Inmovilización de células microbianas para la producción de ácido orgánico

y etanol

Introducción
Los microorganismos son biocatalizadores utilizados activamente en el proceso de fermentación
donde el producto y la biomasa se obtienen a partir de azúcares fermentables. Las células se
recolectan y reutilizan. La inmovilización de células se ha practicado en la producción de vinagre.
Las enzimas y las células completas pueden unirse a un soporte sólido, fijado en forma de capa
activa. Cuando el sustrato pasa sobre la superficie, las reacciones enzimáticas cambian el sustrato
al producto deseado. Las enzimas y los microorganismos adecuados se utilizan en la fabricación de
aromas alimentarios, aditivos, medicamentos y otros productos que se producen mediante una
variedad de metabolitos microbianos. Las células inmovilizadas pueden comportarse de manera
diferente a una masa equivalente de células suspendidas libremente.1 Pueden producir polímeros
extracelulares, que generalmente se agrupan junto con las células en las mediciones de biomasa
seca, lo que resulta en una sobreestimación de la actividad de la biomasa inmovilizada.2 Además,
la ubicación de las células en la forma de la biopelícula puede afectar su calidad y actividad,
porque los perfiles de las condiciones ambientales, como el efecto de la concentración del
sustrato, a menudo desaparecen. Sin embargo, en muchos estudios los resultados de cultivos
suspendidos libremente se han utilizado para modelar biorreactores de células inmovilizadas,
generalmente sin mucha atención en la evaluación de la calidad de la biomasa en el sistema.
Normalmente, estos modelos permiten el efecto de limitaciones difíciles en y alrededor de la
biopelícula, y suponen que las células inmovilizadas tienen la misma calidad y actividad que el
cultivo celular suspendido, independientemente de la posición en la biopelícula.

De hecho, pueden existir gradientes de concentración de sustrato significativos para las células
inmovilizadas en la biopelícula. Es probable que las células ubicadas cerca del suministro de
nutrientes mantengan una mayor calidad y actividad en comparación con las células ubicadas
relativamente más lejos, lo que lleva a una diferenciación en la calidad o actividad de la población
celular inmovilizada. Esta diferenciación es más pronunciada si hay regiones de hambre. En la
práctica, puede existir una concentración de sustrato cero dentro de la biopelícula, porque en
estas regiones la fisiología celular puede ser marcadamente diferente de la de las células
suspendidas libremente.

Las actividades de las células se han descrito basándose en un modelo de biopelícula de múltiples
especies y la cinética microbiana mediante un modelo matemático. El uso de este modelo predice
que la biomasa en la superficie externa del biofilm tiene una actividad más alta que la biomasa
cerca de la superficie del soporte sólido, y esa condición puede ocurrir, después de que el biofilm
haya alcanzado un punto crítico o formado multicapas gruesas del biofilm. . El modelo se basó en
la cinética de crecimiento microbiano determinada por Wang et al.2 Sin embargo, no se
presentaron resultados experimentales en ninguno de los estudios de inmovilización para verificar
las predicciones del modelo, ni se comparó la actividad de biomasa inmovilizada predicha con la
de células suspendidas libremente en un forma integral.
Wang et al.2 y Najafpour et al.3,4 trabajaron con células microbianas inmovilizadas de Nitrobacer
agilis, Saccharomyces cerevisiae y Pseudomonas aeruginosa en perlas de gel, respectivamente.
Encontraron por separado que las células retuvieron más del 90% de su actividad después de la
inmovilización utilizando la tasa de absorción de oxígeno específica (SOUR) [mg O2g1 (biomasa
seca) h1] como indicador de actividad de la biomasa. Tales diferencias en la biomasa inmovilizada
y la actividad entre las actividades de biomasa libre e inmovilizada dependen en gran medida de
las características particulares de los sistemas microbianos y su interacción con la matriz de
soporte.

Células microbianas inmovilizadas

Desde 1978, varios artículos han examinado el potencial del uso de células inmovilizadas en la
producción de combustible. Las células microbianas se utilizan ventajosamente para fines
industriales, tales como Escherichia coli para la producción continua de ácido L-aspártico a partir
de furmarato de amonio. Las enzimas de microorganismos se clasifican en extracelulares e
intracelulares. Si se pueden inmovilizar directamente células microbianas completas, se pueden
omitir los procedimientos de extracción y purificación y se puede mantener al mínimo la pérdida
de actividad enzimática intracelular. Las células completas se utilizan como catalizador sólido
cuando se inmovilizan sobre un soporte sólido. Hay tres métodos generales disponibles para la
inmovilización de células microbianas completas: unión al portador, atrapamiento y reticulación.

Unión al portador

Como se muestra en la Figura 8.1a, el método de unión de portadores se basa en unir células
microbianas directamente a portadores insolubles en agua. La unión se debe a las fuerzas iónicas
entre las células microbianas y los portadores insolubles en agua. Sin embargo, esta técnica rara
vez se ha utilizado debido a la lisis durante las reacciones enzimáticas. Las células microbianas
pueden filtrarse del portador, interrumpiendo así la inmovilización. Por lo tanto, este método no
se ha aplicado con éxito.

Atrapamiento

Al aplicar el atrapamiento, las células microbianas quedan atrapadas directamente en matrices

poliméricas (Figura 8.1b). Este método se ha aplicado a varios microorganismos utilizando
gelatina, agar, gel de poliacrilamida, alginato cálcico, etc., como agentes atrapadores. Las
siguientes matrices se utilizan ampliamente para inmovilizar células microbianas:

 Colágeno
 Gelatina.
 Agar.
 Alginato.
 Carragenina.
 Triacetato de celulosa.
 Poliacrilamida.
 Poliestireno.

En este método, las células microbianas aparentemente se lisan dentro del agente atrapador, pero
retienen la actividad enzimática deseada. Para preparar una inmovilización eficaz, se deben
optimizar el tipo y la concentración de un reactivo bifuncional para el atrapamiento. La ventaja de
este método es que la fuga celular puede actuar como una barrera de difusión, causando
dificultad para transferir el sustrato y el producto a través de la matriz.

FIG 8.1. Alternatives methods used to immobilise cells. (a) Carrier binding; (b) entrapment; (c)
cross-linking.

Vinculación cruzada (reticulación)

Se ha informado que las células microbianas inmovilizadas por reticulación con reactivos bi o
multifuncionales como el glutaraldehído tienen éxito, pero no se han obtenido inmovilizaciones
activas con otros reactivos como el toluendiisocianato. La pared celular microbiana está
compuesta de lipoproteínas, con lipopolisacáridos que se extienden desde la membrana celular. El
glutaraldehído reacciona con la lisina dentro de la proteína en la bicapa lipídica de la membrana
celular. Además, la gelatina se absorbe físicamente en un soporte sólido, que proporciona un
enlace covalente entre las células microbianas que está estrechamente unido a un soporte sólido
por absorción (Figura 8.1c).

El glutaraldehído se ha utilizado como reactivo de reticulación para la producción de etanol. Se

informó que las tasas máximas de logro alcanzaron los 7,4 g./l h de etanol producido a partir de
glucosa. La principal ventaja del método de reticulación es que el reactivo de inmovilización no
actúa como barrera de difusión. En realidad, este sistema proporciona una película delgada de
células, lo que lo hace ideal para muchas aplicaciones.

