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Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045

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Investigación Internacional de Alimentos

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Efecto inhibidor de compuestos bioactivos derivados de paraprobióticos liofilizados de

Pediococcus acidilacticicontra los patógenos transmitidos por los alimentos: estudios in
vitro y en modelos alimentarios

Gökhan Kürşad İncilia, Müzeyyen Akgola, Pinar Karatepeb, Hilal KanmazC, Büşra KayaC, Alí
Tekinb, Ali Adnan HayalogluC,*
aDepartamento de Higiene y Tecnología de los Alimentos, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad de Fırat, Elazığ, Turquía
bDepartamento de Procesamiento de Alimentos, Escuela Vocacional Keban, Universidad Fırat, Elazığ, Turquía
CDepartamento de Ingeniería de Alimentos, Facultad de Ingeniería, Universidad de Inonu, Malatya, Turquía

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO ABSTRACTO

Palabras clave: El objetivo fue evaluar el potencial antimicrobiano del paraprobiótico (LP) liofilizado/liofilizado deP. acidilactici contra algunos
compuestos bioactivos patógenos transmitidos por alimentos en condiciones in vitro y modelo alimentario, y determinación de compuestos
polifenoles
bioactivos que contribuyen a la actividad antimicrobiana de LP. Para ello, se determinaron la concentración inhibitoria mínima
Ácidos orgánicos
(MIC), los halos de inhibición frente aListeria monocytogenes,SalmonelaTyphimurium y Escherichia coliO157:H7. El valor de
paraprobiótico liofilizado
MIC fue de 6,25 mg/mL y un 20µL LP mostró zonas de inhibición de 8,78 a 10,0 mm contra estos patógenos. En el desafío de la
Pediococcus acidilactici
matriz de alimentos, se agregaron dos concentraciones de LP (3% y 6%) solo o en combinación con EDTA (0,02 M) a albóndigas
enriquecidas con bacterias patógenas, y también se determinó la actividad antimicrobiana de LP durante el almacenamiento
refrigerado. LP al 6 % + tratamiento con EDTA 0,02 M proporcionado 1,32 a 3,11 log10Reducciones de UFC/g en el número de
estos patógenos (pag <0,05). Además, este tratamiento proporcionó reducciones significativas en psicrotrofos, TVC, LAB,
moho-levadura yPseudomonasspp. sobre el almacenamiento (pag < 0,05). En cuanto a los resultados de caracterización, el LP
contenía una amplia variedad de compuestos bioactivos, incluidos 5 ácidos orgánicos (2,15 a 30,64 g/100 g), 19 aminoácidos
libres (6,97 a 699,15 mg/100 g), ácidos grasos libres (de corta, media -, y ácidos grasos de cadena larga), 15 polifenoles (0,03 a
383,78 mg/100 g), y algunos compuestos volátiles como pirazinas, piranona y derivados del pirrol. Estos compuestos
bioactivos no solo participan en la actividad antimicrobiana, sino que también contribuyen a la actividad de eliminación de
radicales libres según los ensayos DPPH, ABTS y FRAP. En conclusión, el resultado reveló que el LP mejoró la calidad química y
microbiológica de los alimentos debido a que contiene metabolitos biológicamente activos involucrados en la capacidad
antimicrobiana y antioxidante.

1. Introducción
Los alimentos derivados de animales comprenden una parte importante de las dietas
debido a que contienen cantidades considerables de proteínas, aminoácidos y vitaminas.
Sin embargo, estos productos son altamente perecederos debido a que proporcionan
macro y micronutrientes para los microorganismos debido a la alta actividad del agua y
valores de pH moderados, que son favorables para el crecimiento de microorganismos
saprofitos y patógenos transmitidos por los alimentos (Yu et al., 2021).
Las albóndigas son uno de los productos cárnicos listos para cocinar más
preferidos en todo el mundo. Se fabrican en tamaños bastante diferentes,
formas y contenidos basados en las preferencias de los consumidores. Las especias, la
sal y las verduras picadas, como la cebolla o el ajo, que también pueden tener efectos
antimicrobianos, son los ingredientes más comunes en las recetas de albóndigas. Sin
embargo, la carne y los productos cárnicos tienen una vida útil corta y también pueden
albergar microorganismos patógenos debido a la contaminación microbiana que pueden
transmitir los animales, el proceso de matanza, la manipulación, los ingredientes, las
fuentes ambientales y el almacenamiento (Bingöl et al., 2018).
Escherichia coliO157:H7,Salmonelaspp. yListeria monocytogenes son los
microorganismos patógenos responsables de las principales muertes humanas
transmitidas por los alimentos en el mundo (Morsy et al., 2018; Khaneghah

* Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico:adnan.hayaloglu@inonu.edu.tr (A. Adnan Hayaloglu).

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2023.113045
Recibido el 20 de marzo de 2023; Recibido en forma revisada el 12 de mayo de 2023; Aceptado el 22 de mayo de 2023
Disponible en Internet el 24 de mayo de 2023
0963-9969/© 2023 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.
G. Kürşad İncili et al. Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045

Tabla 3
Aminoácidos libres individuales de paraprobióticos liofilizados (liofilizados)
obtenidos dePediococcus acidilactici(significar±SE).

Aminoácidos Concentración (mg/100 g)

Ácido aspártico (Asp) 187.52±6.43

Ácido glutámico (Glu) 337.84±12.31
Asparagina (Asn) 85.18±2.75
Serina (Ser) 199.77±7.20
Glicina (Gly) 175.06±6.02
Histidina (His) 66.38±1.22
Arginina (Arg) 28.89±0.34
Treonina (Thr) 200.40±6.98
Alanina (Ala) 477.46±15.75
Prolina (Pro) 145.80±4.74
Tirosina (Tyr) 127.50±4.67
Valina (Val) 520.84±19.30
Metionina (Met) 95.61±3.39
Cisteína (Cys) 6.97±0.31
Figura 1.Densidades ópticas promediadas a 600 nm durante el crecimiento dePediococcus Isoleucina (Ile) 375.11±13.43
acidilacticia los 37◦C (Media±DAKOTA DEL SUR). Los valores medios con diferente letra (C.A.) entre Leucina (Leu) 699.15±26.39
los tiempos de muestreo son significativamente diferentes (pag <0,05). Fenilalanina (Phe) 268.72±8.98
Triptófano (Trp) 439.68±17.31
Lisina (Lys) 421.01±14.66

tabla 1
Capacidad antioxidante, contenido fenólico total (TPC) y ácidos
orgánicos en el paraprobiótico liofilizado (liofilizado) dePediococcus Tabla 4
acidilactici(significar±SE). Ácidos grasos libres en el paraprobiótico liofilizado
Ensayos Resultado
(liofilizado) dePediococcus acidilactici(Porcentaje de área pico
± SE).
DPPH(mg TEAC/kg) 12.950±55
ABTS(mg TEAC/kg) 21.182±424 ácido graso libre Área (%)
FRAP(mM FE/L) 19.80±0.05 Ácido acético (C2) 50.20±2.21
TPC(g EAG/kg) 11.29±0.04 Ácido butírico (C4) 0,64±0.00
Ácidos orgánicos (g/100 g)
Ácido caproico (C6) 0.19±0.02
Ácido cítrico 5.49±0.28 Ácido caprílico (C8) 0.17±0.03
Ácido málico 2.84±0.11 Ácido cáprico (C10) 0.23±0.01
Ácido láctico 30.64±1.59 Ácido láurico (C12) 0.38±0.00
Ácido acético 6.35±0.21 Ácido mirístico (C14) 0.72±0.01
Ácido butírico 2.15±0.18 Ácido palmítico (C 20.62±0.30
dieciséis) Ácido esteárico 18.35±0,94
(C18) Ácido oleico (C18:1) 8.51±0.96

