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biomedicinas
Artículo
Nanoestructura, autoensamblaje, propiedades mecánicas y
Actividad antioxidante de un hidrogel peptídico derivado de lupino
1,*
Rafael Pugliese , ana arnoldi
Cita: Pugliese, R.; Arnoldi, A.;
Lammi, C. Nanoestructura,
Autoensamblaje, propiedades mecánicas y
actividad antioxidante de un hidrogel peptídico
derivado de lupino.
Biomedicines 2021, 9, 294. https:// doi.org/
10.3390/biomedicines9030294
Editora Académica: María García-Díaz
Recibido: 25 febrero 2021
Aceptado: 10 de marzo de 2021
Publicado: 13 de marzo de 2021
Nota del editor: MDPI se mantiene neutral con
respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas
publicados y afiliación institucional
aciones.
Copyright: © 2021 por los autores.
Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza.
Este artículo es un artículo de acceso abierto
distribuido bajo los términos y
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Licencia de atribución (CC BY) (https://
creativecommons.org/licenses/by/
4.0/).
Biomedicinas 2021, 9, 294. https://doi.org/10.3390/biomedicines9030294
2
y Carmen Lammi 2,*
1
NeMO Lab, ASST Grande Ospedale Metropolitano Niguarda, 20162 Milán, Italia
2
Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Milán, 20133 Milán, Italia; anna.arnoldi@unimi.it
* Correspondencia: raffaele.pugliese@nemolab.it (RP); carmen.lammi@unimi.it (CL)
Resumen: Los péptidos alimentarios naturales se utilizan con frecuencia en las ciencias de la vida debido a sus
efectos beneficiosos a través de su impacto en rutas bioquímicas específicas. Además, a menudo se aprovechan
para aplicaciones en áreas tan diversas como la bioingeniería, la medicina, la agricultura e incluso la moda. Sin
embargo, el progreso hacia la comprensión de sus propiedades de autoensamblaje como materiales funcionales
a menudo se ve obstaculizado por sus largas secuencias enriquecidas con residuos aromáticos y cargados
cifradas en la secuencia de la proteína original. En este estudio, aclaramos la nanoestructura y la propensión de
autoensamblaje jerárquico de un péptido derivado de lupino que pertenece a la ÿ-conglutina (globulina 11S,
proteína similar a la leguminosa), con una metodología sencilla basada en etiquetas de oligoglicina biotinilada N-
terminal. para controlar las nanoestructuras, la biomecánica y las características biológicas.
Se realizó una caracterización exhaustiva mediante espectroscopía de dicroísmo circular (CD), espectroscopía
infrarroja en forma de transformada de Fourier (FT-IR), mediciones reológicas y análisis de microscopía de
fuerza atómica (AFM). Mediante el uso de la etiqueta de biotina, obtuvimos un hidrogel de péptido derivado de
lupino tixotrópico (denominado BT13) con propiedades mecánicas ajustables (de 2 a 11 kPa), sin afectar su
formación espontánea de estructuras secundarias de hoja ÿ. Por último, demostramos que este hidrogel tiene
actividad antioxidante. En conjunto, nuestros hallazgos abordan múltiples desafíos asociados con el desarrollo
de hidrogeles basados en péptidos alimentarios de origen natural, lo que ofrece una nueva herramienta para
ajustar las propiedades mecánicas y adaptar las actividades antioxidantes, proporcionando nuevas direcciones
de investigación en química, bioquímica y bioingeniería de alimentos. .
Palabras clave: péptidos autoensamblables; hidrogeles supramoleculares; nanonutracéuticos; reología;
péptidos de lupino; actividad antioxidante; bioactividad; propiedades mecánicas
1. Introducción
Las proteínas de los alimentos no solo suministran nutrientes, sino que también brindan numerosos
efectos beneficiosos a través de su impacto en rutas bioquímicas específicas. La mayoría de estas
actividades se deben a los péptidos encriptados en las secuencias de proteínas originales, que se
administran mediante la digestión, se absorben intactos en las células intestinales y se transportan a los
órganos diana donde ejercen su actividad biológica [1,2]. A lo largo de los años, se han identificado
numerosos péptidos bioactivos en hidrolizados de proteínas de diversos alimentos [3].
En este contexto, el lupino es una leguminosa de grano perteneciente a la familia Fabaceae, cuyas
aplicaciones alimentarias han mejorado durante las últimas dos décadas debido al contenido proteico
que oscila entre el 35% y el 40%, y la falta de variedades genéticamente modificadas disponibles
comercialmente. Muchos estudios in vitro, in vivo y en humanos han resaltado los beneficios para la
salud del consumo de proteína de lupino [4–7]. En particular, la hidrólisis de proteínas de lupino
utilizando tripsina generó una mezcla compuesta por alrededor de 3000 péptidos diferentes, que fueron
identificados mediante análisis peptidómico [4]. Las investigaciones bioquímicas y celulares revelaron
sus actividades hipocolesterolémicas e hipoglucémicas [4,8,9]. Los experimentos de transporte
transepitelial realizados utilizando un modelo diferenciado de células Caco-2 indicaron que solo once
péptidos trípticos pueden atravesar las células intestinales [10].
https://www.mdpi.com/journal/biomedicines
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Biomedicinas 2021, 9, 294 2 de 11

