Biocatalizadores Inmovilizados

DEFINICIÓN: SON ENZIMAS, CÉLULAS ENTERAS U ORGÁNULOS CELULARES (O BIEN COMBINACIONES DE

ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN LOCALIZADAS EN UNA REGION DEFINIDA DEL ESPACIO, CON RETENCIÓN DE
SU ACTIVIDAD Y EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIÓN.

La inmovilización es el proceso por el que las enzimas y las células pueden

transformarse en catalizadores heterogéneos. El biocatalizador se confina a
una región determinada a través de la cual se pasa la solución del substrato,
que sale como un producto, libre de catalizador.

• Los tratamientos a los que son sometidas tanto las células como las
enzimas libres que serán inmovilizadas afectan encierto grado la actividad.

• Para mantener la rentabilidad del proceso, debe alcanzarse un valor que

no debe ser menor al 25%. En el caso de células puede ser necesario
mantener la viabilidad.

• La inmovilización, entonces, debe tratar de ser realizada en condiciones tales que la pérdida de
actividad sea reducida.

•Es necesario saber cómo afecta el método de inmovilización la estabilidad del biocatalizador, y
por ende la extensión de su uso repetido.

• Las células inmovilizadas presentan una estabilidad mayor que las células libres en suspensión, y
por lo tanto la inmovilización es un requisito necesario para poder reutilizar las células.

• El tiempo de vida media, en condiciones operacionales, varía normalmente entre 20 y 50 días.

RETENCIÓN FÍSICA = ATRAPAMIENTO

Atrapamiento en matrices.
En geles o polímeros.
Micelas reversas.
Atrapamiento en membranas.
En fibras huecas.
En reactores de membrana

Métodos químicos
Enlace covalente
Entrecruzamiento intramolecular
Entrecruzamiento intamolecular
Copolimerización de la enzima modificada con un monómero insaturado en un gel 3D

Métodos Físicos
Atrapamiento en el gel polimérico
Adsorción (no covalente)
Atrapamiento en fibras y en fibras huecas
Microencapsulación
Adsorción iónica
Atrapamiento en liposomas
Atrapamiento en láminas de un polímero semipermeable.

Débil-
Débil Media Media Media Fuerte
Media-Alta Baja Baja Media-Alta Alta
Posible Imposible Imposible Posible Dificil
Medio-Alto Medio Medio Bajo Alta
Media Alta Alta Baja Alto
General General Limitada General Limitada
Si Si Si No No

Ilustración esquemática de la estabilización aparente

de una enzima por efecto de la inmovilización.
Requisitos mínimos para la inmovilización

• La enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.

• Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al sitio activo. Si pudieran

interferir con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande posible.

• Si es posible, se debería proteger el sitio activo:

- si existen grupos -SH, éstos deben hacerse reaccionar con cisteína o glutation, para reactivarse
posteriormente tras la inmovilización.
- se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de sustrato.

• El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.

•Coherencia con la posterior biotransformación.

- si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil (repulsión)

- enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado será malo.

• Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma física del
mismo).
•El soporte debe presentar una alta superficie específica, para minimizar los problemas de
transferencia de materia.
• El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminación
microbiana.
• El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading").
• El soporte debe ser comercialmente accesible:
-bajo precio
-buena disponibilidad

Ventajas de la inmovilización
1.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o célula inmovilizada.
2.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimática por la capacidad de reutilización.
3.- Se aumenta la facilidad de recuperación y purificación de los productos
4.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseños ingenieriles
5.- Se aumenta la facilidad de operación y control del proceso, al trabajar en condiciones más
suaves.

Desventajas de la inmovilización
1.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimática.
2.- Se aumentan los problemas difusionales.
3.- Se aumenta el costo del proceso.
4.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo.
Biotransformación

Ventajas Células
•Varios pasos enzimáticos
•Cofactores.
•Costos
•Necesidad de Membranas Biológicas.
-Formación de otros productos no deseados.
-Pasaje de S y P por membrana puede estar dificultado.
-Limitada actividad volumétrica de catalizador.
-Transferencia de oxígeno limitante.
-Dificultad de reacción en presencia de otros solventes.