Tabla 2
Compuestos fenólicos individuales en el paraprobiótico liofilizado (liofilizado) de
2016). Estos intentos también son compatibles con la conciencia de los consumidores de
Pediococcus acidilactici(Significar±SE).
productos alimenticios orgánicos o mínimamente procesados.
Compuestos fenólicos Concentraciones (mg/100 g) Hasta la fecha, las bacteriocinas son uno de los metabolitos antimicrobianos
ácido gálico 2.03±0.04 naturales derivados de BAL más utilizados; sin embargo, el estrecho espectro
ácido vanílico 383.78±2.06 antimicrobiano de las bacteriocinas contra bacterias Gram negativas es la
Ácido protocáucico 0.44±0.01
principal limitación de su uso en alimentos. Para superar este inconveniente, se
catequina 0.53±0.02
necesita un agente quelante, como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), para
Ácido 4-hidroxibenzoico 0.88±0.02
epicatequina 0.06±0.01 ampliar su espectro antimicrobiano (Morsy et al., 2018). Aparte de las
t-ácido cinámico 0.02±0.001 bacteriocinas, los sobrenadantes libres de células (CFS) o paraprobióticos, que
ácido caftárico 0.35±0.03 contienen todos los metabolitos producidos o liberados por las BAL, ofrecen un
Ácido clorogénico 0.20±0.002
campo de investigación novedoso. Los paraprobióticos se definen como células
Ácido 2,5-dihidroxibenzoico pag 0.18±0.004
-Ácido cumárico 0.19±0.001 microbianas no vivas o inactivadas que son beneficiosas para el consumidor
Ácido ferúlico 0.16±0.002 cuando se administran por vía oral y tópica en niveles adecuados, y también se
resveratrol 0.03±0.00 conocen como "probióticos inactivados o fantasmas" (Barros et al., 2020; Barros et
Rutina 2.25±0.16
al., 2021). Se han realizado numerosos estudios sobre la caracterización de CFS
Kaempferol 0.11±0.002
líquidos o postbióticos y la evaluación de su eficacia para mejorar la calidad
microbiana y química de diferentes alimentos. Ácidos orgánicos, CO2, h2O2,
et al., 2020). Aunque la industria alimentaria ha dedicado un gran esfuerzo reuterina, reuterociclina, volátiles, exopolisacáridos, diacetilo y etanol son los
durante muchos años para eliminar o reducir estos riesgos, estos compuestos identificados con mayor frecuencia en los SFC o postbióticos. Sin
microorganismos en realidad continúan amenazando la salud pública. Por lo embargo, el número de estudios realizados sobre paraprobióticos que revelaron
tanto, todavía se necesitan enfoques novedosos para superar los problemas su eficacia en modelos in vitro y alimentarios es bastante limitado. Además, las
microbiológicos actuales (Smaoui et al., 2016). Sobre esta base, las técnicas albóndigas no se consideran adecuadas para agregar grandes volúmenes de
de bioconservación, en particular, el uso de bacterias del ácido láctico postbióticos o paraprobióticos líquidos debido a un posible efecto negativo en la
bacteriocinogénicas (LAB) y sus productos naturales, como bacteriocinas, estructura física de las albóndigas. En este contexto, el uso de posbióticos o
ácidos orgánicos, aminoácidos o péptidos, exopolisacáridos, fenólicos y paraprobióticos en forma de polvo (liofilizados mediante el método de secado por
flavonoides, han recibido una atención creciente (Barcenilla, Ducic, López, congelación) no puede cambiar la estructura física de las albóndigas. El propósito
Prieto y Álvarez-Ordóñez, 2022; García, Bonilla, Villasmil, Reyes y Sathivel, de la investigación actual fue evaluar el potencial antimicrobiano del
2022; Martínez, Alvarenga, Thomazini, Fávaro-Trindade, & Sant'Ana, paraprobiótico liofilizado contra algunos

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G. Kürşad İncili et al.
Figura 2.Un cromatograma GC-MS representativo de ácidos grasos libres en el paraprobiótico liofilizado (liofilizado) deP. acidilactici.
bacterias patógenas, incluyendoEscherichia coliO17:H7,Listeria
monocytogenesySalmonelaTyphimurium vía modelo in vitro y albóndigas
durante almacenamiento refrigerado (4±1◦C), e identificación de compuestos
bioactivos que contribuyan a este efecto.
2. Materiales y métodos
2.1. Producción y caracterización de paraprobióticos liofilizados
El paraprobiótico se produjo a partir de un cultivo bioprotector (
Pediococcus acidilactici) suministrado por Chr. Hansen (B-LC-20). La
activación de la bacteria se logró tomando 1 ml de cultivo congelado en el
caldo de Mann Rogosa Sharpe (MRS) que contenía glicerol al 20% y
transfiriéndolo al caldo MRS. El cultivo se incubó a 37◦C, y durante el período
de incubación, las absorbancias se midieron a una longitud de onda de 600
nm justo después de la inoculación y a las 24, 48 y 72 horas. Se usó caldo
MRS estéril como ciego. Después de determinar la fase estacionaria de
entrada de las bacterias propagadas, esta duración de incubación se utilizó
en la producción de LP. Las bacterias propagadas fueron muertas por calor a
70◦C durante 40 minutos (García et al., 2022). Después de matar por calor la
solución bacteriana, se vertió en bandejas esterilizadas y se almacenó a -18◦C
durante 24 horas. Posteriormente, se realizó el proceso de liofilización a
− 55◦C durante 9 h a 13,33 Pa. Después de la liofilización, el rendimiento total se
calculó por la diferencia entre los pesos inicial y final de la muestra. Por tanto, el
rendimiento de liofilización se calculó como 9,5% (p/p). Los paraprobióticos
liofilizados se almacenaron en frascos esterilizados a 4◦C hasta su uso.
2.1.1. Ensayos de capacidad antioxidante, compuestos fenólicos totales e
individuales
Para la determinación de la capacidad antioxidante, se realizó la prueba de
2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) por el método descrito porChen et al. (2000). Los
ensayos ABTS [2,2-azino-bis-(ácido 3-etil-benzotiazolina-6-sulfónico] y FRAP (poder
antioxidante reductor férrico) se determinaron mediante los métodos descritos en
Re et al. (1999) y Demir et al. (2014), respectivamente. Antes de los ensayos
espectrofotométricos, el paraprobiótico liofilizado se dispersó en agua destilada
con diferentes concentraciones (diluciones de 100, 200, 400 y 800 veces) para
obtener absorbancias medibles (entre 0,1 y 0,9) en el espectrofotómetro. Después
de las curvas de calibración de Trolox con diferentes concentraciones, las pruebas
ABTS y DPPH se expresaron como mg de capacidad antioxidante equivalente de
Trolox (TEAC)/L y luego los datos se convirtieron a mg TEAC/kg de polvo liofilizado
de paraprobiótico. Los valores de FRAP se calcularon mediante la curva de
calibración de Fe2ENTONCES4,y los resultados se dieron como mM Fe+2equivalente
(FE)/L. Se utilizó el ensayo de Folin-Ciocalteu para la determinación del contenido
fenólico total (TPC) como se describe enSingleton et al. (1999)con ligeras
modificaciones (Incili et al., 2021) y se expresó en mg de ácido gálico
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Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045
equivalente GAE/kg. Los compuestos fenólicos individuales encontrados en el
paraprobiótico liofilizado se determinaron por HPLC (Shimadzu, modelo LC20AD,
Kyoto, Japón) mediante una ligera modificación del método dado su detalle en
Incili et al. (2021). Brevemente, se mezcló un LP de 0,25 g con 10 ml de agua
destilada con metanol (85:15) y se sonicó durante 10 min. Luego, la solución se
centrifugó a 7500 rpm durante 10 min. Después de la centrifugación, se recogió el
sobrenadante y se pasó a través de un 0,45µFiltro de membrana de tamaño de
poro m. Un 20µSe inyectó L de alícuota a la columna ODS-3 (C18, 250×0,5mm×0,5
um; GL Science, Kioto, Japón), y el caudal fue de 1 ml/min. El solvente A era agua
de grado HPLC y 0.1% H3correos4(v/v), y el disolvente B era agua de grado HPLC y
0,1 % de H3correos4
en acetonitrilo. El gradiente lineal se logró a una velocidad de flujo de 1,0 ml/
min de 0 a 25 % de disolvente B durante 15 min, de 25 a 75 % B durante 20
min y de 75 a 100 % B durante 25 min, y luego isocrático durante 55 min, y
seguido de lavado con metanol para reequilibrar la columna durante 7 min.
La elución se realizó a 280, 320 y 360 nm. Estándares analíticos de
compuestos fenólicos y flavonoides individuales (gálico, vainílico,
protocáucico, 4-di hidroxi benzoico,t-cinámico, caftárico, clorogénico, 2–5
dihidroxibenzoico,pag-ácidos cumárico, ferúlico, siríngico y sinápico,
catequina, epicatequina, resveratrol, rutina, kaempferol, hesperidina,
quercetina-3-glucósido, kaempferol-3-glucósido, luteolina, kaempferol y
miricetina) fueron suministrados por Sigma Aldrich (EE. UU.) . Las cantidades
de los compuestos fenólicos individuales se dieron en mg/100 g.
2.1.2. Compuestos volátiles
Los compuestos volátiles se identificaron en el paraprobiótico liofilizado
utilizando el método descrito en otro estudio (Incili et al., 2022b).
Brevemente, se disolvieron 3 g de paraprobiótico en 30 ml de acetato de
etilo y la solución se mezcló bajo gas nitrógeno durante 15 min. La mezcla se
mantuvo a temperatura ambiente hasta que se separaron las fases orgánica
y acuosa y se recogió la fase orgánica. Luego, se repitió el procedimiento de
extracción. La fase orgánica recolectada se secó en un evaporador rotatorio.
500µL de metanol se mezcló con fase orgánica seca y la mezcla se secó a 21◦
C durante 12 h en una campana de humos. Luego de esto, se combinó 1 mL
de metanol con la mezcla y se pasó a través de un 0.22µFiltro de membrana
de tamaño de poro m. un 1µL de esta solución se inyectó en el sistema GC-
MS (Shimadzu modelo QP2010, Kioto, Japón) con una columna (HP-5MS 60 m
×0,25 mm×0.25×m, columnas GC Agilent J&W, EE. UU.) utilizando helio como
gas portador a un caudal de 1 ml/min. La temperatura del horno se fijó a 50◦
C, luego se aumentó a 300◦C a razón de 3◦C/min y se mantuvo a esta
temperatura durante 10 min. La fuente de iones se fijó en 200◦C a 0,92 kV y 2
min de tiempo de corte. Los volátiles se escanearon en el rango de 40 a 700
metro/za partir de 2,4 a 93,0 min, y la identificación de volátiles se logró
utilizando el Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) y las
bibliotecas de Wiley
G. Kürşad İncili et al. Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045