Ventajas y desventajas de las células inmovilizadas

Hay varias ventajas de un sistema de celda inmovilizada sobre un sistema por lotes o CSTR. El
primer y más obvio beneficio es la capacidad de reciclar o reutilizar los microorganismos ya que
quedan retenidos dentro del reactor cuando el producto sale del reactor. En segundo lugar, la
inmovilización se puede utilizar fácilmente para un proceso continuo que mantiene una alta
densidad celular, proporcionando así una alta productividad.

En tercer lugar, el agotamiento de nutrientes y cualquier compuesto inhibidor no tienen, en

general, un gran efecto sobre las células inmovilizadas porque las células se fijan mediante
inmovilización. En la fermentación por lotes y CSTR, el agotamiento de nutrientes, la inhibición y la
acumulación de subproductos tóxicos son problemas importantes, pero las células inmovilizadas
generalmente no se ven afectadas por los subproductos tóxicos.

Sin embargo, existen desventajas en el uso de células inmovilizadas. La celda puede contener
numerosas enzimas catalíticamente activas, que pueden catalizar reacciones secundarias no
deseadas. Además, la propia membrana celular puede servir como barrera de difusión y puede
reducir la productividad. La matriz puede reducir drásticamente la productividad si el
microorganismo es sensible a la inhibición del producto. Una de las desventajas de los reactores
de células inmovilizadas es que no se puede controlar el estado fisiológico del microorganismo.

Experimentos con reactores de células inmovilizadas

Los experimentos del reactor de células inmovilizadas (ICR) se llevaron a cabo para determinar el
rendimiento de Propionibacterium acidipropionici inmovilizado en un reactor tubular de flujo
pistón. La productividad del ICR se evaluó midiendo el consumo de glucosa y xilosa, y la
producción de ácido propiónico y acético, a lo largo del reactor. Los anillos Rasching se
esterilizaron y se recubrieron por inmersión en una solución estéril de gelatina al 20% y agar al
1,5%. Los anillos revestidos se empaquetaron aleatoriamente en la columna. Después de que los
anillos revestidos se hubieran secado, el relleno se pulverizó con una solución de glutaraldehído al
2,5%. También se probó un procedimiento alternativo para preparar el embalaje y resultó
satisfactorio. Al usar el último método, la columna del reactor se llenó con anillos Rasching
limpios. Se pasó una solución de agar gelatina caliente a través de la columna y se dejó humedecer
toda la superficie de relleno. Cuando se secó el revestimiento, la solución de glutaraldehído se
pasó a través de la columna de forma similar. Se dejó reposar la columna durante 24 horas y luego
se lavó con agua destilada estéril. El reactor se esterilizó pasando óxido de etileno a través de la
columna. Se dejó reposar el óxido de etileno en la columna durante ocho horas antes de purgar el
sistema con nitrógeno estéril. La alimentación y los tubos del producto se esterilizaron en
autoclave usando vapor a 15 psig.

Después de la esterilización, se bombeó a través de la columna un cultivo de semillas de 24 horas.

Se permitió un tiempo de adaptación de aproximadamente 48 horas para el establecimiento de
una película de microorganismos entrecruzados a los anillos de Rashing. A continuación, se
bombeó el medio de alimentación al reactor. Fue difícil calcular con precisión los tiempos de
retención en el reactor, debido al hecho de que el crecimiento y la evolución de dióxido de
carbono pueden tomar una fracción importante del volumen vacío del ICR, lo que da como
resultado un tiempo de retención falso. El espesor de la película microbiana podría controlarse
pasando periódicamente nitrógeno o dióxido de carbono estéril a través de la columna, para
detener el crecimiento excesivo de células.

Se utilizó una concentración de alimento de 15 g de glucosa y 15 g de xilosa por litro en una tasa
de alimento de 20-200 ml / h. Se tomaron muestras en puntos sucesivos a lo largo de la longitud
del reactor y se realizaron los análisis habituales para el consumo de glucosa y xilosa, producción
de ácidos orgánicos y densidad celular. A partir de estos datos se obtuvo un modelo cinético para
el crecimiento y fermentación de P. acidipropionici.

Se establecieron procedimientos analíticos para medir la densidad celular, la concentración de

azúcar y la concentración de ácido orgánico. La turbidez del cultivo (densidad óptica) se determinó
leyendo la absorbancia con espectrofotómetro y recuentos de células. La concentración de azúcar
como un solo sustrato se midió con un analizador digital industrial. El azúcar total se evaluó
mediante un agente reductor como el ácido dinitrosalicílico en solución alcalina. Se produjo un
color naranja que se leyó en un colorímetro a 540 nm. Los ácidos orgánicos se determinaron
mediante un cromatógrafo de gases, con un detector de ionización de llama.

MODELO DE TARIFA ICR

La Tabla 8.1 presenta los resultados de los estudios de tiempo de retención de ICR, los estudios de
concentración de azúcar (sustrato dual) y la densidad celular. El modelo cinético para ICR se derivó
sobre la base de una reacción de primer orden, flujo pistón y comportamiento en estado
estacionario.

TABLA 8.1. Fermentación continua de sustrato dual (glucosa, xilosa) en ICR a 36 C

donde rA es la velocidad de reacción, k es la velocidad constante, CA es la concentración de
azúcar, z es la longitud axial del reactor y u es la velocidad del fluido a granel. Sustituyendo (8.4.1)
en (8.4.2) los rendimientos.

La ecuación (8.4.3) es una ecuación diferencial lineal de primer orden de concentración y longitud
del reactor. Usando la técnica de separación de variables para integrar (8.4.3) rendimientos.

La figura 8.2 muestra un gráfico de ln en función de la longitud adimensional del reactor para los
datos de fermentación obtenidos a una concentración de alimentación de 15 gl 1 de glucosa y 15
gl1 de xilosa en diferentes tiempos de retención. Se obtiene una línea recta en cada tiempo de
retención. El valor de la pendiente aumentó al aumentar el tiempo de retención debido a la
disminución de la velocidad a través de la columna. La tabla 8.2 también indica que la constante
de velocidad en la reacción de primer orden se fija con diferentes tiempos de retención.

FIG 8.2. Prueba modelo para ICR usando Propionibacterium acidipropionici.

TABLA 8.2. Modelo cinético ICR para inmovilizados Propionibacterium acidipropionici

El caudal de ICR fue de cinco a ocho veces más rápido que el CSTR. La conversión global de
azúcares en el ICR a un tiempo de retención de 12 horas fue del 60%. En este tiempo de retención,
el ICR fue ocho veces más rápido que el CSTR, pero en el CSTR se obtuvo una tasa de conversión
global del 89%. A la tasa de lavado del quimiostato, la ICR dio como resultado una conversión del
38% de los azúcares totales. Además, la tasa de producción de ácido orgánico en el ICR fue
aproximadamente cuatro veces mayor que la del CSTR. A un tiempo de retención más alto de 28
horas, la conversión de glucosa en el ICR y el CSTR es aproximadamente la misma, pero la
conversión de xilosa alcanzó el 75% en el ICR y el 86% en el CSTR.

