITAS BIBLIOGRÁFICAS

5. Referencias bibliográficas.
Orígen de las mutaciones y generación , aislamiento y análisis de mutantes en
bacterias. 2019. Enlace:
https://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/184337/mod_resource/content/1/Cla
se%208%20-%20Mutantes%20Analisis%20-%20CrispR%20-%20GB%202019.pdf

Anexos