UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE

HUAMANGA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA

ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE INGENIERÍA EN

INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

BIOTECNOLOGÍA (TA-559)

PRÁCTICA 07

“INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS DE FUENTE MICROBIAL

(LEVADURA)”

PROFESOR : Ing. Tiburcio REYNOSO ALBARRACÍN.

AUMNOS : CUTIPA HINOSTROZA, Tatiana

MEDRANO CALLE, John Kenedy
SANCHEZ QUISPE, Edison

GRUPO DE PRÁCTICA : MARTES 02 – 05 PM

AYACUCHO - PERÚ
2017
 INTRODUCCIÓN
En los últimos años, la biotecnología ha experimentado grandes avances y, paralelamente
sus aplicaciones industriales en la obtención de productos químicos, en la industria
alimentaria y farmacéutica.
Los procesos catalizados por enzimas en la industria son cada día más numerosos, ya que
presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos:
 Presentan una gran actividad catalítica;
 Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselectividad y
regioespecificidad);
 Son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica. A pesar de estas claras
ventajas, el empleo de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos
industriales debido a que la mayoría de las enzimas no son estables en las condiciones
de trabajo. Por otra parte al ser solubles en agua, su separación de los sustratos y
productos es difícil, y por tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilización de las
enzimas se han podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el
proceso biotecnológico sea económicamente rentable.

La invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26),

cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-Dfructofuranosídicos de
fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, la
sacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominación
trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los
productos de la reacción son conocidos desde antiguo como “azúcar invertido” ya que
mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que
resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo que en el proceso se origina un cambio de
signo (de positivo a negativo) del valor de rotación óptica. Sacarosa ([α] D= +66,5º) + H2O
> D-glucosa ([α] D= +52,5º) + D-fructosa ([α] D= -92º) La invertasa es un enzima
ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y
vegetales, jugando un papel importante en el catabolismo de fructanos y más
específicamente en el de la sacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos
azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía.
 I. OBJETIVOS
 Inmovilizar las enzimas de fuente microbial (levadura) e invertasa
 Inmovilizar enzima en soporte de alginato de sodio

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

Inmovilizar enzimas es fijar las enzimas en soportes con la finalidad de conservar en
procesos continuos de fermentación el método consiste en fijar las enzimas por
atrapamiento en la cual la enzima queda fijo dentro de una esfera conservando todos sus
propiedades para un nuevo proceso. En la práctica se utilizará el atrapamiento en micro
cápsula, pero existen otros métodos químicos formando enlaces iónicos o covalentes.

2.1. INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS

Confinamiento físico de una enzima o célula en una determinada región del espacio, de
manera que su actividad catalítica se retenga, y pueda ser reutilizada.

La inmovilización de levaduras en perlas de alginato y poliacrilamida se ha utilizado con

éxito en la fermentación de vino blanco y en la producción de etanol (Cachon y Divies,
2001). Debido a cambios en la composición de las células por interacción con el soporte
de alginato, estos catalizadores se vuelven más activos y se observa que la fermentación
ocurre a mayor velocidad respecto a los casos en los que se emplean levaduras libres
(Galazzo y Bailey, 1990). Otra ventaja importante de estos sistemas inmovilizados es
que el soporte protege la levadura de la acción de inhibidores, metales pesados, fenoles y
temperaturas extremas. Además, a diferencia de los floculos de biomasa, estos solidos al
ser más sencillos de manejar, permiten un mejor control de la actividad catalítica en
reactores de tipo lote y continuos.

2.2. REQUISITOS MÍNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN

BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO
 descripción general.
 esquema de reacción
 enzima y microorganismo
 tipo de soporte
 método empleado para la inmovilización
 preparación del catalizador inmovilizado.
 método de inmovilización, condiciones de reacción.
 rendimiento por peso seco, actividad del

2.3. CARACTERIZACIÓN FÍSICO- QUÍMICA.

 forma del biocatalizador
 diámetro medio de partícula húmeda
 capacidad de hinchamiento
  comportamiento en columnas (compresibilidad)
 abrasión en reactores agitados
 abrasión en reactores de lecho

2.4. CINÉTICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.

 estudio de la variación de la velocidad inicial de reacción frente a la variación de
las concentraciones de enzima y de sustrato.
 efecto del tipo de buffer y del pH.
 limitaciones difusionales en el sistema (efecto del tamaño de partícula y la carga
enzimática).
 grado de conversión frente a tiempo de residencia.
 estabilidad del biocatalizador en el almacenamiento velocidad inicial residual
tras el almacenamiento a diferentes tiempos en diferentes condiciones.)
 estabilidad operacional (velocidad inicial residual después de diferentes ciclos
catalíticos).