Entre los péptidos absorbidos, el LNALEPDNTVQSEAGTIETWNPK (denominado T13) destaca

por sus interesantes propiedades estructurales [11]. De hecho, T13, que se compone de 23
aminoácidos, pertenece a la ÿ-conglutina (globulina 11S, proteína similar a la leguminosa), que es
una globulina de lupino que ejerce la función de una proteína de almacenamiento de semillas (Figura
S1). Muestra un pI igual a 3,58, una carga neta de ÿ3 y una hidrofobicidad teórica igual a +26,02 kcal * molÿ1 .
Además, su modelo computacional fue creado mediante técnicas de modelado por homología y el alto
porcentaje de homología de secuencia encontrado con la plantilla empleada, la proglicinina de soja (código
PDB 1UCX), permitió lograr un modelo de calidad razonable, respaldado adicionalmente por dinámica
molecular (MD), lo que sugiere que T13 tenía la forma de una horquilla ÿ [11].

Dada su peculiaridad de organizarse espontáneamente en estructuras de horquilla ÿ ordenadas,

pensamos que era un candidato prometedor capaz de crear nanoestructuras adecuadas para las ciencias
de la vida [12], para enfermedades metabólicas [13], para cultivo celular [14] o como nanohumectante para
la cicatrización de heridas [15] o el cuidado de la piel [16]. Sin embargo, a pesar de las estructuras
secundarias de horquilla ÿ que pueden estar involucradas en el fenómeno de autoensamblaje de los
materiales basados en proteínas, la aplicación práctica de este péptido T13 está limitada debido a su
inestabilidad intrínseca en solución, bajo rendimiento y bajas características biomecánicas.
Dado que la biotina, compuesta por anillos de ureido y tetrahidrotiofeno fusionados
lateralmente y por una cadena de valerilo, demostró facilitar y estabilizar las nanofibras peptídicas
de autoensamblaje (SAP) [17–19] sin alterar su biocompatibilidad, agregamos al péptido T13 un
N terminal biotinilado Etiqueta de oligoglicina para fomentar su propensión al autoensamblaje y
mejorar sus propiedades biomecánicas (Figura S2).
Está bien establecido que la estructura química de la biotina posee la capacidad de formar enlaces H
y contactos hidrofóbicos a través del anillo de ureido y el anillo de tetrahidrotiofeno, respectivamente. De
hecho, mediante el uso de simulaciones de Dinámica Molecular (MD) se demostró que la concomitancia de
tales interacciones juega un papel clave en la formación de redes densas de enlaces H y de una "pared
hidrofóbica" que desencadena sinérgicamente una transición de desorden a orden en SAP. moléculas que
contienen tapa de biotina N-terminal [20]. Saracino y Gelain demostraron empíricamente que la presencia
de una etiqueta N-terminal de biotina en el péptido guía de la médula ósea (BMHP-1) que evoluciona hacia
láminas ÿ estructuradas contra los agregados globulares, estaba formada por los mismos péptidos no
biotinilados [20]. Además, como se observó experimentalmente, los autores señalaron que la biotina apoya
significativamente el autoensamblaje jerárquico en estructuras ordenadas de hojas ÿ y mejora la biomecánica
de los andamios finales [17,18]. Jekhmane et al. también informaron que mediante el uso de RMN de estado
sólido, el grado de ensamblaje, la mecánica y la homogeneidad de los andamios biotinilados se correlacionan
con un comportamiento favorable de las células madre neurales [19]. En otro esfuerzo, Davis et al. diseñó
nanofibras peptídicas biotiniladas para la administración prolongada del factor de crecimiento similar a la
insulina 1 (IGF-1) para mejorar la terapia celular para el infarto de miocardio [21].

Aquí, utilizando la ventaja de la etiqueta de biotina, obtuvimos un hidrogel peptídico derivado

de lupino tixotrópico (llamado BT13) con propiedades mecánicas ajustables. Las estructuras
secundarias , la biomecánica y las morfologías de nanoestructuras del hidrogel T13 y BT13 se
caracterizaron ampliamente mediante espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FT-IR),
dicroísmo circular (CD), reología de tensión oscilatoria y microscopía de fuerza atómica (AFM).
Finalmente, demostramos por primera vez la actividad antioxidante de un hidrogel peptídico
derivado de alimentos. Para lograr este objetivo, se utilizó el ensayo de 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo-
hidrato (DPPH) . El ensayo de barrido de radicales DPPH es uno de los procedimientos
antioxidantes más utilizados basados en la transferencia de un solo electrón, debido a su facilidad
de ejecución, rapidez, potencial de automatización, reproducibilidad y facilidad de uso a temperatura ambie
Este estudio puede facilitar el desarrollo de materiales basados en péptidos
naturales con propiedades biomecánicas y biológicas controladas y ajustables, y ampliar
el número de aplicaciones de hidrogeles peptídicos autoensamblables y nanonutracéuticos.
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2. Materiales y métodos
2.1. Materiales

Todos los reactivos y disolventes utilizados para las caracterizaciones de péptidos y la experiencia in vitro .
Los ingredientes se adquirieron de fuentes comerciales y se usaron sin purificación adicional.