Tabla 5 Tabla 5(continuado)

Perfil volátil del paraprobiótico liofilizado (liofilizado) obtenido dePediococcus
Compuestos Área (%)
acidilactici(Porcentaje de área pico±SE).
4H-pirano-4-ona, 2,3-dihidro-3,5-dihidroxi-6-metil- 0.54±
Compuestos Área (%) 0.13
Ácidos carboxílicos Pirazina, 2,5-dimetil-3-(3-metilbutil)- 0.02±
Ácido fórmico 0.17± 0.00
0.07 Pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-diona, hexahidro- 0.26±
Ácido acético 45.67± 0.04
1.50 Pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-diona, hexahidro-3-(2-metilpropil)- 1.13±
ácido propanoico 0.38± 0.10
0.11 Pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-diona, hexahidro-3-(fenilmetil)- 0.15±
Ácido 2-metil-propanoico (ácido isobutírico) 0.05± 0.02
0.01 totales (6) 2.17
ácido butanoico 0.02± Aldehídos y cetonas
0.00 3-Metil butanal 0.13±
Ácido láctico 3.68± 0.03
0.81 1-hidroxi-2-propanona 0.54±
Ácido 3-pirrolidin-2-il-propiónico 0.29± 0.12
0.04 1,3-ciclopentenediona 0.04±
Ácido palmítico 0.04± 0.01
0.00 Lilial 1.72±
totales (8) 50.31 0.05
alcoholes totales (4) 2.44
5-metil-2-hexanol 0.16± hidrocarburos
0.04 Acetileno 1.57±
2-hexanol 0.36± 0.12
0.19 1-Isopropil-2(metoximetoxi)-1,3-butadieno 0.11±
2-hexil-1-octanol 0.07± 0.04
0.01 1-metoxi-propano 0.11±
1-heptadecanol 0.07± 0.06
0.00 3-Tetradeceno, (Z)- 0.16±
1-Octadecanol 1.42± 0.07
0.09 1-tetradeceno 3.47±
totales (5) 2.08 0.84
ésteres tetradecano 0.14±
piruvato de metilo 0.08± 0.02
0.01 4-metil-pentadecano 0.04±
propanoato de 2-hidroxi-metilo 0.38± 0.00
0.05 2-metil-pentadecano 0.04±
lactato de etilo 0.33± 0.02
0.11 3-metilpentadecano 0.09±
pentanoato de heptilo 0.48± 0.06
0.21 1-heptadeceno 3.73±
cinamato de metilo 0.97± 0.10
0.23 hexadecano 0.07±
Ftalato de dietilo 0.05± 0.00
0.02 3-metil-hexadecano 0.03±
Salicilato de hexilo 0.04± 0.02
0.00 hendecano 0.05±
Salicilato de 2-etilhexilo 0.03± 0.01
0.00 Octadecano 0.10±
Miristato de isopropilo 0.02± 0.02
0.00 eicosano 0.10±
Ácido 1,2-bencenodicarboxílico, éster bis(2-metilpropílico) 0.05± 0.01
0.02 1-Nonadeceno 5.57±
Ácido 1,2-bencenodicarboxílico, éster dibutílico 0.05± 0.19
0.03 10,18-Bisnorabieta-8,11,13-trieno 0.09±
Acetato de dodecilo 0.05± 0.02
0.01 9-tricoseno 0.76±
oleato de metilo 0.05± 0.11
0.04 1-tricoseno 0.19±
oleato de etilo 0.09± 0.06
0.02 totales (19) 16.43
Acetato de 1-octadecanol 2.67± Terpenos
0.05 Linalol 0.18±
Acetato de fitol 0.02± 0.01
0.00 eugenol 0.25±
propanoato de decilo 0.06± 0.01
0.00 beta-elemento 0.04±
Ácido 1,2-bencenodicarboxílico, éster dioctilo 0.04± 0.02
0.01 viridiflorol 0.05±
Ácido 1,3-bencenodicarboxílico, éster bis(2-etilhexílico) 0.04± 0.01
0.00 cubenol 0.05±
totales (19) 5.50 0.02
Pirazinas, Pyranone y Pyrole alfa-,epi-Muurolol 0.23±
2,5-dimetil pirazina 0.07± 0.10
0.02 Cedrol 0.10±
0.02
(Continúa en la siguiente página)

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Tabla 5(continuado) metionina sulfona (como patrón interno) disuelta en HCl 0,1 N se mezclaron y

Compuestos Área (%) centrifugaron a 3.000×gramoa las 4◦C durante 10 min. Para la desproteinización,
se añadió ácido tricloroacético al 40% (1 mL) a 1 mL de sobrenadante y se
drimenol 0.02±
mantuvo a 4◦C durante 10 min. Después de la incubación, la mezcla se centrifugó a
0.00
totales (8) 0,94 20.000×g durante 10 min. Posteriormente, se tomaron 25 μL de sobrenadante y se
Compuestos varios liofilizaron. Después del secado, se colocó sobre la muestra seca un tampón de
Metanotiol 0.35± acoplamiento de 20 μL que consistía en metanol, trietilenamina y acetato de sodio
0.06
1 M con proporciones de 2:1:2, respectivamente, y la mezcla se liofilizó
trisulfuro de dimetilo 0.04±
0.01 nuevamente. Después del secado, se añadieron a la muestra 20 μL de tampón de
3-metoxi-4-[(trimetilsilil)oxi]-benzaldehído-o-metiloxima 0.48± derivatización preparado mezclando metanol, agua desionizada, trietilenamina y
0.12 fenilisotiocianato (PITC) con volúmenes 7:1:1:1, respectivamente, y la mezcla se
2,4-Di-Tercio-butil fenol 18.76± incubó a 25ºC.◦C durante 20 min y luego liofilizado. Posteriormente, se colocó 1 mL
0.88
de tampón de dilución sobre la muestra seca y la mezcla se pasó a través de un
Benzofenona 0.22±
0.03 filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,20 μm (CROMAFIL Xtra
Ergotaman-3′,6′,18-triona, 9,10-dihidro-12′-hidroxi-2′-metil-5′- 0.08± PVDF-20/25, MN GmbH, Alemania). Después de la filtración, se inyectó una alícuota
(fenilmetilo)-, (5′.alpha.,10.alpha.)- 9- 0.01 de 20 μL en la columna C18 (Kromasil 100–5, 150×4,6 mm×3µm) que se integró a
Octadecenamida 0.07±
un RP-HPLC (Shimadzu, Promimnence, Kyoto, Japón) equipado con un detector de
0.01
2,6,10,14,18,22-Tetracosahexaeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-, 0.14± matriz de diodos (SPD 20A), un muestreador automático (SIL-20A HT), un
(todo-E)- 0.02 calentador (CTO-20A) y una unidad desgasificadora ( DGU-20A5). Los aminoácidos
totales (8) 20.13 se usaron como estándares externos en una solución de HCl 0,1 N en las mismas
condiciones. El eluyente A se preparó con acetonitrilo al 2,5% que contenía acetato
de sodio 70 mM y el valor de pH se ajustó a 6,55 con ácido acético. La solución que
incluía acetonitrilo, agua y metanol (volúmenes 9:8:3) se utilizó como elución B. Se
Tabla 6
añadieron 10 mg de ácido etilendiaminotetraacético disódico a los disolventes por
Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) y los diatómeros de zona de inhibición de
paraprobióticos liofilizados (liofilizados) dePediococcus acidilactici(significar±SE). litro. El caudal fue de 1,0 ml/min. La elución se realizó con 5 % de B (v/v), luego con
un gradiente de 5 a 35 % de B (v/v) durante 11 min, seguido de un gradiente
Cepa valor MIC Zona de inhibición
creciente de 35 a 50 % de B durante 5 min, y de 50 a B al 70 % durante 4 min,
(mg/mL) (mm)
luego se mantuvo al 70 % B (v/v) durante 5 min. Posteriormente, la elución se
Escherichia coliO157:H7 ATCC 43894 6.25±0.00 9.64±0.20
devolvió a la condición inicial (5% B) dentro de los 5 min y se mantuvo al 5% B (v/v)
Escherichia coliO157:H7 ATCC 43895 6.25±0.00 9.56±0.25
Escherichia coliO157:H7 ATCC 35150 6.25±0.00 9.44±0.31 durante los siguientes 5 min antes de la siguiente inyección. El tiempo de
SalmonelaTyphimurium ATCC 14028 6.25±0.00 8.92±0.16 ejecución total fue de 35 min, la elución se controló a 254 nm y la temperatura del
SalmonelaTyphimurium NCTC 12416 6.25±0.00 9.89±0.28 horno de la columna se ajustó a 40◦C. Las cantidades de los FAA individuales se
SalmonelaTyphimurium NCTC 74 6.25±0.00 9.91±0.40
expresaron como mg/100 g.
Listeria monocytogenesATCC 7644 6.25±0.00 8.78±0.34
Listeria monocytogenesATCC 13932 6.25±0.00 9.93±0.18
Listeria monocytogenesN 7144 6.25±0.00 10.0±0.14
2.1.4. Ácidos orgánicos
Se utilizó HPLC de fase inversa (Shimadzu LC 20AD, Japón) para
integrado en el software GC-MS (solución GC-MS, Shimadzu, Kioto, determinar los ácidos orgánicos en el paraprobiótico liofilizado. Para ello, se
Japón). disolvió un paraprobiótico de 100 mg en 1 mL de agua ultrapura (Milipore,
modelo directo Q3, Francia), se centrifugó a 10000 rpm durante 10 min a 25◦
2.1.3. Aminoácidos libres (FAA) C, y esta mezcla se filtró a 0,45µm filtro de tamaño de poro. Una alícuota de
Las concentraciones de FAA se determinaron como se describe enIncili et 20µL se inyectó en la columna Hi-plex H (300 mm×
al. (2023). Brevemente, 2 g de LP y el mismo volumen de 0,4 mM 7,7 mm; Agilent Technologies, EE. UU.) integró un detector de matriz de diodos

