Práctica 12.

Inmovilización enzimática
Integrantes: Etzuly Luna Hernández, Luis Alejandro
Peralta Gutierrez, Susana García Kunz
Docente: Dr. En C. Fernando Uriel Rojas Rojas
Asignatura: Tecnología Enzimática
Fecha de entrega: 11/6/2019
Periodo: 01/2019

Resumen
La inmovilización de enzimas es utilizada en un amplio rango de actividades en la industria, siendo
muy funcional para una mejora significativa en cuanto a la estabilidad de las enzimas, facilitando el
empleo de estas, hay distintas formas de poder inmovilizar una enzima, dependiendo del método
utilizado, clasificándose en física, química y de adsorción. En esta práctica se busca inmovilizar a la
invertasa por medio de esferas de alginato. Para este método se utilizó un buffer de acetatos para
mantener el pH correcto aumentando aún más la estabilidad de la enzima, alginato de sodio, y cloruro
de calcio que ayuda al “atrapamiento” de la enzima realizando dos veces el procedimiento, pero
obteniendo esferas de alginato sin enzima (control) y otro con la enzima dentro de las esferas de
alginato.
Palabras clave: Alginato de sodio, inmovilización, control, cloruro de calcio

Introducción
La biotecnología ha experimentado a grandes  Activos a temperatura ambiente y a
avances por lo que sus aplicaciones presión atmosférica.
industriales han cambiado de manera algo  Solubilidad en agua
drástica. Los procesos en los cuáles se utilizan
A pesar de ser muy funcionales en condiciones
enzimas, haciendo reacciones más rápidas
de trabajo estas pueden no ser nada estables
para minimizar tiempos son cada día mas
presentando una barrera para su uso, por lo
numerosos, siendo aún mas utilizados ya que
que la inmovilización de las enzimas ayuda a
los catalizadores no biológicos a pesar de ser
mantener esa estabilidad necesaria en los
muy funcionales, tienen ciertas desventajas
procesos industriales.
que los biológicos no tienen, como:

Inmovilización enzimática.
 Presentación de actividad catalítica
 Gran especificidad del sustrato, Proceso en el que se confina o localiza una
siendo, enzima en una región definida del espacio,
para llegar a formas insolubles en agua
reteniendo la actividad catalítica para poder
Unión covalente
ser reutilizadas repetidas veces.
Entrecruzamiento de la enzima y el material
Se pueden clasificar en tres formas de
de soporte produciendo un enlace fuerte y
inmovilización
estable
 Adsorción
Este enlace es producido entre el grupo
 Físico (matriz)
funcional de la matriz del soporte y la
 Químico
superficie de la enzima que contiene residuos
de aminoácidos.
Los principales soportes son:
 Agarosa
 Policloruro de vinilo
 Sílica
 Celulosa
 Óxido de hierro
 Nanotubos

Fig. 1 Adsorción enzimática Adsorción

Este método pone a las enzimas en contacto
con el soporte adsorbente (24-48 hrs),
posteriormente este se lava y se eliminan
aquellas que no se inmovilizaron. Esto se
lleva a cabo por fuerzas de Van der Waals o
por puentes de hidrógeno.

- Adsorción por intercambio iónico

Toman iones de la solución cediendo
Fig. 2 Inmovilización por atrapamiento cantidades equivalentes de iones ácidos o
básicos. Utilizando celulosa, quitosano o
resinas de intercambio iónico.

