UNIVERSIDAD NACIONAL

PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

CURSO:

Virología

DOCENTE:

Graciela Albino Cornejo

ALUMNOS:

 Alvarez Llontop Angelli Naomy

 Cajusol Sandoval Pamela
 De La Cruz Zuñiga Rogger Scott
 Guevara Bravo Anghelly Xiomara
 Martínez Romero Arnol Bryan
 Moreno Tafur Carlos

TEMA:

Titulación de Bacteriófagos

LAMBAYEQUE, agosto 2020

 I. INTRODUCCIÓN

Los virus pueden contarse por ensayos basados en su capacidad de infectar,

multiplicarse y producir progenie capaz de causar efectos citopáticos visibles, esto es,
en unidades infecciosas. La estimación del número de virus o unidades infecciosas
por unidad de volumen se conoce con el nombre de titulación.

Para titular un virus, primero hay que definir muy bien las lesiones que produce. Estas
lesiones pueden ser: lisis, fusión, agigantamiento, proliferación celular, etc. Uno de los
métodos más comunes y utilizados para la cuantificación de bacteriófagos es el
recuento de las Unidades Formadoras de Placa (UFP), este método se basa en la
detección macroscópica del ciclo lítico de un fago. Cuando se siembra un número
suficiente de bacterias sobre la superficie de un medio de agar nutritivo, estos forman
una capa uniforme después de algunas horas de incubación, pero si estas bacterias se
ponen en contacto con fagos, estos pueden desencadenar un ciclo lítico. Cada fago
presente en la muestra infecta una bacteria, se multiplica y libera varios centenares de
fagos nuevos.

Para titular un virus, primero hay que definir muy bien las lesiones que produce. Estas
lesiones pueden ser: lisis, fusión, agigantamiento, proliferación celular, etc. En el
método de las unidades formadoras de placa (UFP), varias monocapas celulares se
infectan con diluciones seriadas de la suspensión del virus. Después de una o dos horas
se cubre la monocapa con un medio semisólido. Allí donde un virus ha infectado a una
célula, aparece al cabo de 2-3 ciclos de infección una placa visible, resultante de la
infección de las células adyacentes a la inicialmente infectada. El medio semisólido
evita que las nuevas partículas virales se difundan por toda la monocapa. El título se
expresará en unidades formadoras de placa por mililitro (UFP/ml). Existe una relación
directa entre el número de virus en una suspensión inicial y el número de placas
resultante

II. OBJETIVOS
 Aprender el procedimiento de la titulación de bacteriófagos.

 Detectar y cuantificar el número de partículas víricas de una suspensión de

Bacteriófagos de Escherichia coli LE392.
III. MATERIALES

Material Biológico:

 bacteriófago lítico phiIPLA-RODI

 S. aureus IPLA1

Material de Laboratorio:

 Medio TSB
 Medio TSA
 tampón SM
 Pipetas
 Jeringas
 Mechero
 Estufa
 Placas de Petri
 Tubos de ensayo
 Matraz
 Asas bacteriológicas.
 Gradilla
 Contador de Colonias