Tabla 7
Recuento de bacterias patógenas en albóndigas durante 8 días de almacenamiento a 4◦C (promedio Log10UFC/g±SE).

Período de almacenamiento (días) Estadísticas

Grupos 0 2 4 6 8 PAGGRAMO PAGS PAGGxS

Escherichia coliO157:H7 Control 5.62±0.26b 6.10±0.42AB 6.64±0.57AB 7.78±0.33Automóvil club británico 8.05±0.20Automóvil club británico *** ** **
EDTA 5.51±0.35 5.64±0.12AB 5.40±0.09B 5.65±0.10B 5.91±0.12B
3% PL 5.20±0.36 5.27±0.49AB 5.55±0.20B 5.12±0.34antes de Cristo 5.49±0.26antes de Cristo

3% PLþEDTA 5.18±0.20 4.92±0.44B 5.19±0.14B 5.21±0.12antes de Cristo 5.48±0.35antes de Cristo

6% PL 5.20±0.21b 5.91±0.08Aba 5.49±0.16bebé 5.55±0.19BCab 5.51±0.24BCab

6% LPþEDTA 5.03±0.31 5.35±0.03AB 5.41±0.16B 4.92±0.27C 4.94±0.42C
Listeria monocytogenes Control 5.28±0.25A 5.43±0.02A 5.43±0.10A 5.39±0.05A 5.50±0.06A *** *** **
EDTA 5.22±0.27A 5.16±0.24AB 4.74±0.26B 4.96±0.29AB 4.98±0.33AB
3% PL 5.06±0.13AB 4.95±0.06antes de Cristo 4.68±0.09B 4.69±0.15B 4.75±0.13B
3% PLþEDTA 4.97±0.11AB 4.80±0.11C 4.71±0.19B 4.67±0.19B 4.48±0.21B
6% PL 4.53±0.27B 4.31±0.17D 3.96±0.20C 4.14±0.27C 4.43±0.26B
6% LPþEDTA 4.49±0.31Licenciado en Letras 3.84±0.04mib 3.37±0.12dbc 3.49±0.05dbc 3.05±0.20CC
SalmonelaTyphimurium Control 5.93±0,64Automóvil club británico 6.15±0.37Automóvil club británico 4.62±0.19aab 4.23±0,62Tejido 4.10±0.37AB *** *** **
EDTA 5.61±1.05Aba 6.16±0.31Automóvil club británico 3.00±0.01Cb 3.60±0.22Tejido 3.45±0.35Tejido
3% PL 4.66±0.09ABCa 4.10±0.08Licenciado en Letras 4.43±0.13Automóvil club británico 4.41±0.23Automóvil club británico 4.20±0.07Automóvil club británico

3% PLþEDTA 3.84±0.29C 3.86±0.05B 3.47±0.24antes de Cristo 3.53±0.34AB 3.27±0,45AB

6% PL 3.91±0.03antes de Cristo 3.92±0.10B 4.24±0.27AB 3.08±0.40antes de Cristo 3.50±0.16AB
6% LPþEDTA 3.48±0.34California 3.62±0.08Licenciado en Letras 2.10±0.10DB 2.55±0.12Cb 2.78±0.20Cama y desayuno

ANUNCIO:Los valores medios con letras diferentes en la misma columna,C.A:La misma línea son significativamente diferentes (pag <0,05).LP:Paraprobiótico liofilizado (liofilizado) de
P. acidilactici. Se utilizó EDTA al nivel de 0,02 M.PAGGRAMO: Grupos,PAGS:Tiempo de almacenamiento, *pag <0,05; **pag <0,01; ***pag <0.001.

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Fig. 3.Registro promediado10valores de conteo viable total (TVC) y bacterias psicrotróficas en las albóndigas durante 8 días de almacenamiento a 4◦C (media±SE). Los valores medios con letras diferentes
(ANUNCIO) entre los grupos dentro del mismo tiempo de almacenamiento y días de muestreo (anuncio) dentro del mismo grupo son significativamente diferentes (pag <0,05). LP: Paraprobiótico liofilizado
(liofilizado) dePediococcus acidilactici, la concentración de EDTA fue de 0,02 M. Interacciones estadísticas entre los grupos(GRAMO), tiempos de almacenamiento
(S)y grupos frente a tiempos de almacenamiento(GRAMO£S).

(SPD-M20A) a 210 nm. Los ácidos orgánicos se determinaron de acuerdo con
nuestra investigación previa (Incili et al., 2023), y los resultados se presentaron
como g/100 g.
2.1.5. Ácidos grasos libres (FFA)
Los niveles de FFA se determinaron mediante el método informado en nuestro
estudio anterior (Incili et al., 2023). Brevemente, 2 g de LP, 2,5 g de Na2ENTONCES
4, y 300µL de 4 NH2ENTONCES4se mezclaron en un tubo. La mezcla se agitó y
luego se mantuvo en la oscuridad durante 60 min. La mezcla se centrifugó a 1100×
gramodurante 5 min a 0℃.Posteriormente, a la mezcla se le agregaron 5 mL de
hexano y se centrifugó a 1600×gramodurante 10 min a 0℃,luego se incubó a
temperatura ambiente durante 120 min. Después de la incubación, se recogió el
sobrenadante y se pasó a través de una columna que contenía óxido de aluminio.
Posteriormente, se hizo pasar 5 mL de una mezcla de hexano/éter dietílico (1:1) a
través de la columna que contenía los AGL. Luego, se dejó secar el óxido de
aluminio en la columna y se transfirió a un tubo. Se agregaron al tubo 2 mL de
solución de ácido fórmico al 4% preparada en éter diisopropílico y se centrifugó a
700×gramodurante 10 min. Posteriormente, se recogió el sobrenadante y se
transfirió a viales. Una cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS;
Shimadzu, QP2010,
Kyoto, Japón) equipado con una columna capilar (Agilent, DB-FFAP; 60 m×0,25 mm
×0,25 μm) se utilizó para la identificación de FFA. Se utilizó helio como gas
portador a un caudal de 1 ml/min. La temperatura del horno GC se ajustó a 90℃
durante 3 min. La temperatura subió a 200 ℃a razón de 20℃/mín.
Posteriormente, se aumentó a 245℃ (10 ℃/min rate), y se mantuvo durante 30
min a esta temperatura. El modo de exploración del detector de espectrometría de
masas osciló entre 33 y 330metro/za 1 escaneo/s. La línea de interfaz a MS se
estableció en 280◦C. El MS se hizo funcionar en un modo de impacto de electrones
a una energía de electrones de 70 eV y se calibró mediante autosintonía. Los datos
se dan como % del área máxima total de cada FFA.
2.1.6. Concentración mínima inhibitoria (MIC) y zonas de inhibición Tres
cepas de cada bacteria patógena., E. coliO157:H7 (ATCC 35150, 43894,
43895),SalmonelaTyphimurium (NCTC 74, ATCC 14028 y 12416), yListeria
monocytogenes(ATCC 13932, 7644, N 7144), se utilizaron en el estudio.
Todas las bacterias se activaron en caldo de soja tríptica a 37◦C durante 24
horas. Luego, los sedimentos se recolectaron por centrifugación a 4200×g
durante 10 min. Luego, las absorbancias de los gránulos disueltos se
ajustaron a 0,1 a 600 nm para obtener casi 8,0 log10Recuento de bacterias
UFC/mL. Posteriormente, se prepararon diluciones decimales utilizando

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Figura 4.Registro promediado10valores de bacterias ácido lácticas y levaduras de moho en las albóndigas durante 8 días de almacenamiento a 4◦C (media±SE). Los valores medios con letras diferentes (
ANUNCIO) entre los grupos dentro del mismo tiempo de almacenamiento y días de muestreo (anuncio) dentro del mismo grupo son significativamente diferentes (pag <0,05).LP: Paraprobiótico liofilizado
(liofilizado) dePediococcus acidilactici, la concentración de EDTA fue de 0,02 M. Diferencias estadísticas entre grupos(GRAMO), tiempos de almacenamiento(S)y sus interacciones(GRAMO£S).