Nomenclatura

rA Tasa de reacción, g / l.h

k Constante de velocidad, l / h

CA Concentración de azúcar, g / l

z Longitud del reactor axial, cm

u Velocidad del fluido a granel, cm / h

ESTUDIO DE CASO: FERMENTACIÓN DE ETANOL EN UN REACTOR DE CÉLULAS INMOVILIZADAS

UTILIZANDO SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Resumen

La fermentación de azúcar por Saccharomyces cerevisiae, para la producción de etanol en un

reactor de células inmovilizadas (ICR), se llevó a cabo con éxito para mejorar el rendimiento del
proceso de fermentación. La configuración de la fermentación comprendía una columna llena de
perlas de células inmovilizadas. La inmovilización de S. cerevisiae se realizó simplemente mediante
el cultivo celular enriquecido recogido en la fase de crecimiento exponencial. La ICR cargada de
células fijas se realizó en una etapa inicial de operación y las células fueron atrapadas por alginato
de calcio. La producción de etanol se mantuvo estable después de 24 horas de funcionamiento. La
concentración de etanol se vio afectada por la velocidad de flujo del medio y la distribución del
tiempo de residencia de 2 a 7 h. Además, se realizó una fermentación discontinua con una
concentración de glucosa de 50 g / l. Posteriormente, se compararon la producción de etanol y las
productividades del reactor de la fermentación discontinua y las células inmovilizadas. En la
fermentación discontinua, el consumo de azúcar y la producción de etanol fueron 99,6% y 12,5 v /
v después de 27 horas, mientras que en el reactor de celda inmovilizada se obtuvieron 88,2% y
16,7 v / v con 6 horas de tiempo de retención, respectivamente. Se logró una producción de etanol
de casi el 5% con una alta concentración de glucosa (150 g / l) a las 6 horas de tiempo de
retención. Se obtuvo un rendimiento del 38% con 150 g / l de glucosa. El rendimiento mejoró
aproximadamente un 27% mediante ICR y el tiempo de fermentación de 24 horas se redujo a 7
horas. La tasa de crecimiento celular se basó en la ecuación de tasa de Monod. Las constantes
cinéticas (Km y mm) de la fermentación discontinua fueron 2,3 g / ly 0,35 h, respectivamente. El
rendimiento máximo de biomasa sobre sustrato (YX / S) y el rendimiento máximo de producto
sobre sustrato (YP / S) en fermentación discontinua fueron 50,8 y 31,2%, respectivamente. La
productividad de la ICR fue de 1,3, 2,3 y 2,8 g / l h para 25, 35 y 50 g / l de glucosa,
respectivamente. La productividad del etanol en la fermentación discontinua con 50 g / l de
glucosa se calculó como 0,29 g / l h. La producción máxima de etanol en el ICR en comparación con
el reactor discontinuo mostró un aumento aproximado de diez veces. Se comparó el rendimiento
de los dos reactores y se propuso un modelo de tarifas respectivo. La presente investigación
muestra que una alta concentración de azúcar (150 g / l) en la columna ICR se convirtió con éxito
en etanol. Los resultados obtenidos en el ICR con una alta concentración de sustrato son
prometedores para la operación de ampliación. El modelo propuesto se puede utilizar para
diseñar una columna ICR a mayor escala para la producción de altas concentraciones de etanol.

Keywords: reactor de células inmovilizadas (ICR); Saccharomyces cerevisiae; fermentación de

etanol; perlas encapsuladas; alginato de calcio

Introducción

Debido a la disminución de las reservas de combustibles fósiles, las fuentes de energía alternativas
deben ser renovables, sostenibles, eficientes, rentables, convenientes y seguras.1 En las últimas
décadas, la producción microbiana de etanol ha sido considerada como un combustible alternativo
para el futuro porque los combustibles fósiles son agotando. Varios microorganismos, incluido
Clostridium sp. y levadura, los conocidos productores de etanol Saccharomyces cerevisiae y
Zymomonas mobilis, son candidatos adecuados para producir etanol.

Los microorganismos en condiciones de crecimiento anaeróbico tienen la capacidad de utilizar la

glucosa por la vía Embden-Mereyhof-Parnas. Los carbohidratos se fosforilan a través de la vía
metabólica; los productos finales son dos moles de etanol y dióxido de carbono.5 Durante la
fermentación discontinua de Saccharomyces cerevisiae, otros parámetros influyentes pueden
influir negativamente en la tasa específica de crecimiento y la inhibición puede ser causada por la
concentración del producto o del sustrato. La viabilidad de la población de Saccharomyces
cerevisiae, su tasa específica de fermentación y la tasa de absorción de azúcar están directamente
relacionadas con la condición deseada del medio.6 Nagodawithana y Steinkraus han informado
que la adición de etanol al medio de cultivo fue menos tóxico para Saccharomyces cerevisiae que
el etanol producido por los cuerpos celulares. Esto indica que hay otros subproductos metabólicos
que pueden causar inhibición y pueden mostrar impurezas del etanol producido en el sistema de
fermentación. Además, las tasas de muerte fueron más bajas con la adición de etanol puro que en
condiciones similares con la concentración de etanol producido de forma endógena.

Se ha investigado el uso de reactores de biopelícula para la producción de etanol para mejorar la

economía y el rendimiento de los procesos de fermentación.8 Se ha desarrollado la inmovilización
de células microbianas para la fermentación para eliminar la inhibición causada por altas
concentraciones de sustrato y producto, también para mejorar la productividad y el rendimiento
de etanol . Un trabajo reciente sobre la producción de etanol en un reactor de células
inmovilizadas (ICR) mostró que la producción de etanol con Zymomonas mobilis se duplicó.9 La Z.
mobilis recombinante inmovilizada también se usó con éxito con altas concentraciones de azúcar
(12% -15%).

El uso potencial de células inmovilizadas en procesos de fermentación para la producción de

combustible se ha descrito previamente. Si se inmovilizan directamente células microbianas
intactas, se puede omitir la eliminación de microorganismos del producto corriente abajo y se
puede mantener la pérdida de actividad enzimática intracelular a un nivel mínimo.

Recientemente, se ha prestado más atención a la actividad de la biomasa inmovilizada, porque se

ha reconocido que desempeña un papel importante en el rendimiento del biorreactor.12 Con
frecuencia, las células inmovilizadas están sujetas a limitaciones en el suministro de nutrientes.
Por lo tanto, debido a la presencia de materiales heterogéneos como las células inmovilizadas, no
hay flujo convectivo dentro de las perlas y las células pueden recibir nutrientes solo por
difusión.13 La inmovilización de células en una matriz sólida es un medio alternativo de alta
retención de biomasa. Las células se dividen dentro y sobre el núcleo de la matriz.14 El alginato se
usa ampliamente en productos alimenticios, farmacéuticos, textiles y de papel. El alginato se
utiliza en estos productos para espesar, estabilizar, gelificar y formar películas. El alginato de sodio
es un polisacárido lineal, normalmente aislado de muchas cepas de algas marinas marrones y
algas, de ahí el nombre "alginato". El copolímero consta de dos ácidos urónicos o ácido
poliurónico. Comprende principalmente ácido D-manurónico (M) y ácido L-glucurónico (G). El
ácido algínico puede ser soluble en agua o no soluble en agua dependiendo del tipo de sal
asociada. El intercambio de iones de sodio con iones de calcio en la solución puede seguir a la
solidificación del alginato de sodio en una solución de cloruro de calcio. La sal de sodio, otros
metales alcalinos y el amoníaco son solubles en agua, mientras que las sales de cationes
polivalentes, p. Ej. calcio, no son solubles en agua, a excepción de los iones de magnesio.