2.2. Preparación de péptidos

Los péptidos se adquirieron de GenScript Biotech Corporation (Piscataway, NJ, EE. UU.). La pureza de
los péptidos liofilizados (>95 %) se analizó mediante HPLC binaria y mediante espectrometría de masas Agilent
6520 LCMS (Figura S3). Los péptidos liofilizados se disolvieron al 0,5 %, 1 %, 3 % y 5 % (p/v) en agua destilada
(GIBCO® Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y luego se almacenaron a +4 ÿC durante la noche
antes de su uso . . Para la preparación del hidrogel, se añadió gota a gota solución salina tamponada con
fosfato de Dulbecco (DPBS) 1X (sin Ca2+/Mg2+) a la muestra de péptido (100 µl) y se agitó vigorosamente
durante 5 min.

2.3. Ensayo de espectroscopia de tioflavina T (ThT)

Se realizó el análisis ThT de péptidos para evaluar la presencia de estructuras de fibrillas amiloidogénicas.
Las muestras de péptidos (40 µM) se mezclaron con la solución de ThT (20 µM) y se agitaron durante 4 min,
como se informó anteriormente [24]. La intensidad de fluorescencia de ThT se registró utilizando un lector de
placas Synergy (Biotek, Bad, Friedrichshall, Alemania) con ÿex = 440 nm (paso de banda de 5 nm) y ÿem =
482 nm (paso de banda de 10 nm), durante 60 s a 25 ÿC. Las mediciones se normalizaron sobre la fluorescencia
de ThT solo y se procesaron con el software OriginLab™ 8.

2.4. Espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR)

Los espectros FT-IR de los péptidos se obtuvieron en reflexión total atenuada (ATR) usando un
espectrómetro PerkinElmer Spectrum 100. Se registraron veinte adquisiciones para cada espectro,
utilizando las siguientes condiciones: resolución de espectro de 4 cmÿ1 , velocidad de exploración de 25
kHz, coadición de 1000 exploraciones y apodización triangular. Todos los espectros obtenidos se
informaron después de la corrección ATR, el suavizado y la corrección automática de la línea de base
utilizando el software Origin™ 8.

2.5. Espectroscopía de dicroísmo circular (CD)

Los espectros de CD de los péptidos se registraron en un espectropolarímetro Jasco J-815 (Jasco Corp.,
Tokio, Japón) utilizando una cubeta de cuarzo de 0,1 mm, como se informó anteriormente [25]. Los espectros
se recolectaron en el rango espectral de 180 a 300 nm y se promediaron en tres escaneos a temperatura
ambiente. Todos los escaneos se realizaron a una velocidad de escaneo de 50 nm/min, con un ancho de banda
de 1 nm y parámetros de tiempo de respuesta establecidos en 2 s. Se registró un espectro de referencia de
agua destilada y se restó de cada espectro. La estimación de la estructura secundaria del péptido se logró
utilizando un método quimiométrico (http://bestsel.elte.hu/index. php). Todos los espectros obtenidos se
informaron utilizando el software Origin™ 8.

2.6. Pruebas mecánicas

Las propiedades reológicas de los péptidos se llevaron a cabo usando un reómetro Kinexus DSR
controlado por tensión/velocidad (Netzsch, Selb, Alemania) equipado con una geometría de placas paralelas
(diámetro acrílico 20 mm; separación 34 µm). Todas las medidas se obtuvieron a 25 ÿC usando una celda
Peltier en la placa inferior del instrumento para controlar la temperatura durante cada prueba. Se realizaron
experimentos de barrido de deformación en muestras de 0,1 % a 1000 % de deformación para determinar el
límite del régimen viscoelástico lineal (LVR). Para evaluar el aumento de los módulos de almacenamiento (G')
y pérdida (G”), se registraron experimentos de barrido de frecuencia en función de la frecuencia angular (0,1–
100 Hz) a una deformación fija del 1 %. Para probar la tixotropía de los péptidos, se realizaron pruebas de
adelgazamiento por cizallamiento mediante una serie de pruebas de retención de picos en las que las
velocidades de cizallamiento se mantuvieron constantes, como se informó anteriormente [26]. Brevemente, en
primer lugar se aplicó una tasa de corte de 0,01 s-1 durante 60 s, y luego se aplicó una tasa de corte de 5,3
s-1 durante 20 s, para simular la tasa de corte dentro del cilindro de una jeringa. Posteriormente, se aplicó una
alta velocidad de cizallamiento de 1000 sÿ1 durante 20 s para simular la inyección de purga de la solución. Posteriorment
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Se aplicaron de nuevo 5,3 sÿ1 (20 s), imitando así el flujo de solución peptídica que sale de la aguja. Por
último, se utilizó una velocidad de cizallamiento de 0,01 sÿ1 para simular la condición de bajo
cizallamiento de la solución durante la inyección. Cada experimento se realizó por triplicado y los datos
se procesaron con el software Origin™ 8.