Tabla 8
Pseudomonasspp. cuenta en las albóndigas durante el almacenamiento refrigerado (Mean Log10UFC/g±SE).

Período de almacenamiento (días) Estadísticas

Grupos 0 2 4 6 8 PAGGRAMO PAGS PAGGRAMO×S

Control <1.0C <1.0C.A 5.22±0.10aab 3.10±2.12A B C 5.80±0.16Automóvil club británico – – –

EDTA <1.0a 1.63±0,95Automóvil club británico 2.28±0,46Licenciado en Letras 2.81±0.05Automóvil club británico 2.56±2.27Aba
3% PL <1.0a 1.72±1.08Automóvil club británico 1,95±0.001BCa 1,90±0.43Automóvil club británico 1,90±1.34Aba
3% PLþEDTA <1.0a <1.0Automóvil club británico 1.45±0.71BCa 1.45±0.71Automóvil club británico <1.0Licenciado en Letras

6% PL <1.0a <1.0Automóvil club británico 1.72±1.08BCa 1.63±0,95Automóvil club británico <1.0Licenciado en Letras

6% LPþEDTA <1.0a 1.25±0.51Automóvil club británico <1.0California 1.45±0.71Automóvil club británico 1.33±0.53Licenciado en Letras

C.A.:Los valores medios con letras diferentes en la misma columna,C.A:Los valores medios con letras diferentes en la misma línea son significativamente diferentes (pag <0,05).LP:
Paraprobiótico liofilizado deP. acidilactici. Se utilizó EDTA al nivel de 0,02 M.PAGGRAMO: Grupos,PAGS:Tiempo de almacenamiento, *pag <0,05; **pag <0,01; ***pag <0.001.

agua de peptona esterilizada al 0,1 % y log 6,010En los ensayos se utilizó el nivel de
inóculo para cada patógeno. Los valores de MIC se realizaron por el método de
dilución en caldo. Para este propósito, se preparó una concentración de 100 mg/
mL de paraprobiótico liofilizado en caldo Mueller-Hinton, y se prepararon
muestras diluidas dos veces en serie utilizando el mismo caldo. Luego, las
bacterias patógenas se inocularon por separado en los tubos a 6,0 log10UFC/mL.
Los tubos se incubaron a 37◦C durante 24 horas. Después de la incubación, la MIC
se determinó como la concentración más baja de LP sin
crecimiento bacteriano visible (CLSI, 2015). Después de la determinación de los valores de
MIC, se determinaron las zonas de inhibición frente a las mismas cepas. En este ensayo,
los inóculos se prepararon como se describe anteriormente y todas las bacterias se
extendieron al agar Mueller-Hinton. Después de la inoculación, las placas se mantuvieron
a temperatura ambiente durante 10 min para absorber las bacterias. La concentración de
paraprobiótico se preparó en valores de MIC por mililitros y 20 μL de esta solución se
adsorbieron en los papeles de filtro esterilizados de 6 mm de diámetro. Los papeles de
filtro se colocaron en el

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Tabla 9 se determinaron de acuerdo con los métodos informados porAOC (2002).

La carga microbiológica inicial de la mezcla de carne de res molida y albóndigas, y los hallazgos
químicos brutos de la mezcla de albóndigas utilizada en el estudio (Media±SE). 2.2.1. Análisis microbiológicos
Parámetro Carne molida Mezcla de albóndigas En los análisis microbiológicos, se pesaron 10 g de albóndigas en una
bolsa de estómago estéril y se agregaron a la bolsa 90 ml de 0,1% PW (10-1
Recuento viable total (log10UFC/g) 5.57±0.30 6.04±0.10
Bacterias psicrótrofas (log10UFC/g) 6.12±0.10 6.10±0.19 dilución). Después de la homogeneización a esta bolsa en un Stomacher
Bacterias ácido lácticas (log10UFC/g) 4.18±0.31 4.22±0.30 durante 1 min, las diluciones decimales estuvieron entre 10-2a 10-8. El conteo
Mohos y levaduras (log10UFC/g) 1.63±0.27 2.07±0.31 total viable (TVC) y las bacterias psicrotróficas se determinaron por el
Pseudomonasspp. (registro10UFC/g) pH 1.75±0.30 1.57±0.50
método propuesto porUSDA-FSIS (2015). Para ello se utilizó agar recuento en
6.06±0.29 6.01±0.30
Materia seca total (%) – 41.65±2.14 placa (Biokar, Francia) para TVC y psicrotrofos, y las placas de petri se
Proteína bruta total (%) – 20.78±0.05 mantuvieron a 35±2◦C durante 2 días y a las 7±1◦C durante 7 días,
Grasa bruta total (%) – 11.20±1.37 respectivamente. Las bacterias del ácido láctico se detectaron usando agar
Ceniza total (%) – 2.49±0.01 MRS (Merck, Darmstadt, Alemania), y placas incubadas anaeróbicamente a
30±1◦C durante 3 días (ISO 15214, 1998). El recuento total de mohos y
placas, y las placas se incubaron a 37◦C durante 24 horas. Posteriormente, se
levaduras se detectó mediante el uso de agar dicloran rosa de bengala
registraron las zonas de inhibición (mm).
cloranfenicol (DRBC, Biokar, Francia), las placas de Petri extendidas en placas
se incubaron a 25±1◦C durante 5 días (ISO 21527, 2008).Pseudomonasspp. se
enumeraron usando agar cefaloridina-fucidina-cetrimida (agar CFC, Biokar,
2.2. Elaboración de albóndigas y grupos de tratamiento
Francia), y las placas se incubaron a 25◦C durante 48 h (ISO 13720, 2010).
Para el recuento de bacterias patógenas se utilizaron agares Oxford, Sorbitol
La carne de res molida fresca y otros ingredientes se compraron en un
MacConkey (suplementado con cefixima telurito-CT) y Xilosa Lisina Tergitol-4
mercado local. La mezcla de albóndigas fue preparada por el estudio anterior (
(XLT-4) paraL. monocytogenes,E. coliO157:H7, yS. Typhimurium,
Incili et al., 2020). Brevemente, la carne molida se mezcló con 1,5 % de sal, 0,5 %
respectivamente. Las placas se incubaron a 37±1◦C durante 24 h y se
de pimienta negra y 2,0 % de cáscara de cebolla fresca, y la mezcla se amasó a
contaron las colonias características.
mano después de usar guantes estériles durante la operación (10 min).
Posteriormente, se realizó el proceso de inoculación experimental como se
describe anteriormente, y los niveles de contaminación de bacterias patógenas
2.2.2. Análisis de pH y color
Antes de la medición del pH en cada día de muestreo, se realizó una
fueron 5.0±1.0 registro10UFC/g. Luego, la mezcla de albóndigas contaminadas se
calibración de dos puntos utilizando los tampones de pH 7.00 y 4.01 a 25◦C.
dividió en 6 grupos de la siguiente manera: Control (sin ningún tratamiento), EDTA
Los pH de la carne molida y las albóndigas se determinaron preparando una
(0.02 M), Paraprobiótico (LP) al 3%, LP al 6% y su combinación con EDTA 0.02 M.
mezcla de carne molida y agua destilada (5:45), luego se registraron los
Después de la adición de EDTA y paraprobióticos liofilizados, la masa de
valores de pH a 25◦C (HI, 11310, Hanna Instruments, EE. UU.). Un colorímetro
albóndigas en los grupos de tratamiento se volvió a amasar. Luego, todas las
digital con iluminante D-65 a 10◦observador (CR-5, Konica Minolta, Osaka,
albóndigas se pesaron a 30±2 g, moldeados a mano y con guantes estériles,
Japón) para medir los parámetros de color de Hunter (L,a, yb) de las
colocados en bandejas estériles y almacenados aeróbicamente a temperatura
albóndigas. Los parámetros de color se registraron mediante al menos 3
refrigerada (4±1◦C) durante 8 días. Se prepararon un total de 60 albóndigas en
mediciones diferentes en tres lugares diferentes en la superficie de las
cada repetición y se analizaron dos albóndigas en cada día de muestreo para cada
albóndigas. Antes de los análisis, el colorímetro se calibró utilizando placas
repetición. Antes de la inoculación de la carga microbiana inicial de bacterias
estándar blancas y negras teniendo en cuenta las instrucciones del
patógenas (TVC, bacterias psicrotróficas, LAB, moho-levadura yPseudomonasspp.
fabricante.
recuentos) de carne molida y mezcla de albóndigas se determinaron mediante los
métodos descritos en la sección 2.2.1. Además, al comienzo del estudio, la
composición química bruta (materia seca total, grasa, proteína y ceniza) de las
albóndigas

Figura 5.Valores medios de pH de las albóndigas durante 8 días de almacenamiento a 4◦C (media±SE). Los valores medios con letras diferentes (ANUNCIO) entre los grupos dentro del mismo tiempo de
almacenamiento y días de muestreo (abdominales) dentro del mismo grupo son significativamente diferentes (pag <0,05).LP: Paraprobiótico liofilizado (liofilizado) dePediococcus acidilactici, la
concentración de EDTA fue de 0,02 M. Diferencias estadísticas entre grupos(GRAMO), tiempos de almacenamiento(S)y sus interacciones(GRAMO£S).