El propósito de esta investigación fue obtener una alta producción de etanol con altos
rendimientos de productividad y reducir los altos costos operativos. El fermentador de columna
ICR se utilizó con Saccharomyces cerevisiae mediante una técnica de atrapamiento que utiliza
alginato como pared porosa para retener las células de levadura. Se evaluó el efecto de la
concentración inicial de glucosa sobre la producción de etanol por S. cerevisiae. El rendimiento
para la producción de etanol a gran escala se comparó con el etanol producido en la fermentación
por lotes utilizando el mismo microorganismo.

Materiales y métodos
Sistema de reactor experimental

El reactor de celda inmovilizada era una columna tubular de flujo pistón, construida con un
diámetro nominal de 5 cm, un diámetro interno de 4,6 cm, plexiglás de 3 mm de espesor de pared
y 85 cm de longitud. El medio se alimentó a la columna ICR desde un tanque de alimentación
ubicado encima de la columna. Se utilizó una bomba Masterflex de velocidad variable, modelo L /
S Easyload (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, EE. UU.) Para transferir el medio de alimentación desde
una garrafa Nalgene de polipropileno autoclavable de 20 litros (Cole-Parmer, Vernon Hills, IL, EE.
UU.) , el garrafón que sirve de depósito. El efluente de la columna se recogió en una garrafa de
polipropileno autoclavable de 20 litros que sirvió como depósito de producto. Se instaló un
interruptor de flujo entre la columna y la bomba de alimentación, lo que evitó el crecimiento de
microorganismos y la contaminación de la línea de alimentación y el tanque de alimentación. Se
tomaron muestras de la columna ICR de los compartimentos de entrada y salida de la columna. Se
recogió un cultivo de 16 horas en fase de crecimiento exponencial y se mezcló con alginato de
sodio al 2%. La suspensión de cultivo de levadura se convirtió en forma de gotitas mientras se
vertía en un baño al 6% de cloruro de calcio usando una jeringa de 50 ml. Una vez que se añadió la
suspensión al baño, se formaron perlas de alginato de calcio con células atrapadas.11 El lecho
consistía en perlas de 5 mm empaquetadas uniformemente. Las perlas solidificadas se
transfirieron a la columna. Aproximadamente el 70% de la columna estaba empaquetada. El
espacio extra se contó para la expansión del lecho mediante el medio fresco. El volumen vacío se
midió mediante el volumen de agua destilada bombeada a través del lecho. La columna ICR
empaquetada se utilizó en modo continuo durante la fermentación. La alimentación fresca se
bombeó en forma de flujo ascendente, mientras que se controló la concentración de azúcar y
etanol durante el transcurso de la fermentación continua. El volumen de trabajo de ICR después
del envasado aleatorio fue de 740 ml. El volumen del lecho fue de aproximadamente 660 ml. La
configuración experimental del ICR se muestra en la Figura 8.3. No hubo evidencia de fuga celular
de las perlas al medio circundante, la matriz era permeable al sustrato y al producto, el
crecimiento celular y la conversión de glucosa se controlaron en el ICR. Se controló el crecimiento
excesivo de perlas después de unos días de operación.

Se purgó el dióxido de carbono para eliminar el crecimiento excesivo de perlas. El mayor

crecimiento excesivo se produjo en la región de entrada, aproximadamente en los primeros 30 cm
de longitud de la columna, donde la concentración de azúcar era muy alta. Se utilizaron altas
concentraciones de azúcar de 25, 35, 50 y 150 gl. El sobrecrecimiento microbiano se controló
pasando dióxido de carbono a través del lecho. Hubo un aumento máximo del 30% en el diámetro
de las perlas en la parte inferior de la columna, donde la concentración de glucosa era máxima. El
volumen vacío se midió pasando agua esterilizada. Además de la fuente de carbono, el medio de
alimentación consistía en 1 gl de extracto de levadura bombeado desde el fondo del reactor,
mientras que el caudal era constante durante una duración mínima de 24 horas.

Se cultivó un cultivo de semillas de S. cerevisiae ATCC 24860 (American Type Culture Collection,
Manassas, VA, EE. UU.) En un medio de 5 g de glucosa y 0,5 g de extracto de levadura,
respectivamente, 1,5 g de KH2PO4 y 2,25 g de tampón de fosfato de Na2PO4 hasta un volumen
total de agua destilada, 500 ml. El medio se esterilizó a 121 ° C durante 15 min. El cultivo madre de
los microorganismos se transfirió al medio de caldo para la preparación del cultivo de semillas.
Se preparó alginato de sodio (Fisher Scientific, Manchester, Reino Unido) disolviendo 10 g de
forma de polvo en 500 ml de agua destilada. Se disolvió una solución separada de 120 g de cloruro
de calcio en 2 l de agua destilada. La solución de alginato de sodio y cloruro de calcio se esterilizó
en autoclave a 121 ° C durante 15 min. La solución de alginato de sodio esterilizada y la alta
densidad celular del cultivo de siembra desarrollado se mezclaron a fondo. Las perlas se
prepararon mediante gotitas de pipeta con aproximadamente 5 mm de diámetro en una solución
esterilizada de cloruro de calcio. La densidad celular del cultivo de semillas para la preparación de
perlas fue de 3,1 gl. Se midió el peso húmedo y seco de las perlas incubadas durante 16 horas:
3,28 y 0,5 g, respectivamente. El contenido de humedad de las perlas fue del 85%. Las propiedades
físicas y el aspecto de las perlas de S. cerevisiae se resumen en la Tabla 8.3.

FIG 8.3 Diagrama esquemático de la configuración experimental de ICR. Reimpreso de Najafpour

et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

Determinación de la concentración de glucosa

Para determinar la concentración de glucosa de entrada y salida en el ICR, se utilizó un reactivo

químico reductor, solución de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) al 98%. La solución de DNS se
preparó disolviendo 10 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico en una solución de hidróxido de sodio 2 M.
Se preparó una solución separada de 300 g de solución de tartrato de sodio y potasio en 300 ml de
agua destilada. Las soluciones alcalinas calientes de 3,5-dinitrosalisilato se añadieron a la solución
de tartrato de sodio y potasio. El volumen final de la solución de DNS se completó hasta 1 l con
agua destilada. Se preparó una curva de calibración con 2 gl de solución de glucosa15,16.

TABLA 8.3. Propiedades físicas y apariencia de las perlas de S. cerevisiae

Detección de etanol

La producción de etanol en el proceso de fermentación se detectó con cromatografía de gases, HP

5890 serie II (Hewlett-Packard, Avondale, PA, EE. UU.) Equipada con un detector de ionización de
llama (FID) y una columna GC Porapak QS (Alltech Associates Inc., Deerfield, IL , EE. UU.) Malla
100/120. La temperatura del horno y del detector fue de 175 y 185 o C, respectivamente. Se utilizó
gas nitrógeno como portador. Se utilizó isopropanol como patrón interno.