2.7. Microscopía de fuerza atómica (AFM)

Las mediciones de AFM se capturaron en modo tapping utilizando un sistema Tosca (Anton
Paar, Graz, Austria) utilizando sondas voladizas de silicio de haz único. Las imágenes de AFM se
tomaron depositando soluciones de 5 µl (concentración final de 0,01 % p/v) sobre mica recién escindida.
Las muestras se mantuvieron sobre la mica durante 5 min; posteriormente se enjuagaron con
agua destilada para eliminar los péptidos sueltos y luego se secaron en condiciones ambientales
durante 24 h. El análisis de parámetros morfológicos de los datos de AFM se realizó utilizando el
software de código abierto basado en Matlab FiberApp.

2.8. Ensayo de 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) El

ensayo de DPPH para determinar la actividad antioxidante se realizó mediante un método estándar
con algunas ligeras modificaciones [27]. Los hidrogeles BT13 (0,5 %, 1 % y 3 % p/v) y RADA16 (1 % p/v)
se depositaron en una placa de media área de 96 pocillos, respectivamente. La reacción de barrido de
radicales DPPH se realizó añadiendo 40 µL de solución de DPPH en la oscuridad a temperatura ambiente,
y la absorbancia se midió a 520 nm después de 30 min de incubación utilizando el lector de placas Synergy
H1.

2.9. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba
post hoc de Tukey (GraphPad Prism 8). Los valores se expresaron como medias ± DE; Los valores de p
< 0,05 se consideraron significativos.

3. Resultados y discusión

3.1. Organización supramolecular de hidrogel derivado de lupino

Para obtener información sobre la disposición supramolecular y global del péptido BT13
después de la etiqueta de biotina, utilizamos dicroísmo circular (CD), espectroscopia FT-IR, ensayo
de unión a tioflavina-T (ThT) y análisis morfológico de microscopía de fuerza atómica (AFM). .
Para explorar el efecto de la etiqueta de biotina en la conformación de la estructura secundaria
de los ensamblajes BT13 , se registraron espectros de CD en la región ultravioleta lejana de 180 a
300 nm (Figura 1a). Como era de esperar, para el péptido T13 (en azul) se observó un efecto Cotton
positivo y negativo a 198 nm y 215 nm, respectivamente, característico de las señales de la hoja ÿ.
Los espectros de CD para el péptido BT13 (en rojo) mostraron un pico mínimo a 215 nm y un pico
máximo más pronunciado a 195 nm, lo que indica conjuntos ricos en hojas ÿ altamente ordenados [28].
Para explorar más a fondo la disposición estructural de ambos péptidos en solución, llevamos a cabo
pruebas de espectroscopia FT-IR (Figura 1b). El péptido T13 mostró un pico amplio a 1623 cmÿ1
, ylaun
característico de conformación de horquilla
pico de estiramiento ÿ [29].aPor
inferior 1532 cmÿ1, BT13
el contrario, los espectros
exhibieronFT-IR del péptido
una banda de
amida I nítida en 1623 cm-1 con un hombro en 1695 cm-1 , lo que indica predominantemente
características de hoja ÿ antiparalelas, típicas de los hidrogeles basados
1532 cm-1 en laen SAP de
región [30,31]. . La IIbanda
la amida a
también
confirmó la agregación de la hoja ÿ del péptido BT13, de acuerdo con el análisis de espectros de CD.
Estos cambios en los picos de absorción de FT-IR pueden reflejar el efecto de la etiqueta de
oligoglicina biotinilada en los ensamblajes de BT13 que estabilizan las estructuras secundarias de la
hoja ÿ de BT13, fomentando así su propensión al autoensamblaje.

Dado que la estructura de la hoja ÿ es característica de las fibras de tipo amiloide, que están bien
establecidas como uno de los motivos funcionales básicos de las moléculas peptídicas de autoensamblaje
[32], examinamos este comportamiento en el péptido BT13 utilizando la tioflavina-T (ThT ) ensayo de
unión, un tinte fluorescente específico de amiloide [33,34]. La tinción de la muestra de péptido BT13 con
ThT resultó en altos niveles de fluorescencia en comparación con el péptido T13 (Figura 1c), con un típico
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2021, 9, x PARA Google POR PARES 5 de 12

Biomedicinas 2021, 9, 294 [32], examinamos este comportamiento en el péptido BT13 utilizando el ensayo de unión de tioflavina- 5 de 11
T (ThT), un colorante fluorescente específico de amiloide [33,34]. La tinción de la muestra de péptido
BT13 con ThT resultó en altos niveles de fluorescencia en comparación con el péptido T13 (Figura
1c), con una señal de emisión de unión a amiloide típica (centrada en 490 nm), estableciendo su
señal de emisión
amiloide amiloidede unión
rica a amiloide
en hojas rica en
ÿ , similar hojaspéptidos
a otros ÿ ( centrado a 490 nm), estableciendo
autoensamblados encontradossu
ennaturaleza
la literatura [35–
como
40]. la naturaleza, similar a otros péptidos de autoensamblaje encontrados en la literatura [35–40].