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G. Kürşad İncili et al. Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045

Figura 6.Valores promedio de L, a y b de las albóndigas durante 8 días de almacenamiento a 4◦C (media±SE). Los valores medios con letras diferentes (ANUNCIO) entre los grupos dentro del mismo tiempo
de almacenamiento y días de muestreo (C.A) dentro del mismo grupo son significativamente diferentes (pag <0,05).LP: Paraprobiótico liofilizado (liofilizado) dePediococcus acidilactici, la concentración de
EDTA fue de 0,02 M. Diferencias estadísticas entre grupos(GRAMO), tiempos de almacenamiento(S)y sus interacciones(GRAMO£S).

2.3. Análisis estadístico realizado con SPSS (v. 21.0). Los datos de la evaluación microbiológica se
convirtieron a logaritmo (log10) y todos los conjuntos de datos se presentaron
En el presente estudio, los datos se obtuvieron de tres réplicas independientes como media±Error estándar. Datos de recuentos microbiológicos, pH y cambios
de producciones de albóndigas y paraprobióticos, y todas las pruebas fueron de color entre los grupos de tratamiento, tiempos de almacenamiento

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G. Kürşad İncili et al.
(días), y sus interacciones fueron analizadas a través de un modelo lineal general (GLM) con la
fórmula que se presenta a continuación. Los grupos de tratamiento y los tiempos de
almacenamiento se reconocieron como variables fijas, mientras que tres réplicas se utilizaron
como efectos aleatorios. Cada parámetro dentro del mismo tiempo de almacenamiento o cada
tiempo de almacenamiento dentro del mismo grupo de tratamiento se compararon con la
prueba de comparación de Tukey enpag <0.05.
Yjk=m+ai+bj+ (abdominales)yo+εjk
Dónde,Yjk: La variable de respuesta;m: media global;ai: Grupos de tratamiento
(i = 1: Control, 2: EDTA, 3: LP al 3%, 4: LP al 3% + EDTA, 5: LP al 6%, 6: LP al 6% +
EDTA);bj: Tiempos de almacenamiento (j = 1: 0° día, 2: 2° día, 3: 4° día, 4: 6° día, 5:
8° día); (ab)yo: interacción entre grupos de tratamiento× tiempos de
almacenamiento yεjk: El error aleatorio.
3. Resultados y discusión
Durante la incubación deP. acidilactici, las absorbancias aumentaron
gradualmente de 0,688±0,001 (justo después de la inoculación) a 2,507± 0,01
(48 horas) (pag <0.05) (Figura 1). Sin embargo, después de las 48 h, las
absorbancias permanecieron constantes (2.505±0,001 a las 72 horas), y las
diferencias entre las horas 48 y 72 no fueron estadísticamente significativas (
PAG >0,05). Estos resultados revelaron queP. acidilacticientró en la fase
estacionaria a las 48 h de incubación. Por lo tanto, esta duración de
incubación (48 h) se utilizó para la producción del paraprobiótico.
3.1. Compuestos bioactivos de paraprobiótico liofilizado
Con base en la utilización de azúcar durante la fermentación, se determinaron
un total de cinco ácidos orgánicos en el LP como se muestra entabla 1, y el ácido
láctico fue el principal ácido orgánico en el LP (30,64±1,59 g/ 100 g), seguido de
ácido acético (6,35±0,21 g/ 100 g). Sin embargo, considerando los resultados
mencionados en la literatura, se vio que diferentes cepas de BAL podían producir
cantidades bastante diferentes de ácidos orgánicos (Luz et al., 2020; Chen et al.,
2021). Además, las cantidades de ácidos orgánicos determinadas en la presente
investigación fueron mucho más altas que las investigadas porChen et al. (2021).
Sin embargo, cabe señalar que la eliminación del agua por liofilización de CFS
resultó en un aumento proporcional en la cantidad de ácidos orgánicos que se
encuentran en el LP.
Aparte de los ácidos orgánicos, otros compuestos bioactivos como los
fenólicos, los aminoácidos y los ácidos grasos no solo contribuyen a la
actividad antimicrobiana sino también a la capacidad antioxidante de los
paraprobióticos. Sobre la base de la capacidad de captación de radicales, el
LP mostró una fuerte actividad antioxidante según el DPPH (12.950± 550 mg
TEAC/kg), ABTS (21.182±424 TEAC/kg), y FRAP (19,80± 0,05 mM FE/L) los
resultados se presentan entabla 1, y estos resultados fueron superiores a los
informados porAlí et al. (2021). El nivel FRAP de la presente investigación fue
mucho más alto en comparación con los hallazgos descritos porAlí et al.
(2021), yde Oliveira et al. (2021), probablemente debido a la expresión de los
datos como TEAC por kg de LP en polvo de paraprobiótico. Al considerar el
sólido seco total (aprox. 9,5 %, p/v) de la forma líquida de posbiótico, la
capacidad antioxidante de LP es comparable con la de nuestro grupo de
investigación (Incili et al., 2021; 2022a) y el trabajo de otros (Sidek et al., 2018
). Se observó la fuerte capacidad antioxidante del LP utilizado en este
estudio, probablemente proveniente de compuestos fenólicos. En esta
investigación se determinaron en total 15 polifenoles, siendo el más
abundante el ácido vanílico a nivel de 383.78 mg/100 g (Tabla 2). De esta
manera, diferentes números y cantidades de compuestos fenólicos en los
SFC deLactobacillusspp. fueron reportados porHamad et al., 2022. Como se
sabe, los compuestos fenólicos individuales contribuyeron al nivel de
contenido fenólico total (TPC) del paraprobiótico, que resultó ser de 11,29 g/
kg (tabla 1). El valor de TPC del postbiótico actual fue considerablemente
más alto que nuestros estudios anteriores (İncili et al., 2021 y 2022a). De
manera similar a los ácidos orgánicos, los niveles de compuestos fenólicos
totales e individuales aumentaron con la liofilización de paraprobióticos en
10
Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045
comparación con su forma líquida.
Está bien establecido que los FAA desempeñan un papel vital para regular
múltiples funciones corporales, y algunos de ellos son esenciales para los
humanos, como la leucina, la tirosina y la valina, que también se encontraron en
grandes cantidades en el LP utilizado en el presente estudio. Además, se señaló
que los FAA hidrofóbicos incluyen alanina, glicina, metionina, fenilalanina,
triptófano y valina, que se determinaron en el presente estudio, involucrados en la
eliminación de radicales libres (Ali et al., 2021). Los resultados mostraron queP.
acidilacticiprodujo un total de 19 aminoácidos y los niveles de estos aminoácidos
oscilaron entre 6,97 y 699,15 mg/100 g (Tabla 3). El aminoácido más abundante
fue la leucina (699,15 mg/100 g), seguido de la valina (520,84 mg/100 g) y la
alanina (477,46 mg/100 g). Sin embargo, los niveles totales de aminoácidos en el
presente estudio fueron mucho más bajos que los deAlí et al. (2021). Las
diferencias entre los estudios probablemente se deban a la composición de los
estudios de medios de crecimiento en términos de contenido de proteínas.
Además, se informó que los perfiles de FAA de los CFS eran considerablemente
diferentes en la cantidad de los aislamientos de BAL (Dedo del pie et al., 2019). Con
respecto a estas diferencias, se puede postular que la actividad proteolítica y los
perfiles de aminoácidos dependen en gran medida de la cepa y del medio de
crecimiento.
Se ha demostrado que los ácidos grasos producidos por la microbiota
intestinal presentan efectos antiinflamatorios, antimicrobianos y anticancerígenos
(Vrzácková et al., 2021; Renye et al., 2020). Además, los ácidos grasos de cadena
corta juegan un papel vital para mejorar la respuesta inmunológica a las
inflamaciones al inducir la liberación de mediadores antiinflamatorios (Nakkarach
et al., 2021). En el estudio actual, se detectaron dos ácidos grasos de cadena corta
diferentes (ácidos acético y butírico) en el LP (Tabla 4), y predominó el ácido
acético con una abundancia relativa de 50.2% (Figura 2). Sin embargo, se ha
demostrado que las BAL producen diferentes porcentajes relativos de ácidos
grasos de cadena corta (María et al., 2019). Los ácidos grasos de cadena media,
incluidos los ácidos cáprico, caproico, caprílico y láurico, se determinaron en el
presente estudio con el 0,97 % del total de FFA. Estos ácidos grasos se utilizan
generalmente para sintetizar cadenas largas (Zhu et al., 2020), y los ácidos grasos
de cadena larga no solo están involucrados en la estructura de las membranas
celulares, sino que también exhiben actividad antimicrobiana contra diferentes
microorganismos (Trautmann et al., 2020; Huang et al., 2011). En este estudio, se