Peso seco y densidad óptica de las células de levadura

En la fermentación discontinua, se recogieron aproximadamente 2 ml de muestra cada 2 horas. La

absorbancia de cada muestra durante la fermentación por lotes se midió a 620 nm usando un
espectrofotómetro, serie Cecil 1000 (Cecil Instruments, Cambridge, Inglaterra). El peso seco de las
células se obtuvo mediante una curva de calibración. El peso seco de la celda fue proporcional a la
turbidez y absorbancia de la celda a 620 nm. La concentración de células (peso seco) de 2,1 gl se
obtuvo del caldo de cultivo de 24 horas, las muestras de células libres con absorbancia de 1,6 a
620 nm.

Escaneo microscópico electrónico de células inmovilizadas

Para las micrografías electrónicas, se tomaron muestras de perlas frescas y perlas de 72 horas de
la columna ICR. Las muestras se sumergieron en nitrógeno líquido durante 10 minutos, luego se
liofilizaron durante 7 horas (EMITECH, modelo IK750, Cambridge, Reino Unido). La muestra se fijó
en un tubo de aluminio y se recubrió con oro-paladio mediante una máquina Polaron modelo
SD515 (EMITECH, Cambridge, Reino Unido) con un espesor de recubrimiento de 20 nm.
Finalmente, la muestra se examinó con microscopio electrónico de barrido (SEM) utilizando un
Stereoscan modelo S360 (SEM-Leica Cambridge, Cambridge, Reino Unido).

Análisis estadístico

El tamaño de las perlas era uniforme y consistente, el tamaño medio de las perlas con alginato al
3% y basado en la medición de 20 muestras; el valor medio del diámetro de las perlas fue de 4,85
mm, con una desviación estándar de 0,3 mm y una varianza calculada de 0,1 mm. La desviación
estándar fue inferior al 5%. Los datos del experimento de fermentación por lotes con 50 gl de
glucosa se presentan en las Figuras 8.4–8.6; fueron replicados tres veces. Los datos de ICR con 25,
35, 50 y 150 gl de glucosa que se llevaron a cabo en una amplia gama de velocidades de flujo son
que se muestran en las Figuras 8.7–8.11, que se repitieron en ejecuciones adicionales. Las
desviaciones estándar de los datos recopilados para los experimentos por lotes fueron de
aproximadamente el 5%, y la desviación estándar de los datos experimentales de ICR con una
concentración de azúcar de 50 gl fue de aproximadamente el 10%. Los datos se analizaron en una
hoja de cálculo, Microsoft Excel 2000. El análisis de error para los datos de ICR con una
concentración de sustrato de 150 gl fue ligeramente mayor, pero estuvo en el rango de 10 a 12%.

FIG. 8.4. Micrografías electrónicas de la superficie exterior de perlas de S. cerevisiae inmovilizadas.

(a) Superficie exterior de las perlas frescas con un aumento de 300 m. (b) Superficie exterior de las
perlas frescas con un aumento de 2000 m. (c) Superficie exterior de las perlas usadas después de
72 horas con un aumento de 300 m. (d) Superficie exterior de las perlas usadas después de 72
horas con un aumento de 2000 m. Reimpreso de Najafpour et al. (2004). Copyright con permiso de
Elsevier.

Fig. 8.5. Micrografías de electrones de la superficie interna de perlas de S. cerevisiae inmovilizadas.

(a) Superficie interior de las perlas frescas con un aumento de 300 m. (b) Superficie interior de las
perlas frescas con un aumento de 2000 m. (c) Superficie interior de las perlas usadas después de
72 horas con un aumento de 300 m. (d) Superficie interior de las perlas usadas después de 72
horas con un aumento de 2000 m. Reimpreso de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso
de Elsevier.

FIG. 8.6. Concentración de glucosa, densidad celular y producción de etanol en fermentación

discontinua con concentración inicial de 50 gl de glucosa en función del tiempo. Reimpreso de
Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

FIG. 8.7. Modelo cinético para fermentación discontinua, diagrama de Langmuir-Hanes. Reimpreso
de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

FIG. 8.8. Actividades relativas de S. cerevisiae en fermentación discontinua. Reimpreso de

Najafpour et al. 2004.18 Copyright con permiso de Elsevier.

FIG. 8,9. Porcentaje, crecimiento de células inmovilizadas con varias cargas iniciales de perlas.
Reimpreso de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

Resultado y discusión
Evaluación de células inmovilizadas

Para preparar células inmovilizadas, se utilizó alginato al 1,5, 2, 3 y 6%. Al presionarlos

manualmente, se probó la dureza y rigidez de las perlas. Los criterios físicos de las perlas
preparadas se resumen en la Tabla 8.1. La concentración de alginato adecuada basada en la
actividad de las perlas para la producción de etanol fue del 2%. El porcentaje en peso de alginato
se relacionó con la penetración del sustrato y del producto en las perlas y el retorno a la masa del
fluido. Las perlas con bajo contenido de alginato (1,5%) eran demasiado blandas y se rompían
fácilmente. Las perlas blandas se presionaron una vez que se cargaron en la columna ICR. Por lo
tanto, no pudieron utilizarse con éxito; también las perlas blandas enfrentaron problemas tales
como crecimiento excesivo y expansión de su diámetro cuando se cultivaron en solución de
azúcar. Las perlas con alto contenido de alginato (6%) eran muy duras y casi irrompibles al
presionarlas manualmente. Eran muy rígidos, por lo que la difusión fue la causa más probable
desde que disminuyó la producción de etanol. Se utilizó alginato al 2% porque las perlas eran lo
suficientemente fuertes como para soportar el peso del relleno en la columna ICR. Las perlas
empaquetadas se usaron en la columna ICR durante 10 días. Las perlas preparadas se refrigeraron
durante 2 semanas y se activaron en una solución de azúcar. Las condiciones de almacenamiento y
la columna ICR no fueron estériles; por lo tanto, existía la posibilidad de contaminación en el
empaque del ICR y en el proceso de activación.

FIG. 8.10. Consumo de glucosa en la columna de células inmovilizadas. Reimpreso de Najafpour et

al. (2004). Copyright con permiso de Elsevier.

FIG. 8.11. Conversión versus tiempo de retención en la columna de células inmovilizadas.

Reimpreso de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

Se tomó una serie de micrografías electrónicas de las perlas frescas e inmovilizadas durante 72
horas. Las superficies exterior e interior de las cuentas se muestran en las Figuras 8.4 y 8.5,
respectivamente. Estas micrografías se utilizaron como indicador comparativo del crecimiento de
levaduras en la superficie del soporte sólido (alginato de calcio al 2%). No hubo una fuga aparente
de células de las perlas a la mayor parte del fluido. También fue evidente que a las 72 horas en el
ICR, la levadura estaba creciendo en la superficie exterior. Por lo tanto, los sitios activos estaban
potencialmente disponibles para la producción de etanol sin problemas de difusión. En la Figura
8.4 se muestra la superficie exterior de las perlas de células inmovilizadas durante 72 horas con
aumentos de 300 y 2000. Una comparación entre perlas frescas y de 72 horas indica que las
células estaban presentes en la superficie, con algunos contaminantes de un organismo de tipo
bacilo, como se muestra en la Figura 8.4d. Esto puede haber ocurrido durante la etapa de
transferencia.