- Adsorción por hidrofobicidad

Esta es impulsada por la entropía basándose
por fuerzas de hidrofobicidad del adsorbente
y la proteína.
La hidrofobicidad es regulada por el grado de
sustitución del soporte y tamaño de la
Fig. 3 Inmovilización química (unión
molécula del ligando hidrofóbico.
covalente)
 Atrapamiento
Este es basado en la inclusión de enzimas por
diferentes uniones dentro de geles o fibras. Su
desventaja es el transporte de los sustratos y
la recuperación de los productos.
El proceso se lleva a cabo mediante la
suspensión de la enzima en una solución del
monómero. Seguidamente se inicia la
polimerización por un cambio de
temperatura o mediante la adición de un
Fig. 5 Esferas de Alginato de Calcio con
reactivo químico. El atrapamiento puede ser colorante
en geles o en fibras, que suelen ser más
resistentes que los geles. En el primer caso, la OBJETIVOS
enzima queda atrapada en el interior de un
- General
gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las Realizar una inmovilización enzimática por
microcavidades de una fibra sintética. medio de atrapamiento por Alginato de Calcio
- Específicos
Comprender el fundamento de la
inmovilización por alginato y sus aplicaciones
en la industria
Realizar esferas de alginato con invertasa
Realizar esferas de alginato sin invertasa
Almacenar para futura prueba de actividad
enzimática
Fig. 4 Métodos de atrapamiento de enzimas METODOLOGÍA
Alginato de Calcio
Preparar por grupo 100
Este propicia un ambiente óptimo para la mL de una solución de
enzima aumentando estabilidad mecánica. invertasa en buffer de
acetatos
El proceso de formación del gel se inicia a
partir de una solución de sal de alginato y una
fuente de calcio externa o interna desde
donde el ión calcio se difunde hasta alcanzar
la cadena polimérica, como consecuencia de Agregar alginato de sodio
esta unión se produce un reordenamiento (0.5%) a la solución de
estructural en el espacio resultando en un invertasa y refrigerar por
material sólido con las características de un 20 minutos.
gel. El grado de gelificación depende de la
hidratación del alginato y la concentración
del ión calcio.
 Preparar por equipo Resultados
Preparar por
500 mL de una
grupo 100 mL
solución de cloruro
de una solución
de calcio (0.65%)
de alginatode
en agua y refrigerar
sodio (0.5%).
por 20 min.

Tomar con jeringa

agregar por goteo
una alícuota de 15
a 250 mL de la
mL de la solución
solución de
de invertasa en
cloruro de calcio
buffer de acetatos y Fig. 6 Esferas de alginato sin enzima

Tomar una alícuota de

15 mL de la solución
de alginato de sodio y
agregar por goteo a
250 mL de la solución
de cloruro de calcio

Prueba de actividad
enzimática
Fig. 7 Esferas de alginato con enzima
disgregadas y sin
disgregar

Soluciones
1. Buffer de acetatos
Sol. A: Ácido acético 0.2M (5.77mL en 500
mL)
Sol. B: Acetato sódico (8 g de sal anhidro)
pH 5 🡪14.8 mL sol A + 32.2 mL sol B + 50 mL
agua destilada
2. Alginato de sodio 0.5%
0.5 g cbp 100 mL de agua destilada

3. Cloruro de calcio 0.65%

3.25 g cbp 100 mL de agua destilada Fig. 8 Resultado final de esferas

Se muestran esferas incoloras con y sin

enzimas encapsuladas
Análisis de Resultados
El alginato de Sodio reacciona de manera
directa con el Cloruro de Calcio formando
esferas incoloras al adicionar el alginato por
goteo, siendo esto una forma de
inmovilización física. Como se puede mostrar
en la Fig. 6 el alginato que se agregó al
Cloruro no contenía enzimas, esto sirviendo
como un blanco o control en pruebas futuras,
mientras que en la Fig. 7 el alginato contenía
la enzima (invertasa), visualmente no se
observa ninguna diferencia entre las esferas,
la diferencia se notaría hasta las pruebas de
actividad catalítica.
En la Fig. 8 se aprecian mas ya que realmente
son esferas de muy pequeño tamaño.
Conclusión
Se inmovilizaron enzimas (invertasas) con un
método físico de Alginato de Calcio, para
estabilizarla y poder realizar una prueba de
actividad catalítica mas adelante.
Referencias
DR. MIGUEL ARROYO. (1998). Inmovilización
de enzimas. Fundamentos, métodos y
aplicaciones. Ars Pharmaceutica, 39, 23-39.
06 Junio 2019, De Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de
Ciencias Biológicas Base de datos

Bryshila Lupo Pasin1 *, Carmen González

Azón2 , Alicia Maestro Garriga2. ( Enero-
Junio, 2012). Microencapsulación con
alginato en alimentos. Técnicas y
aplicaciones. Revista Venezolana de Ciencia y
Tecnología de Alimentos., 3, 130-151. 06
Junio 2019, De © Asociación RVCTA, 2012.
RIF: J-29910863-4. Depósito Legal:
ppi201002CA3536. Base de datos.