determinaron en el LP cuatro ácidos grasos de cadena larga diferentes, incluidos
los ácidos mirístico, palmítico, esteárico y oleico (Tabla 4). Según las abundancias
relativas, los ácidos grasos de cadena larga comprendían el 48,2% del total de
ácidos grasos libres. Los ácidos grasos de cadena larga también contribuyen a la
respuesta antiinflamatoria del sistema inmunitario al servir precursores de los
eicosanoides (Huang et al., 2011). Al respecto, se identificó eicosan en los perfiles
volátiles de la LP al nivel de 0,10% (Tabla 5).
En el LP, se identificaron un total de 78 volátiles diferentes, incluidos
ácidos carboxílicos, alcoholes, ésteres, pirazinas, compuestos de piranona y
pirrol, aldehídos, cetonas, hidrocarburos, terpenos y compuestos
misceláneos (Tabla 5). Los ácidos carboxílicos comprendieron el 50,31% de
los volátiles totales, seguidos de los compuestos misceláneos (20,13%) y los
hidrocarburos (16,43%). Sin embargo, en nuestro estudio anterior, el
posbiótico líquido (CFS) deP. acidilacticitenía una fracción volátil diferente (
Incili et al., 2022b). Además, los CFS obtenidos de diferentes cepas de BAL
tenían una gran variación de perfiles volátiles (Luz et al., 2020). Se puede
señalar que el proceso de liofilización mostró un gran impacto en los perfiles
volátiles, y los CFS pueden variar entre los aislamientos de LAB al considerar
todas estas diferencias.
Además, el ácido acético fue el compuesto más abundante en los volátiles, con
un 45,67%. En contraste con la determinación de ácidos orgánicos por HPLC, el
ácido láctico no se encontró como el compuesto principal en los volátiles debido a
su menor volatilidad. Aparte de los ácidos carboxílicos, el segundo volátil más
importante fue el 2,4-di-Tercio-butil fenol (18,76%) en el presente estudio. Las
actividades antifúngicas y antioxidantes de este compuesto fueron documentadas
porVarsha et al. (2015). Además, se ha demostrado que los compuestos de
pirrolopirazina como [1,2-a] pirazinas y 5H-pirrolo [2,3-b] pirazina exhiben una
amplia gama de actividades biológicas, antiinflamatorias, que incluyen
antimicrobianas, antioxidantes y antimicrobianas. -
G. Kürşad İncili et al.
propiedades tumorales (Dehnavi et al., 2021). En este sentido,
derivados de [1,2-a] pirazina como pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-diona,
hexahidro-(0,26%), pirrolo[1,2-a]pirazina-1, 4-diona, hexahidro-3-(2-
metilpropil)- (1,13 %), y pirrolo[1,2-a]pirazina-1,4-diona, hexahidro-3-
(fenilmetil)- (0,15 %), y En el presente estudio también se identificaron
5H-pirrolo [2,3-b] pirazinas. De manera similar, también se identificó un
derivado de pyrrolo en el perfil volátil de CFS obtenido deP.
pentosaceus (Bajpai et al., 2016).
3.2. Propiedades antimicrobianas in vitro del paraprobiótico liofilizado
En el estudio actual, el valor MIC de LP fue de 6,25 mg/mL frente a todas
las cepas analizadas en el estudio (Tabla 6). Existe una gran variación en los
estudios realizados sobre los valores de CIM (osciló entre 5,72 μg/mL y 25–
50 mg/mL) de CFS liofilizados de diferentes cepas de LAB contra diferentes
bacterias patógenas (Sornsenee et al., 2021; Bajpai et al., 2016; García et al.,
2022; Amiri et al., 2022; Jutinico-Shubach et al., 2020). Se piensa que las
diferencias entre los estudios mencionados anteriormente pueden deberse
a la susceptibilidad de las cepas probadas y al tipo de para o postbióticos.
En el estudio actual, 20 μL de LP rehidratado mostraron zonas de
inhibición de 8,92 a 10,0 mm contra las bacterias patógenas probadas (Tabla
6). Otros investigadores también probaron las actividades antimicrobianas
de los postbióticos de diferentes cepas de BAL (de Azevedo et al., 2020;
García et al., 2022; Bajpai et al., 2016; Amiri et al., 2022; Jutinico-Shubach et
al., 2020; Arief et al., 2012). En estos estudios, se detectaron zonas de
inhibición que oscilaron entre 10,7 y 20,4 mm frente aL. monocytogenes,
L. inocente,E. coli,E. coliO157:H7, yS. Typhimurium aplicando de 10 a 200µL
CFS o postbióticos. Las diferencias entre el estudio actual y otros pueden
atribuirse a los diferentes niveles de antimicrobianos producidos por
diferentes cepas de LAB y el volumen de detección de CFS en los ensayos de
zona de inhibición.
3.3. Recuentos microbiológicos de albóndigas
Como se mencionó anteriormente, las bacteriocinas no son efectivas contra
las bacterias Gram negativas ni contra las cepas Gram positivas debido a la bicapa
de lipopolisacáridos de la membrana celular externa en las bacterias Gram
negativas. Se documentó que los quelantes, la alta presión hidrostática o la
estimulación eléctrica podrían ampliar el espectro antimicrobiano de las
bacteriocinas contra Gram-negativas (Corbalán et al., 2021). En este contexto, la
combinación de bacteriocinas y EDTA fue probada por otros investigadores, y se
obtuvieron actividades antimicrobianas más altas que solo de cada uno (Morsy et
al., 2018; Bingöl et al., 2018). Asimismo, la combinación de paraprobiótico
liofilizado y EDTA proporcionó una mayor actividad antimicrobiana que la utilizada
sola contra las cepas Gram-positivas y Gram-negativas utilizadas en la presente
investigación. Sin embargo, hasta donde sabemos, esta investigación es el primer
informe que probó la eficacia del paraprobiótico liofilizado y en combinación con
EDTA contra los principales patógenos transmitidos por los alimentos en las
albóndigas. Por lo tanto, no se pudo realizar una comparación exhaustiva con la
cita de la literatura.
En el desafío con albóndigas, la concentración de LP se usó aproximadamente
5 y 10 veces más alta que el valor de MIC, y estos aumentos estuvieron de acuerdo
con los hallazgos deHartman et al. (2011). Mencionaron que la concentración de
CFS que resultó ser eficaz en los desafíos in vitro debería aumentarse hasta 10
veces para que sea eficaz en las matrices alimentarias. Una posible razón de este
aumento puede deberse a la estructura compleja de las matrices alimentarias que
pueden haber resultado en la inactivación de metabolitos por enzimas
proteolíticas y lipolíticas, interacciones y adsorción de metabolitos (Moradi et al.,
2019), y proporcionan un entorno más favorable para la protección de las
bacterias frente a la acción de los antimicrobianos en comparación con los caldos (
Barcenilla et al., 2022). En el estudio actual, la combinación de LP al 6 % y EDTA
0,02 M proporcionó una mayor actividad antibacteriana en comparación con otras
concentraciones sobre bacterias patógenas (Tabla 7). En este grupo, el número de
E. coliO157:H7 (PAG
> 0.05),L. monocytogenes(PAG >0.05), yS.Typhimurium (pag <0.05)
11
Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045
fueron 0,60, 0,80 y 2,45 log10CFU/g inferior en comparación con las muestras de control
en función del día inicial, respectivamente. La eficacia antimicrobiana del LP aumentó a
medida que transcurrió el tiempo de almacenamiento y los recuentos bacterianos o las
tasas de reducción en las muestras disminuyeron y aumentaron durante el período de
almacenamiento, respectivamente (Tabla 7). Este hallazgo también fue confirmado por
las interacciones estadísticas para cada bacteria patógena entre los grupos de
tratamiento (pag <0.001), tiempos de almacenamiento (pag <0.01 paraE. coliO157:H7, y
pag <0.001 paraL. monocytogenesyS. Typhimurium) y grupos de tratamiento×tiempos de
almacenamiento (pag <0,01). Al final del almacenamiento, las diferencias entre el 6% LP +
EDTA y los grupos de control se alcanzaron a 3,10 y 2,45 log10UFC/g enE. coliO157 y
L. monocytogenescuenta, respectivamente (pag <0,05). Similarmente,Morsy et al.
(2018)informaron que la combinación de nanopartículas de lisozima, nisina, EDTA
y ZnO proporcionó un efecto sinérgico en la inhibición deE. coli O157:H7.
En el grupo de control, cuenta paraE. coliO157:H7 aumentó significativamente
y alcanzó 8,1 log10UFC/g el día 8, mientras que se observó una disminución
significativa enS. Typhimurium durante el período de almacenamiento (pag <
0,05). Del mismo modo, un aumento espectacular en los recuentos deE. coli
O157:H7 en carne de res picada (Morsy et al., 2018) y disminuye enS. Typhimurium
en albóndigas (Incili et al., 2020) y en carne molida de pavo (Chakchouk-Mtibaa et
al., 2017) también fueron reportados por otros investigadores. Se sabe que
SalmonelaTyphimurium no es capaz de sobrevivir en microecosistemas complejos