Se comparó la superficie interior de las perlas antes y después de su uso. Inicialmente, las células
quedaron atrapadas dentro de las perlas; después de 72 horas, las células aparentemente
migraron desde el lado interno a la superficie. Las micrografías de los lados internos de las perlas
antes y después de su uso, con aumentos de 300 y 2000, se muestran en la Figura 8.5. Después de
72 horas, las células parecían haber formado nuevas colonias en la superficie de la capa de
alginato. Por el contrario, las superficies estaban completamente cubiertas de colonias después de
72 horas de producción de etanol en el ICR.
Fermentación por lotes

La fermentación de etanol en experimentos por lotes se llevó a cabo por triplicado con 50 gl de
solución de glucosa como única fuente de carbono para S. cerevisiae. El propósito del experimento
por lotes fue comparar la cantidad de concentración de glucosa y la producción de etanol en la
fermentación por lotes y la ICR. La concentración de glucosa disminuyó gradualmente mientras
que la densidad celular y la producción de etanol aumentaron durante 27 horas, como se muestra
en la Figura 8.6. Hubo una fase de retraso de 4 a 6 horas; el consumo de glucosa fue bajo en esta
etapa. Posteriormente, el perfil de concentración disminuyó drásticamente durante la
fermentación por lotes después de 8 a 16 horas. Dado que la densidad celular fue inicialmente
baja, el consumo de azúcar también fue bajo. La curva de crecimiento celular resultante del
experimento por lotes tenía una forma sigmoidea (S-) típica. La densidad celular máxima de S.
cerevisiae en la fermentación discontinua fue de 13,7 gl con una concentración de glucosa de 50
gl. Los rendimientos promedio de biomasa y producto sobre sustratos (YX / S e YP / S) fueron 33 y
32%, respectivamente. La tasa de productividad de etanol durante 24 horas fue de 1,4 g / lh. En la
Figura 8.7 se presenta una gráfica de Langmuir-Hanes basada en la ecuación de tasa de Monod. El
modelo cinético Monod se puede utilizar para biocatalizadores de células microbianas y se
describe a continuación:

Los términos Ks y mm se definen como la constante de Monod y la tasa máxima de crecimiento

específico, respectivamente. Los datos generados en este estudio se ajustaron linealmente con el
modelo, en función de la concentración producida durante la fase exponencial versus el tiempo
(Figura 8.7). A partir de la gráfica, se determinó que la tasa máxima de crecimiento específico y la
constante Monod eran 0,35 h1 y 2,23 gl, respectivamente. El gran valor de la constante de Monod
puede sugerir que a altas concentraciones de sustrato, se produjo más influencia sobre el
complejo de sustrato celular [C.S] disociación que la formación de [C.S].

Actividad relativa La economía de un proceso de células inmovilizadas depende de la vida útil del
microorganismo y de un nivel continuo de producto limpio entregado por las células fijas. Es
importante eliminar las células libres del producto posterior sin el uso de ninguna unidad, como
procesos de centrifugación o filtración. Dado que las células se retienen en la ICR, la actividad de
las enzimas intracelulares puede desempeñar un papel importante. Se supone que la
desactivación de la enzima a temperatura constante sigue una ecuación de primer orden como se
muestra a continuación:

Donde At y A0 son actividades de las enzimas en el tiempo t y el tiempo inicial cero,

respectivamente. Además, kd es la constante de disociación. La gráfica de la actividad relativa
frente al tiempo en la fermentación por lotes con células libres se muestra en la Figura 8.8. El valor
de kd fue 0,36 h1 (Figura 8.8). Según la constante de velocidad de disociación de primer orden, la
vida media de S. cerevisiae, (td ln 2 / kd), en células suspendidas de fermentación discontinua con
50 gl de glucosa fue de 1,95 h. Aparentemente, las células libres se desactivaron completamente
después de 60 horas en operación por lotes. Los datos indican que las células libres se
desactivaron rápidamente en comparación con las células inmovilizadas cuando se usaron en
modo continuo durante más de 7 días.

Configuración del reactor

El volumen del reactor sin perlas fue de 1,4 l. La columna se cargó con las perlas uniformes
solidificadas de S. cerevisiae. El volumen vacío del reactor fue de 660 ml cuando se empaquetó
con perlas inmovilizadas. El crecimiento de perlas con diferentes proporciones de relleno de
columna se muestra en la Figura 8.9. Se bombeó una nueva alimentación de 10 g de solución de
glucosa desde el fondo del reactor. La cantidad óptima de relleno obtenida fue del 65 al 70% del
volumen del reactor. La tendencia de los datos recopilados se asemeja a la curva de crecimiento
de la levadura en cultivo celular suspendido. Los diámetros de las perlas aumentaron con el
aumento de la densidad celular de S. cerevisiae, lo que indica que S. cerevisiae estaba creciendo
dentro del soporte sólido. En estas circunstancias, el sustrato se consumiría fácilmente en la
superficie sólida recubierta con células de levadura inmovilizadas. Por tanto, se esperaba que la
concentración de sustrato en la superficie fuera menor que la concentración de sustrato en el
fluido a granel. El objetivo principal fue determinar si el sustrato penetraba en las perlas. Dado que
la matriz de perlas era bastante porosa, se asumió que el gradiente de concentración era la fuerza
principal que influía en el proceso de transferencia de masa en las células inmovilizadas de S.
cerevisiae. Por lo tanto, se prefirió el sistema de levadura inmovilizada en comparación con las
células libres en la solución. Además, se deben considerar los aspectos económicos de la levadura
inmovilizada, ya que elimina la necesidad de una unidad adicional para la eliminación de células
libres del flujo de producto. Las otras ventajas del sistema de inmovilización son que es posible
que el sustrato no se acumule en la superficie de las perlas y que no haya evidencia de fuga celular
de las perlas.

Efecto de la alta concentración de sustrato en células inmovilizadas

La fermentación se realizó con varias concentraciones de azúcar para aumentar las

concentraciones de producto. Las concentraciones iniciales de azúcar fueron de 25, 35 y 50 gl. El
perfil de consumo de azúcar en el ICR se presenta en la Figura 8.10. Las tendencias de consumo de
azúcar de varias concentraciones de glucosa fueron similares, con una fuerte reducción del
sustrato que se produjo dentro de las primeras 3 horas. Un rango de 55 a 75% de los azúcares se
redujo dentro de un tiempo de retención de 3 horas. Un tiempo de retención de 6 horas indicó
que este era el momento más adecuado para lograr un alto consumo de azúcar. Se requirió un
tiempo de retención más largo para concentraciones de azúcar más altas de hasta 150 gl en la
columna ICR (7 horas) (Figura 8.13). La cantidad de células inmovilizadas con alginato de calcio se
determinó mediante el peso seco de células inmovilizadas y la suposición de que se consideró que
el 98% de las perlas estaban cargadas con células activas. Las perlas se midieron antes de cargarlas
en la columna ICR.