Figura 1. Organización
supramolecular supramolecular
de soluciones deT13
de péptidos soluciones
y BT13.de
(a)péptidos T13
Dicroísmo y BT13.
circular (a) Dicroísmo circular Figura 1. Organización
(CD)
(CD)ÿespectros
hoja espectrosde
deT13
T13(en
(enazul)
azul)yyBT13
BT13(en
(enrojo)
rojo)que
quesugieren
sugierenlalapresencia
presenciade
deestructuras
estructurassecundarias
secundariasde
de hoja ÿ.
turas (b) espectros FT-IR de péptidos T13 y BT13 con una conformación de horquilla ÿ característica para (b) espectros FT-
IR de péptidos T13 y BT13 con una conformación de horquilla ÿ característica para T13, y
T13 y conformación típica de hoja ÿ antiparalela para el péptido BT13. ( c ) Ensayo de unión a ThT de la conformación de
hoja ÿ antiparalela típica de T13 para el péptido BT13. ( c ) Ensayo de unión a ThT de T13 y BT13
y péptidos BT13, mostrando una señal de emisión de unión a amiloide alta (centrada en 490 nm) de péptidos BT13,
mostrando una señal de emisión de unión a amiloide alta (centrada en 490 nm) de BT13 en comparación con
en comparación con el péptido T13.
péptido T13.
Finalmente, buscamos investigar las nanoestructuras de los péptidos T13 y BT13 por Finalmente,
buscamos investigar las nanoestructuras de los péptidos T13 y BT13 por
AFM, que permite el examen de la distribución de fibras de los conjuntos (Figura AFM, que permite el
examen
2a, b). Elde la distribución
péptido de nanovarillas
T13 produjo fibras de loscortas
conjuntos (Figura
con una altura2a,b).
de 1,4 ± 0,5 nm. Por el contrario, el péptido
T13
a la dirigido
formaciónporde
BT13
una produjo nanobarrasmás
red de nanofibras cortas con
larga unapaquetes
y de altura deagrupados
1,4 ± 0,5 nm. Por el contrario,
en comparación conBT13
T13 acondujo
la a
formación
soluciones depeptídicas.
una red de nanofibras másel
Sin embargo, larga y de paquetes
análisis agrupados
morfométrico mostróenque
comparación conlas
la altura de T13soluciones
peptídicas
permaneció decasi
fibras
sin BT13 . Sin
cambios embargo,
(2,5 el análisis
± 0,33 nm). morfométrico
Es interesante mostró
observar queque la altura
las fibras de las fibras BT13
BT13
permanecieron casi sin cambios
muestran una distribución (2,5 ± en
más orientada 0,33 nm). Es interesante
comparación observar
con el péptido que las2c,d),
T13 (Figura fibras BT13
que muestra una
distribución
probablemente másdebido
orientada
a laen comparación
presencia de una con el péptido
etiqueta T13 (Figura
de biotina 2c,d), que
N-terminal, que (1)
es favorece el ensamblaje,
probablemente debido a la presencia de una etiqueta de biotina N-terminal, que (1) favorece Biomedicines
y (2) desencadena una transición de desorden a orden entre los paquetes de péptidos, como anteriormente el ensamblaje,
2021,
9, x FOR PEER REVIEW 6 of 12 y (2) desencadena una transición de desorden a orden entre los paquetes de péptidos, como anteriormente
reportado [41].
reportado [41].

Figura 2. Organización
Organización morfológica
morfológica de nanoestructuras
de las nanoestructuras peptídicas
peptídicas T13 y fuerza
T13 y BT13. BT13. Fuerza
atómicaatómica mi Figura 2.
imágenes de croscopia de (a) T13 y (b) péptidos BT13. Distribución de orientación de ( c ) T13 y ( d ) imágenes de
microscopía BT13 de ( a ) péptidos T13 y ( b ) BT13. Distribución de orientación de (c) T13 y (d) BT13
péptidos que muestran que la etiqueta de biotina N-terminal desencadena una transición de desorden a orden en BT13
péptidos que muestran que la etiqueta de biotina N-terminal desencadena una transición de desorden a orden en BT13
Ensambles. Barra de escala, 500
nm. Ensambles. Barra de escala, 500 nm.

3.2. Propiedades mecánicas del hidrogel derivado de lupino

Se realizaron estudios reológicos para comprender el papel de la biotina en las propiedades mecánicas
del hidrogel BT13.
Las mediciones reológicas de los módulos de almacenamiento G' y pérdida G'' son comunes.
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Biomedicinas 2021, 9, 294 6 de 11

