INMOVILIZACION DE ENZIMAS La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para

dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA

1. Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin

de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.

2. Inclusin en membranas: Dividida en dos tipos: a. Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 m de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos.

b. Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la industria. Estos reactores emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima sobre la membrana que formar el reactor. Esta adsorcin se puede realizar de dos formas: 1. mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la membrana; 2. por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.

MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR UNIN QUMICA

1. Unin a soportes Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos a. Soportes inrganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.) b. Soportes rganicos. Se pueden clasificar en: Polmeros naturales: a su vez divididos en: polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, chitosan, etc). protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: divididos en: Poliolefinas (como el poliestireno)

Polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc).

2. Adsorcin En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los principales factores que influyen en la adsorcin, son: el pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido; la fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena; el dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima; la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden incrementar la carga enzimtica del derivado. Como principales ventajas de este mtodo destacan: su preparacin sencilla, su bajo coste, no hay cambios de especificidad enzimtica, los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente: la optimizacin de las variables que controlan la adsorcin, los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico, la unin al soporte es dbil.

Una variante dentro de la tcnica de la adsorcin consiste en emplear resinas de intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble.

3. Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas (Tabla 1). De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo presenta las siguientes ventajas: La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla; La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin; Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado tanque agitado. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria. En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes: Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc.

Atributos ideales de un soporte Alta rea superficial Permeable Insoluble Alta rigidez Regenerable Resistente a ataque microbiano y qumico Estable mecnicamente y trmicamente Hidrofobicidad controlada