En la figura 8.11 se muestra la conversión de glucosa frente a la velocidad de dilución, utilizada en

el proceso de fermentación continua con S. cerevisiae inmovilizada. A medida que aumentaba la
concentración de azúcar, la conversión puede haber disminuido. A concentraciones muy altas de
azúcar, la conversión de azúcar disminuyó. La conversión máxima de azúcar a las 6 horas de
tiempo de retención se obtuvo de 74,3, 80,5 y 88,2% para concentraciones de glucosa de 25, 35 y
50 gl, respectivamente. A altas concentraciones de azúcar, la conversión estuvo muy influenciada
por la tasa de dilución. La conversión disminuyó a menos del 10% una vez que la velocidad de
dilución se acercó al lavado. La conversión de azúcar a concentraciones bajas de azúcar pareció ser
mucho menos sensible a la tasa de dilución del alimento. La conversión para 25 gl de glucosa fue
constante al 74% durante un tiempo de retención de más de 3 horas (Figura 8.11). La tendencia de
los datos con 50 gl de azúcar mostró que la conversión aumentaba con el tiempo de retención. A
una concentración de azúcar más alta, se requiere un tiempo de retención más largo para lograr
una conversión más alta.

La productividad del reactor se obtuvo dividiendo la concentración final de etanol con respecto a
la concentración de azúcar en un tiempo de retención fijo. Se encontró que las tasas de 1,3, 2,3 y
2,8 glh1 para concentraciones de glucosa de 25, 35 y 50 g / lh eran óptimas. Las productividades
de etanol con diversas concentraciones de sustrato dependían linealmente del tiempo de
retención (Figura 8.12). El factor de proporcionalidad puede haber aumentado mientras
aumentaba la concentración de sustrato. A medida que la concentración de azúcar se duplicó, la
pendiente de la línea de productividad de etanol con 50 gl de azúcar aumentó cinco veces. Estos
resultados indican que la columna ICR tiene una alta capacidad para producir concentraciones
muy altas de etanol. Las concentraciones finales de etanol con 25 y 50 gl de glucosa fueron 7,6 y
16,73 v / v, respectivamente.

Se utilizó una alta concentración de glucosa de 150 gl en fermentación continua con S. cerevisiae
inmovilizada; los datos obtenidos para el consumo de azúcar y la producción de etanol con tiempo
de retención se muestran en la Figura 8.13. A medida que el tiempo de retención aumentó
gradualmente, la concentración de glucosa disminuyó, mientras que el perfil de concentración de
etanol mostró un aumento. Se obtuvo la concentración máxima de etanol de 47 gl con un tiempo
de retención de 7 horas. El rendimiento de la producción de etanol fue aproximadamente del 38%
en comparación con los datos del lote, donde solo se logró una mejora del 8%.

FIG. 8.12. Producción de etanol versus tiempo de retención en la columna de células

inmovilizadas. Reimpreso de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

Conclusión

La producción continua de etanol en un ICR se realizó con éxito con altas concentraciones de
azúcar. En la fermentación discontinua, cuando la concentración de glucosa era de 50 µl, se
producía una inhibición sustancial del sustrato. La ventaja de la ICR fue que la inhibición del
sustrato y el producto no fue aparente incluso con una solución de glucosa de 150 gl en la
alimentación fresca (datos no mostrados). El sistema ICR mostró un mayor rendimiento de
producción de etanol (38%) que el sistema por lotes. La columna ICR dio un alto rendimiento al
procesamiento de piensos con azúcar concentrado. La mayoría de las pruebas experimentales de
ICR dieron como resultado un consumo de glucosa del 82 al 85%.

Los resultados indican que la inmovilización de S. cerevisiae posee la capacidad no solo de utilizar
altas concentraciones de azúcar sino también de producir mayores productividades de etanol
durante el curso de la fermentación continua. La producción de etanol en la columna ICR se
multiplicó por cinco, ya que la concentración de glucosa se duplicó de 25 a 50 gl. Está claro: los
nuevos hallazgos en la presente investigación serían la aplicación de pienso concentrado con una
mayor tasa de producción de etanol, ya que la celda cargada en las matrices de gel de alginato de
sodio mostradas en las micrografías SEM había eliminado las células libres del etanol. flujo de
productos.
FIG. 8.13. Concentración de glucosa y producción de etanol versus tiempo de retención en un
reactor celular inmovilizado con una concentración inicial de sustrato de 150 gl de glucosa.
Reimpreso de Najafpour et al. (2004) .18 Copyright con permiso de Elsevier.

Nomenclatura

 S Concentración de sustrato, gl
 C Concentración de células de microorganismos, gl
 Constante Ks Monod, gl
 µ Tasa de crecimiento específico, g / lh
 mm Tasa máxima de crecimiento específico, h.
 T Tiempo, h
 At Actividad de la bacteria en el tiempo t, célula U / g.
 Ao Actividad inicial de la bacteria, célula U / g.
 kd Constante de disociación, h

FUNDAMENTOS DE LA TECNOLOGÍA DE INMOVILIZACIÓN Y MODELO MATEMÁTICO PARA EL

RENDIMIENTO DE ICR

Es bien sabido que las enzimas puras cambian su comportamiento y estabilidad cuando están
inmovilizadas. En las dos últimas décadas, la inmovilización de microorganismos, células y partes
de células se ha introducido gradualmente en la microbiología y la biotecnología. Las técnicas de
inmovilización celular son modificaciones de las técnicas desarrolladas para las enzimas. Sin
embargo, el mayor tamaño de los microbios ha influido en las técnicas. En cuanto a las enzimas
inmovilizadas, se han utilizado dos tipos amplios de métodos para inmovilizar microorganismos:
fijación a un soporte y atrapamiento.

Inmovilización de microorganismos por enlaces covalentes

Mediante estos métodos, los microorganismos se entrecruzan mediante sustancias químicas, p. Ej.
por glutardialdehído. Las superficies (especialmente las proteínas) de los microorganismos están
unidas con las superficies de otros microorganismos por grupos aldehído del glutardialdehído. Las
células de levadura, por ejemplo, reaccionan con el grupo amino libre o con los grupos amino N-
terminales para formar iminas. Se propuso otro mecanismo de reacción para la adición conjugada
de grupos amino a enlaces dobles de oligómeros insaturados alfa y beta, que están presentes en
soluciones acuosas comerciales de glutardialdehído. Este mecanismo puede explicar la estabilidad
de los vínculos. Mediante esta unión química, la inhibición del crecimiento y las influencias tóxicas
sobre los microorganismos son muy intensas. Estas reacciones se comprenden sólo en parte y
pueden conducir a la descomposición o muerte de los microorganismos.

Transferencia de oxígeno a microorganismos inmovilizados

La disponibilidad de oxígeno es uno de los parámetros más importantes que se diferencian de los
microorganismos inmovilizados y libres. Los organismos libres pueden obtener oxígeno
directamente del aire circundante o, en la mayoría de los procesos técnicos, del líquido,
especialmente el agua, que contiene oxígeno disuelto. La transferencia molar de oxígeno con
respecto al tiempo, dO2 / dt, se puede describir mediante la siguiente ecuación:
KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de masa de oxígeno, debido a la transferencia
de oxígeno desde la fase gaseosa o aire, cg, la superficie de las células, cx oa la transferencia de
oxígeno disuelto en agua a la superficie de las células.