3.2. Propiedades mecánicas del hidrogel derivado de lupino

Se realizaron estudios reológicos para comprender el papel de la biotina en la mecánica

propiedades del hidrogel BT13.
Las mediciones reológicas de los módulos de almacenamiento (G') y pérdida (G”) son comúnmente
utilizado para caracterizar las propiedades viscoelásticas y mecánicas de los hidrogeles [42]. Aquí, G'
refleja la rigidez, mientras que G” representa la energía disipada durante la prueba oscilatoria
y se correlaciona con la respuesta similar a un líquido del hidrogel. La relación entre G' y G”
(es decir, tanÿ) proporciona información sobre el perfil viscoelástico, es decir, si un material se comporta
como un sólido elástico (G' > G”, tanÿ < 1) o como un líquido viscoso (G' < G”, tanÿ > 1). Usualmente,
en los SAP ricos en hojas ÿ después del autoensamblaje, las interacciones entre las fibras ensambladas conducen a la
formación de una red nanofibrosa entrelazada y aumento de los valores de G' [37].
Primero, llevamos a cabo experimentos de barrido de deformación para investigar la viscoelástica lineal
(LVR) de ambos péptidos (Figura S4). A continuación, investigamos los módulos G' y G” como
una función de la frecuencia angular (1–100 Hz, tensión fija 1% dentro del LVR) a diferentes
concentraciones (0,5 %, 1 % y 3 % p/v) de los péptidos T13 y BT13 (Figura 3). Él
Los datos de barrido de frecuencia de ambos péptidos sugirieron que G' y G” son independientes de
frecuencia aplicada, que muestra un comportamiento predominantemente elástico (G', puntos completos) relativa
al componente viscoso (G”, puntos vacíos). Sin embargo, el péptido T13, debido a su intrínseco
inestabilidad en solución, mostró bajas características biomecánicas con valores de G' que van desde
1 a 10 Pa, lo que implica una tendencia más débil a ensamblarse (Figura 3a), como se informó anteriormente
en el análisis AFM. Por el contrario, los ensamblajes formados por el péptido BT13 exhibieron un aumento
propiedades mecánicas en función de la concentración de péptidos con valores G' de 2 kPa (para
0,5 %),
Biomedicines 2021, 9, x PARA REVISIÓN POR PARES 4,5 kPa (para el 1 %) y 11 kPa (para el 3 %) (Figura 3b), lo que indica la formación de7 de 12
geles ensamblados más rígidos en comparación con el péptido T13 (Figura 3c).

Figura
Figura3.3.Estudios
Estudiosreológicos
reológicospara
paraevaluar
evaluarlas
laspropiedades
propiedadesmecánicas
mecánicasdedelos
loshidrogeles
hidrogelesBT13.
BT13.Frequen
Reología oscilatoria
dependiente de la frecuencia (0,1–100 Hz) de (a) T13 y (b) péptidos BT13 al 0,5 %, 1 % y reología oscilatoria dependiente
(0,1–100 Hz) de (a) T13 y (b) BT13 péptidos al 0,5%, 1% y 3%
3% (p/v). (c) Valores medios de almacenamiento (G') y módulos de pérdida (G'') de péptidos T13 y BT13 al
0,5y%
1% (p/v).
3% ( c( )dValores
(p/v). ) Pruebapromedio de almacenamiento
de tixotropía (G ')y y módulos de pérdida (G ") de péptidos T13 y BT13 al 0.5%, 1%,
del hidrogel BT13.
3% (p/v). ( d ) Prueba de tixotropía del hidrogel BT13.
Este aumento notable en el módulo de almacenamiento de BT13 probablemente se deba a la
presencia de biotina, que fomenta la propensión al autoensamblaje, lo que aumenta las interacciones
no covalentes entre los paquetes de péptidos ricos en hojas ÿ, lo que lleva a la formación de una
red nanofibrosa entrelazada y estable. , de acuerdo con el análisis AFM.
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Este aumento notable en el módulo de almacenamiento de BT13 probablemente se deba a la

presencia de biotina, que fomenta la propensión al autoensamblaje, lo que aumenta las interacciones
no covalentes entre los paquetes de péptidos ricos en hojas ÿ, lo que lleva a la formación de una red
nanofibrosa entrelazada y estable. , de acuerdo con el análisis AFM.
Cabe señalar que por encima del 5% (p/v), el péptido BT13 se vuelve demasiado viscoso y ya
no es soluble en agua, lo que probablemente se deba a su alto peso molecular (2753,01 g*molÿ1 ). A
pesar de la concentración crítica de gelificación (CGC) de BT13 al 5 % (p/v), la presencia de este
péptido mejoró las propiedades mecánicas a bajas concentraciones, lo que es deseable para
aplicaciones biomédicas además de ser más rentable y teóricamente más citocompatible.

Como siguiente paso, dado que los hidrogeles inyectables han ganado cada vez más atención
en los campos de la biomedicina y la bioimpresión, y en la administración de fármacos, células,
biomoléculas y factores de crecimiento debido a su método de administración mínimamente invasivo
[43], para Para evaluar la propensión del hidrogel basado en BT13 a recuperar su viscosidad inicial
después de la inyección, realizamos pruebas de tixotropía. En esta prueba, las condiciones de
inyección se simularon a través de una serie de pruebas de velocidad de corte constante (consulte
Materiales y métodos para obtener más detalles). Observamos que la viscosidad de BT13 disminuyó
y casi volvió a los valores originales, respectivamente, durante y después de la inyección. Esta rápida
recuperación de la viscosidad sugiere la capacidad de BT13 para retener la red tridimensional después
de la conversión gel-sol-gel , en particular en hidrogeles tixotrópicos basados en SAP.