Enzimas
•Especificidad y posibilidad de utilización de substratos no naturales.
•Fácil Purificación del producto y ausencia de contaminantes.
•Posibilidad de Reutilización.
•Alta actividad volumétrica de catalizador.
•Posibilidad de reacción en presencia de otros solventes.
-Etapa de extracción y purificación de la enzima: mayor costo.
-Menor estabilidad.
-Transporte de masa limitado solo con enzimas inmovilizadas

Cell adsorption
Adsorption of cells to a determined matrix is one of the simplest processes of immobilization, in
which the matrix provides only mechanical support to microorganism’s adsorption. Several works
have been presented, where sheets of acetylcellulose, filter paper or nylon were employed to
immobilize microbes for the construction of biosensors. There are, however, some drawbacks
associated with non-covalent linkage. As low energy forces are involved (Van der Waals forces,
hydrogen bonds and electrostatic interactions), they may be easily disturbed causing cell leaching
from the material by shearing forces or changes in the pH and ionic strength of the solution.

Inclusion in polymeric matrices and membranes

This method is the preferred one for cell encapsulation. Polymeric gels are obtained in different
ways and the result is a matrix which resembles the extracellular environment, thus protecting
cells from harsh conditions.
Organic or inorganic polymers may be used, being the former preferred for its biocompatibility
and the latter for its mechanical properties, providing strength and an overall structure. Hybrid
polymers would show superior properties compared with their pure counterparts.

Natural occurring polymers Proteins

Gelatin is a collagen derivative, obtained from animal’s bones and skin.
Collagen is composed of three polypeptide strands forming an alpha hélix which associate to form
microfibrils. In gelatin, natural bonds between individual collagen strands are broken down
preserving its original chemical composition. It can be used alone or with the aid of glutaraldehide
to immobilize cells and enzymes. A major drawback could arise when bacterial strains are
immobilized, due to its proteinous composition. Collagen has attracted special interest in the field
of cell immobilization, due to it’s low immunogenicity, high stability, large pores and ability to
support cell growth.

Polysaccharides
Agarose is a linear polysaccharide obtained from agar, formed by multiple units of the dissacharide
agarobiose. It is extensively used in microbiology and in molecular biology, being itself nontoxic and
biodegradable.
Chitosan is a linear polysaccharide, composed of K(1L4) linked Dglucosamine and N-Acetyl-D-
glucosamine, product from chitin deacetylation, the structural element forming part of crustacean’s
exoskeletons and fungi cell walls. Chitosan contains mainly cationic groups, which promotes
binding to negatively charged surfaces such as mucosal membranes. This makes chitosan a
bioadhesive, which is also biocompatible and biodegradable.
Alginate or alginic acid is an anionic linear polysaccharide extracted from seaweed, composed of K-
D-mannuronic acid and M-L-guluronic acid. It is a biodegradable, non toxic polymer, capable of
retaining high amounts of water. Sodium alginate readily gelifies when exposed to divalent cation
solutions, being extensively used in the immobilization of cells and enzymes.

Silicates
Optically transparent materials can be produced by the hydrolysis and polycondensation of
organometallic compounds at low temperatures. Silica gel prepared by the sol-gel method renders
a porous matrix formed by a SiO2 network, in which the pore size varies depending on the
conditions and additives used in the preparation. Sol-gel materials have various advantages such
as optical transparency, biocompatibility, chemical, thermal and mechanical stability. On the other
side, diffusion can be affected in thick films or in gels with small pores.
Furthermore in the aging process, as pores become smaller, not only diffusion is affected but also
cell viability because of the mechanical stress imparted by gel shrinkage. Modifications of
prepolymer composition and immobilization procedure could increase the viability of the
entrapped cells and also influence sensors properties . The synthesis of solid inorganic materials
from alkoxide, aqueous and polyol-modified silanes routes, as well as the incorporation of organic
polymers, was studied in order to improve the viability of encapsulated cells. This emerging field of
material science has generated considerable and increasing interest during the past decade and
was covered in comprehensive reviews and the patents associated to the immobilization of whole
living cells in sol-gel derived hybrid materials.

Synthetic Polymers

Synthetic Latex
Latex refers generically to a stable dispersion (emulsion) of polymer microparticles in an aqueous
solution. Latex immobilization has various advantages as it effectively traps cells in a flexible
matrix, preventing leakage, without altering cell viability. Furthermore, the capacity to form thin
films enables better nutrient diffusion.

Polyvinyl alcohol
Polyvinyl alcohol (PVA) is a water-soluble synthetic polymer. It has film forming and adhesive
properties. It is also biocompatible with human tissues and degradable. Concentrated solutions of
PVA, when allowed to stand at room temperature, gel forming hydrogels with low mechanical
strength. In order to improve mechanical properties, cross-linking with glutaraldehide or borax,
among others have been reported, though it was observed that enhancing mechanical strength
reduced the water content of the gel. A partial solution to this problem was gelling PVA by
iterative freeze-thaw.