En principio, se puede aplicar la misma fórmula a microorganismos inmovilizados, pero aquí las
condiciones son bastante diferentes. Las células adsorbidas forman películas microbianas o de
espesor variable durante un breve tiempo de incubación. El oxígeno debe ser transferido a estos
microfilms, por lo que existen zonas de diferente concentración de oxígeno en las películas, en las
que el crecimiento de los microorganismos varía en relación directa con la concentración de
oxígeno. Al utilizar el modelo de estado inestable, se ha informado que la profundidad máxima de
penetración de oxígeno para las células inmovilizadas muy empaquetadas está en el rango de 50 a
200 m.

Transferencia de sustrato a microorganismos inmovilizados

En un biorreactor de células inmovilizadas, pueden existir gradientes de concentración de sustrato

significativos. Las células están ubicadas cerca del suministro de nutrientes, que es probable que
mantengan una mayor calidad y actividad que las células ubicadas relativamente más lejos, lo que
lleva a una diferenciación en la calidad o actividad de la población celular inmovilizada. Esta
diferenciación es más pronunciada si existen regiones de inanición (concentración de sustrato
prácticamente nula) dentro del reactor. Los enfoques típicos para medir difusividades en sistemas
de células inmovilizadas incluyen métodos de perlas, cámaras de difusión e interferometría láser
holográfica. Estos métodos se pueden aplicar a varios materiales de soporte, pero requieren
mucho tiempo, lo que hace que sea oneroso medir la difusividad efectiva (Deff) en una amplia
gama de fracciones celulares. Debido a los modelos matemáticos involucrados, la deconvolución
de difusividades puede ser muy sensible a errores en las mediciones de concentración. Existen
correlaciones matemáticas desarrolladas para predecir Deff en función de difusividades en caldo y
dentro de las células (D0, Dc). La relación también se puede utilizar para extrapolar las mediciones
de Deff de una fracción celular a cualquier otra fracción celular. En la tabla 8.4 se han recopilado
varios valores de D0 / Dc para una variedad de sistemas de células inmovilizadas. Estas relaciones
de difusividad para sistemas específicos (es decir, especies en difusión, tipo de célula y material de
gel) facilitan la predicción de los valores de Deff para una amplia gama de condiciones operativas.
Para algunos sistemas, las relaciones de difusividad son muy grandes. La relación de difusividad
infinita corresponde a un soluto en difusión que no entra en las células (es decir, Dc 0); estos casos
se observaron con grandes moléculas de disacárido (galactosa), polisacáridos y células de Z.
mobilis (cuadro 8.5).

TABLA 8.4. Métodos de inmovilización.

Crecimiento y formación de colonias de microorganismos inmovilizados

Varios científicos señalaron que los microorganismos inmovilizados difieren en sus tasas de
crecimiento y muestran formas morfológicas de colonias alteradas. Las células adsorbidas forman
micro y macropelículas en las que los microorganismos de la región externa tienen una morfología
diferente a la de la región interna. Estos microfilmes suelen mostrar diferentes formas de colonias
en relación con su densidad. Las películas gruesas tienen un carácter viscoso, las películas delgadas
a menudo muestran la presencia de microorganismos individuales. Estas características se pueden
observar con bacterias, levaduras y mohos. Son causadas por diferentes concentraciones de
oxígeno y concentraciones limitadas de nutrientes. Haciendo referencia a nuestro trabajo anterior
sobre ICR, 1 se puede obtener un modelo matemático para el rendimiento de ICR aplicando un
balance de masa sobre un diferencial de la columna:

Donde es el volumen vacío de la columna empaquetada (ml), CA la concentración de sustrato (gl ),

u la velocidad del fluido a granel (cmh), z la longitud del reactor axial (cm) y rA la tasa de sub-
transferencia de estratos a película microbiana (glh). Suponiendo un comportamiento de flujo de
pistón y de estado estable, (8.7.4.1) se reduce a flujo de pistón. El comportamiento de flujo de
pistón se ha demostrado en este tipo de reactor mediante el uso de estudios de trazadores (Tabla
8.6).

TABLA 8.5. Células microbianas unidas covalentemente a varios soportes.

TABLA 8.6. Estudios experimentales de difusión en sistemas celulares inmovilizados y sus valores
asociados de D0 / Dc

La velocidad de reacción para sistemas de fermentación simples normalmente viene dada por la
ecuación de Monod. Este modelo indica que la tasa de conversión específica es constante cuando
se aplica a un sistema celular inmovilizado (Tabla 8.7). Si se utiliza una ecuación de tasa de primer
orden para el consumo de azúcar, (8.7.4.2) se obtiene:

La ecuación (8.7.4.3) es una ecuación diferencial lineal de primer orden para la concentración y la
longitud del reactor. Después de la separación de variables, la ecuación se puede integrar como

La integración de la ecuación diferencial anterior produce:

Por lo tanto, debería existir una relación lineal entre ln (CA / CA0) y la longitud del reactor si el
modelo describe con precisión el reactor de celda inmovilizada. Los datos experimentales que se
ajustan al modelo se discutieron anteriormente.

TABLA 8.7. Productividad de etanol de sistemas inmovilizados

Sistemas inmovilizados para la producción de etanol

La ventaja más significativa de los sistemas de células inmovilizadas es la capacidad de operar con
alta productividad a tasas de dilución que exceden la tasa de crecimiento específica máxima
(mmax) del microbio. Se han propuesto varias teorías para explicar la fermentación mejorada
capacidad de los microorganismos como resultado de la inmovilización. Una reducción en la
concentración de etanol en el microambiente inmediato del organismo debido a la formación de
una capa protectora o adsorción específica de etanol por el soporte puede actuar para minimizar
el efecto final. inhibición del producto. Alternativamente, la inhibición del sustrato puede
disminuir en el caso de una matriz de gel, si la velocidad de fermentación alcanza o supera la
velocidad de difusión de glucosa a la célula. Una tercera posibilidad es que la alteración de la
membrana celular durante la inmovilización proporcione una transferencia mejorada del sustrato
al interior y del producto del microbio. El efecto de la temperatura sobre la tasa de producción de
etanol es marcadamente diferente para los sistemas libres e inmovilizados. Así, mientras se
observa un aumento constante en la tasa con libre S. cerevisiae a medida que la temperatura
aumenta de 25 a 42 ° C, se produce un máximo a 30 ° C con células inmovilizadas en alginato de
sodio. La temperatura más baja óptima para los sistemas inmovilizados puede resultar de las
limitaciones de difusión del etanol dentro de la matriz de soporte. A temperaturas más altas, la
producción de etanol excede su tasa de difusión, por lo que la acumulación ocurre dentro de las
perlas. El logro de niveles inhibidores provoca entonces las disminuciones observadas en la tasa de
producción de etanol. También son evidentes diferencias significativas en el efecto del pH sobre la
velocidad de fermentación. La característica óptima de pH estrecho de un sistema de células libres
se reemplaza por un rango extremadamente amplio tras la inmovilización. Este efecto se debe al
gradiente de pH que existe dentro de la perla.