3.3. Propiedad antioxidante intrínseca del hidrogel derivado de lupino

Para evaluar la propiedad antioxidante intrínseca del hidrogel BT13 (0,5 %, 1 % y 3 % p/
v), se utilizó el ensayo DPPH. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando RADA16 (1% p/
v) como referencia, ya que es un hidrogel basado en SAP bien conocido y ampliamente
caracterizado [44]. Los resultados destacaron claramente que BT13 muestra una actividad
antioxidante intrínseca, que aumenta según la concentración. Por el contrario, RADA16 es
completamente ineficaz. En detalle, BT13 eliminó los radicales DPPH en 10,6 % ± 3,3 %,
32,6 % ± 8,7 % (p < 0,5) y 71,5 % ± 8,2 % (p < 0,001) al 0,5 %, 1 % y 3 % (w/ v),
respectivamente (Figura 4). El análisis estadístico indicó que no se observó una diferencia
significativa entre el 0,5 % y el 1 % de BT13, mientras que se observó una diferencia
significativa cuando se probó BT13 al 3 %.
Una proyección preliminar de la estructura T13 usando BIOPEP (www.uwm.edu.pI/ bioquimia)
sugirió que podría ser un péptido bioactivo (Tabla 1). De hecho, T13 en solución simple redujo el
DPPH radical en un 29,2 % ± 1,4 % y un 34,6 % ± 3,2 % al 0,5 % y al 1 %, respectivamente (Figura
S5), lo que confirma la detección de BIOPEP. Además, este resultado destaca el hecho de que la
propiedad antioxidante de BT13 es intrínseca a su secuencia peptídica. De hecho, dentro de su
secuencia ya se han reportado algunos motivos bioactivos como antioxidantes e inhibidores de las
enzimas ACE, alfa-glucosidasa y DPP-IV, respectivamente. En particular, como se informa en la Tabla
1, el motivo Thr-Trp (TW), que se encuentra dentro de la secuencia T13, muestra actividad antioxidante,
ya que actúa como un eliminador de radicales [45]. La presencia de algunos residuos de aminoácidos
antioxidantes como Tyr, Trp, Cys y Met con capacidad donadora de electrones/hidrógeno es un factor
determinante para las actividades de eliminación de radicales de los péptidos. En general, se ha
informado que los dipéptidos que contienen Tyr y Trp con residuos Tyr/Trp en el extremo N-terminal
mostraron actividades antioxidantes más fuertes que en el extremo C-terminal, y que el residuo vecino
también afectó sus actividades por efecto estérico. hidrofobicidad y enlaces de hidrógeno, entre otros
[45]. Con base en esta consideración y en la predicción in silico de la estructura secundaria de T13
[11], es razonable afirmar que el motivo TW de BT13 puede actuar como un marcador antioxidante
funcional (presumiblemente debido a su exposición óptima a un ambiente acuoso), haciendo que el
hidrogel basado en BT13 sea intrínsecamente antioxidante.
Además, la contribución de la biotina a la actividad antioxidante del hidrogel BT13 podría considerarse
irrelevante. De hecho, Turnaturi et al. demostró claramente que la biotina no es efectiva en la actividad in
vitro de eliminación de radicales libres [46].
Machine Translated by Google que aumenta según la concentración. Por el contrario, RADA16 es completamente ineficaz. En detalle, BT13
eliminó los radicales DPPH en un 10,6 % ± 3,3 %, 32,6 % ± 8,7 % (p
< 0,5) y 71,5 % ± 8,2 % (p < 0,001) al 0,5 %, 1 % y 3 % (p/v), respectivamente (Figura 4).
El análisis estadístico indicó que no se observó una diferencia significativa entre el 0,5 %
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y 1% de BT13, mientras que se observó una diferencia significativa cuando se probó BT13 al 3%.

Figura 4.Evaluación
Figura 4. Evaluacióndeldel poder
poder antioxidante
antioxidante in de
in vitro vitro de mediante
BT13 BT13 mediante ensayoLos
ensayo DPPH. DPPH.
puntosLos puntos
de datos de datos representan
representan
las medias
las medias ±± DE
SD de
de cuatro
cuatro experimentos
experimentos independientes
independientes por
por triplicado.
triplicado. Los
Los datos
datos se
fueron analizados
analizaron estadísticamente por
estadísticamente
mediante
ANOVA no ANOVA unidireccional
unidireccional seguidoseguido de la prueba
de la prueba post-hoc
post-hoc de Tukey.
de Tukey. (*) p < (*)
0,5;p (**)
< 0,5;
p <(**)
0,1;p (***)
< 0,1;p (***) p < 0,001.
< 0,001. ns: no ns:
significativo; C: muestra de control.
significativo; C: muestra de control.