en términos de competencia interbacteriana, y un aumento en el número de otros
microorganismos puede suprimir su crecimiento (Rogers et al., 2021). Con
respecto a estos hallazgos, los aumentos graduales de TVC y bacterias
psicrotróficas (Fig. 3) puede explicar las disminuciones enS. Typhimurium en el
grupo control.
La carga microbiológica inicial de la carne molida y la mezcla de
albóndigas se dan enTabla 9, y el TVC inicial de la mezcla de carne molida y
albóndigas fue mucho más alto que los estudios realizados porBingöl et al.
(2018;) ySmaoui et al. (2016). Estos altos valores de TVC y bacterias
psicrotróficas de la carne molida y la mezcla de albóndigas probablemente
se debieron a las condiciones higiénicas del matadero y/o picadora de carne,
y al manejo (Arief et al., 2012).
En el grupo de control, TVC, psicrotrofos (Fig. 3), LAB, moho-levadura (Figura 4
), yPseudomonasspp. (Tabla 8) aumentado gradualmente durante el
almacenamiento refrigerado (pag <0,05). Sin embargo, estos números
permanecieron constantes o disminuyeron ligeramente en las albóndigas tratadas
con LP al 6% + EDTA después del segundo día de almacenamiento (PAG >0.05), y
este tratamiento fue el grupo más efectivo en términos de actividad
antimicrobiana en el estudio. Aparte del grupo de control, ligeros cambios en TVC
a lo largo del almacenamiento dieron como resultado interacciones insignificantes
entre los grupos de tratamiento (PAG >0,05). Contrariamente a este hallazgo, un
aumento gradual en el grupo control y diferencias significativas entre los grupos a
partir del segundo día provocaron interacciones significativas entre los grupos en
psicrotrofos y BAL (pag <0,001). Como se muestra enFigura 4, se observaron
tendencias crecientes similares en moho-levaduras en todos los grupos y, por lo
tanto, se encontraron interacciones insignificantes entre grupos y grupos ×
tiempos de almacenamiento (PAG >0,05). En el grupo tratado con LP al 6% + EDTA,
TVC, psicrotrofos, LAB, moho-levadura yPseudomonasspp. los recuentos fueron
1,25, 3,68, 1,60, 3,59 y 4,47 log10CFU/g menor en comparación con el grupo de
control en el octavo día de almacenamiento, respectivamente (pag <0,05). Los
hallazgos están en línea con investigaciones previas realizadas con carne molida,
albóndigas, carne fresca y filetes de pechuga (Moradi et al., 2019; Bingöl et al.,
2018; Yıldırım et al., 2016; Economou et al., 2009).
3.4. pH y propiedades de color de las albóndigas
La composición química bruta de las albóndigas en términos de valores medios de
pH, materia seca, proteína cruda total, grasa y cenizas se presenta en Tabla 9. En el
estudio, los valores de pH de las albóndigas se redujeron significativamente con niveles
crecientes de concentración de paraprobióticos liofilizados (pag <0,05;Figura 5). Estos
hallazgos pueden explicar la importancia de las interacciones grupales (pag <0,001).
Estas fuertes disminuciones observadas en los grupos de tratamiento se debieron al alto
nivel de ácidos orgánicos presentes en
G. Kürşad İncili et al.
el LP (tabla 1). Además, se observó un aumento significativo en el valor de pH de
las muestras de control durante el almacenamiento (pag <0.05), mientras que los
demás tratamientos se mantuvieron estables (PAG >0,05). El cambio en el pH
probablemente se debió al aumento dramático en el número dePseudomonasspp.
(Tabla 8), y este incremento gradual también provocó una diferencia significativa
en cuanto a la interacción del tiempo de almacenamiento (pag <0,05). Quedó
documentado que PseudomonasLas cepas fueron principalmente responsables
del deterioro de la carne y los productos cárnicos almacenados aeróbicamente, y
su crecimiento resultó en la acumulación de compuestos alcalinos, como NH3, h2S,
y aminas debido a sus actividades proteolíticas (Colmillo et al., 2022). Otros
investigadores también informaron aumentos dramáticos en los valores de pH de
albóndigas y muestras de carne picada durante el almacenamiento refrigerado (
Smaoui et al., 2016; Bingöl et al., 2018; Chakchouk-Mtibaa et al., 2017).
Las propiedades de color de las albóndigas se dieron enFigura 6. Estos
resultados mostraron que la adición de 6% de LP disminuyó
significativamente laL yavalores y aumentobal comienzo del
almacenamiento (pag <0,05). Además, estos cambios significativos en las
propiedades de color de las albóndigas por el aumento del nivel de LP
también se verificaron mediante la interacción grupal (pag <0,001). Estos
cambios probablemente se debieron al color marrón del LP producido al
usar caldo MRS. Se documentó que los postbióticos liofilizados mostraron
menorL(ligereza),a (enrojecimiento), y mayorb(amarillez) valores en
comparación con las muestras de control (Noguerol et al., 2021).
Durante el almacenamiento, elL y blos valores se mantuvieron constantes en los
grupos de tratamiento (PAG >0.05), por lo que no se encontró diferencia significativa en
cuanto a la interacción de los tiempos de almacenamiento (PAG >0,05). Contrariamente a
laLyb, se observó un aumento notable en laavalores de las muestras de control por el
tiempo (pag <0,05). Sin embargo, una disminución dramática enavalores en las muestras
tratadas con EDTA y ligeras disminuciones en otros grupos se determinaron durante el
almacenamiento (pag <0,05). Los cambios entre muestras y tiempos de almacenamiento
también fueron verificados por G (grupos), S (tiempos de almacenamiento) y G×S
interacciones (Figura 6). Los cambios en elbLos valores de las albóndigas no fueron
significativos en todos los grupos durante el almacenamiento (PAG >0.05), excepto 3% de
muestras tratadas con LP. De acuerdo con nuestros resultados, se informaron ligeros
cambios en las propiedades de color de las muestras de carne de pavo molida tratada
con bacteriocina porChakchouk-Mtibaa et al. (2017). Estos ligeros e insignificantes
cambios en las propiedades de color de las albóndigas en los grupos de tratamiento
probablemente se debieron a la capacidad antimicrobiana y antioxidante de los
paraprobióticos liofilizados. Por otra parte, los cambios observados en laLyavalor de las
muestras de control podría atribuirse al deterioro de las albóndigas. Es bien sabido que
los aumentos en el número de bacterias psicrotróficas yPseudomonas spp., y el contacto
con el oxígeno son los principales factores en el deterioro de la carne y los productos
cárnicos envasados en aerobiosis y almacenados en frío (Colmillo et al., 2022). De hecho,
estos factores fueron responsables de los cambios en laL yavalores de las muestras de
control durante el almacenamiento en el estudio actual.
4. Conclusión
En conclusión, en el paraprobiótico liofilizado/liofilizado obtenido de
P. acidilactici. Estos compuestos no solo exhibieron una alta capacidad
antioxidante, sino que también participaron en la actividad antimicrobiana del
paraprobiótico. En este contexto, el valor MIC del paraprobiótico liofilizado resultó
ser de 6,25 mg/mL frente aE. coliO157:H7,S. Typhimurium, yL. monocytogenes. En
la provocación con albóndigas, la combinación de LP (6 %) y EDTA (0,02 M)
disminuyó los recuentos deL. monocytogenes, S. tiphimurium,
E. coliO157:H7 y como 3.11, 2.45 y 1.32 y log10UFC/g en comparación con las
albóndigas sin tratar, respectivamente. Nuestros resultados revelaron que se
puede mejorar la seguridad microbiológica de los alimentos mediante el uso de
paraprobióticos liofilizados.
Declaración de contribución de autoría CRediT
Gökhan Kürşad İncili:Conceptualización, Metodología, Formal
12
Investigación alimentaria internacional 170 (2023) 113045
análisis, investigación, redacción: borrador original, redacción: revisión
y edición, visualización.Müzeyyen Akgol:Metodología, Análisis formal,
Investigación.Pinar Karatepe:Metodología, Análisis formal,
Investigación.Hilal Kanmaz:Metodología, Análisis formal,
Investigación.Büşra Kaya:Metodología, Análisis formal, Investigación.
Alí Tekin:Metodología, Análisis formal, Investigación.Ali Adnan
Hayaloglu:Metodología, Análisis formal, Investigación, Redacción:
borrador original, Redacción: revisión y edición.
Declaración de interés en competencia
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia ni
relaciones personales conocidas que pudieran haber influido en el trabajo
informado en este documento.
Disponibilidad de datos
Los datos estarán disponibles a petición.
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