IV. PROCEDIMIENTO

PROPAGACIÓN DEL BACTERIÓFAGO PHIIPLA-RODI EN MEDIO

SÓLIDO
La propagación del bacteriófago lítico phiIPLA-RODI se llevó a cabo utilizando
como cepa hospedadora S. aureus IPLA1 siguiendo los siguientes pasos:
1. Inicialmente, se reactivó la bacteria (S. aureus IPLA1) mediante un cultivo durante
una noche (o/n) de una colonia de esta cepa, previamente sembrada en placa, en
medio TSB (3 ml) e incubación a 37° en agitación.
 2. Una vez obtenido el cultivo, se tomaron 100 µl de la dilución 1:10 del mismo en
medio fresco y se añadieron a una placa con medio TSA (TSB+ 2% agar) junto a 100
µl de la suspensión fágica.
3. Posteriormente, se añadió una capa fina de TSB + 0,7% agar (3-5 ml) moviendo la
mezcla y dejando secar.
4. Una vez secas, las placas se incubaron a 37°C durante 16 h, tras las cuales se obtuvo
una lisis confluente o semiconfluente.
Este método de plaqueo de los fagos se denomina método de la doble capa. Con
objeto de recoger las partículas fágicas se añadieron 3,5 ml de TSB sobre la superficie
de cada placa y se dejó en agitación durante al menos 2 horas. Se recogió el
sobrenadante y se centrifugó a 9000 rpm durante 30 minutos para, posteriormente,
filtrar ese sobrenadante con filtros de 0,45 µm.
El filtrado se recogió bajo condiciones de esterilidad y se procedió a su titulación
(UFP/ml).

TITULACIÓN DEL BACTERIÓFAGO PHIIPLA-RODI

1. Para obtener el título del fago phiIPLA-RODI a partir del filtrado se realizaron
diluciones seriadas 1:10 en tampón SM (Tris hidrocloruro 1M pH 7,5, sulfato de
magnesio 1M, nitrato de calcio 1M, cloruro de sodio 5M) hasta la dilución 10-8.
2. A placas de TSA finas se añadieron 100 µl de las diluciones anteriores (solo se
utilizan desde la 10-5 hasta la 10-8) más 100 µl de la dilución 1:10 del cultivo o/n en
tampón RINGER.
3. Finalmente, se añadió una capa fina de TSB + 0,7% que se repartió en la superficie de
la placa.
4. Posteriormente, se incubaron a 37°C durante 18 h.
5. Se procedió al recuento de las placas de lisis en la dilución en la que aparecían
aisladas y su número se situaba entre 30 y 300 unidades formadoras de placa (UFP).
6. Seguidamente se calculó el título fágico, expresado como UFP/ml, mediante la
fórmula:
Para la determinación del número de unidades formadoras de placas de lisis, se
emplea la siguiente fórmula: 

V. RESULTADOS
Transcurridas las 24 horas, registrar el número de placas líticas en cada dilución y
calcular el número de unidades formadoras de placas por mililitro de muestra. Estas
tuvieron diferentes intensidades (visualizadas como transparencia del agar), según la
concentración de cada fago almacenado por separado tras el aislamiento.
 La suspensión fágica obtenida a partir de las placas que mostraron lisis confluente se
tituló por triplicado frente a la misma cepa. El resultado del contaje en la dilución 10-7
de los tres replicados fue 124 UFP/placa, 143 UFP/placa y 113 UFP/placa, siendo el
título fágico medio 1,2x1010 UFP/ml.
En el conteo y observación de las UFP, que se realizaron al tratamiento control con el
bacteriófago T4 y al tratamiento experimental de los bacteriófagos obtenidos a partir de
aguas residuales, se encontró que no existe una diferencia significativa (p>0.05) entre los
tratamientos, (Figura 1)

VI. CONCLUSIONES
Mediante la titulación del virus, nos
permite evaluar la capacidad infectante del
virus presente en una serie de diluciones.

VII. REFERENCIAS
Gutiérrez, D., Vandenheuvel, D., Martínez, B., Rodríguez, A. et al. (2015). Two phages,
phiIPLARODI and phiIPLA-C1C, lyse mono- and dual-species staphylococcal
biofilms. Applied and Environmental Microbiology, 81, 3336-3348.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4407228/
Ortega, k. y Salvador, H. (2011). Aislamiento y titulación de bacteriófagos de E. coli a partir
de Aguas Residuales. https://es.scribd.com/document/61405030/AISLAMIENTO-Y-
TITULACION-DE-FAGOS
Raúl, J., Puchades, Y. y Santiago, N. (2004). Los bacteriófagos en la biología molecular
pasada y actual. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnológica.
https://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/Muestras/chapter03.pdf