TablaUna
1. Cribado de lapreliminar
exploración actividad de
T13lautilizando
estructuralaT13
base de datos
utilizando la BIOPEP (www.uwm.edu.pI/biochemia).
secuencia peptídica BIOPEP: T13
LNALEPDNTVQSEAGTIETWNPK.
(www.uwm.edu.pI/biochemia) sugirió que podría ser un péptido bioactivo (Tabla 1).
De hecho, T13 en solución simple redujo el radical DPPH en un 29,2 % ± 1,4 % y en un 34,6 % ± 3,2 %
Actividad Sequence Motif
al 0,5 % y 1 %, respectivamente (Figura S5), lo que confirma el cribado de BIOPEP. Además, AG
este resultado destaca el hecho de que la propiedad antioxidante de BT13 es intrínseca a su pep GT
secuencia de mareas De hecho, dentro de su secuencia ya se han descrito algunos motivos bioactivos. ES DECIR

inhibidor deelainhibidores
portados como antioxidantes ECA de las enzimas ACE, alfa-glucosidasa y DPP-IV, LN
respectivamente. En particular, como se informa en la Tabla 1, el motivo Thr-Trp (TW),
EE. UU. que se encuentra
dentro de la secuencia T13, muestra actividad antioxidante, ya que actúa como ALEP
un eliminador de radicales [45]. Él
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presencia de algunos residuos de aminoácidos antioxidantes como Tyr, Trp, Cys y Met con
notario público

La capacidad donadora de electrones/hidrógeno es un factor determinante para las actividades de eliminación

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de radicales de los péptidos. En general, se ha informado que Tyr- y Trp-que contienen

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los péptidos con residuos de Tyr/Trp en el extremo N-terminal mostraron actividades
AG antioxidantes más fuertes
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hora del Este

inhibidor de DPP-IV LN
N/A
Nuevo Testamento

PAQUETE

QS
TW
WQ
TI
Inhibidor de la TW
EE. UU.
alfa-glucosidasa antioxidante ECA:

enzima convertidora de angiotensina; DPP-IV: dipeptidil peptidasa-IV.

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4. Conclusiones

En resumen, reportamos la nanoestructura y la propensión al autoensamblaje jerárquico.

de un péptido derivado del lupino perteneciente a la ÿ-conglutina, a través de una etiqueta N-terminal de biotina.
Mediante el uso de espectroscopía de CD, espectroscopía de FT-IR, ensayo de unión a ThT y
análisis de AFM , fue posible establecer que la etiqueta de biotina (1) favorece la formación de
nanoestructuras ordenadas con una típica naturaleza amiloide rica en hojas ÿ, y (2) desencadena una
distribución de nanofibras más orientada en comparación con el péptido no biotinilado.
Además, obtuvimos un hidrogel peptídico tixotrópico derivado del lupino con propiedades
mecánicas ajustables, lo que lo convirtió en un candidato prometedor para futuras aplicaciones como
andamio inyectable para biomedicina, bioimpresión o suministro de fármacos/células.
Por último, demostramos por primera vez que este hidrogel de origen natural tiene una actividad antioxidante
intrínseca, útil para los trastornos metabólicos o como aditivo alimentario inteligente. Además , una selección
preliminar del péptido derivado del lupino usando BIOPEP sugirió que el péptido puede contener motivos bioactivos
como inhibidores de las enzimas ACE, alfa-glucosidasa y DPP-IV; estos datos deberán comprenderse mejor e
investigarse más a fondo in vitro en estudios futuros para determinar el posible comportamiento multifuncional
bioactivo de este hidrogel basado en péptidos.

El presente trabajo no solo proporciona información para afinar las nanoestructuras, las
propiedades mecánicas y las actividades antioxidantes utilizando un hidrogel natural basado en
péptidos alimentarios, sino que también, combinando enfoques de química alimentaria,
nanotecnología y biología sintética, sin duda proporciona una prueba de- estrategia conceptual
para desarrollar nanonutracéuticos funcionales bioinspirados y más sostenibles, a partir de
péptidos de hoja ÿ biodisponibles obtenidos por hidrólisis enzimática de la proteína original.

Materiales complementarios: Los siguientes están disponibles en línea en https://www.mdpi.com/2227-905 9/9/3/294/s1,

Figura S1: La secuencia de la proteína ÿ-conglutina. Figura S2: Estructuras químicas de los péptidos T13 y BT13. Figura
S3: espectros de HPLC y MS de los péptidos T13 y BT13. Figura S4: Régimen viscoelástico lineal (LVR). Figura S5:
actividad antioxidante del péptido T13 como solución simple.

Contribuciones de los autores: Conceptualización, RP y CL; metodología, RP y CL; software,

RP y CL; validación, RP y CL; análisis formal, RP y CL; investigación, RP y CL; curación de
datos , RP, AA y CL; redacción—preparación del borrador original, RP y CL; redacción: revisión
y edición, RP, AA y CL; visualización, RP y CL; administración de proyectos, RP y CL;
adquisición de fondos, RP, AA y CL Todos los autores han leído y están de acuerdo con la
versión publicada del manuscrito.
Financiamiento: Esta investigación no recibió financiamiento externo.

Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No corresponde.

Declaración de consentimiento informado: No aplicable.

Declaración de disponibilidad de datos: Los datos están contenidos en el artículo o material complementario.

Agradecimientos: CL y AA están en deuda con la Fundación Carlo Sirtori (Milán, Italia) por haber proporcionado parte del equipo utilizado en esta
experimentación. RP agradece a Stefano Regondi y Christian Lunetta por su apoyo en sus actividades de investigación.

Conflictos de interés: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

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