Figura 01: principales métodos de inmovilización de enzimas

2.5. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN

Se suelen clasificar en dos grandes categorías:
2.6. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR RETENCIÓN
FÍSICA

2.6.1. Retención física = atrapamiento

 Atrapamiento en matrices.
 En geles o polímeros.
 Micelas reversas.
 Atrapamiento en membranas.
 En fibras huecas.
 En reactores de membrana.

2.6.1.1. Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz
sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fotoentrucruzables o polímeros
del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El
proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una
solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de
temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en
geles o en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la
enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética.
2.6.1.2. Inclusión en membranas: Dividida en dos tipos:

 Microencapsulación: En esta técnica, las enzimas están rodeadas de membranas

semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no
de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas
por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes,
también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma
esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 um de diámetro. Mediante este
método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas,
células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones
que suceden en múltiples pasos.

 Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan

enzimas atrapadas ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores
emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato
inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece
un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor.

2.6.2. MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS POR UNIÓN

QUÍMICA

 Enlaces covalentes
 Enlaces no covalentes. Adsorción.
 Reticulado (cross-linking)

2.6.2.1. Unión a soportes

Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone de una mayor
información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilización
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplie el intervalo de pH
óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe
tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser
fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado
una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas
enzimas. Estos materiales difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque
generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas, fibras y más
corrientemente en forma de esferas.

2.7. ELECCIÓN DEL MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN

Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos
enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas
en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información disponible en la
actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización
(Tabla 1) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada aplicación específica.
La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de
reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros
factores.

Tabla 1: comparación de los diferentes métodos de inmovilización.

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan
biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos
como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es
débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que
deben ser repuestos continuamente.

2.8. REQUISITOS LÓGICOS MÍNIMOS

 La enzima o célula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.
 Si se emplean agentes entrecruzantes, éstos no deben afectar al centro activo. Si
pudieran interferir con éste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo más grande
posible.
 Si es posible, se debería proteger el centro activo:
 si existen grupos -SH, éstos deben hacerse reaccionar con cisteína o glutation, para
reactivarse posteriormente tras la inmovilización.
 se puede realizar la inmovilización en presencia de concentraciones saturantes de
sustrato.
 El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.
 Coherencia con la posterior biotransformación.
 si soporte = polianión, la conversión de un sustrato aniónico será muy difícil
(repulsión).
 enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el
resultado será malo.
 Gran importancia de las propiedades mecánicas (estabilidad del soporte, forma
física del mismo).
 El soporte debe presentar una alta superficie específica, para minimizar los
problemas de transferencia de materia.
 El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la
contaminación microbiana.
 El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto
"loading")
 El soporte debe ser comercialmente accesible:
 bajo precio
 buena disponibilidad

2.9. UTILIZACIÓN DE ALGINATO DE SODIO.

En los últimos años se ha prestado considerable atención a la preparación de enzimas
inmovilizadas por lo que se han desarrollado diversos soportes y técnicas de
inmovilización
Entre estas técnicas podemos mencionar la gelación iónica, la cual consiste en extrudir
una solución de alginato de sodio a través de una aguja para formar gotas que se hacen
caer en una solución entrecruzante de cloruro cálcico en este sentido, las enzimas
inmovilizadas presentan diversas ventajas sobre las enzimas en solución libre ya que a
través de este método se facilita la recuperación y reutilización de las enzimas. La
mexicaína es una proteasa de origen vegetal de tipo cisteínico aislada del látex de los
frutos de J. mexicana, esta enzima es capaz de competir favorablemente en aplicaciones
industriales donde se emplea la papaína. El objetivo de este trabajo fue caracterizar el
atrapamiento de mexicaína en una matriz de alginato, empleando el método de gelación
iónica y estudiar la influencia de la concentración del polímero sobre el rendimiento de
producción y el índice de inmovilización.

2.10. METODOLOGÍA
Se prepararon tres soluciones de alginato de sodio (1, 1.5 y 2%), posteriormente cada
solución fue mezclada con una preparación enzimática (mexicaína) en una proporción
1:1, en seguida se inició el goteo sobre una solución de cloruro de calcio 0.1 M para
obtener las esferas. El análisis del tamaño de las esferas se determinó empleando la
técnica del tamizado. Las esferas fueron observadas con un microscopio estereoscópico
Carl Zeiss y óptico OLYMPUS (40x). Se determinó el índice de inmovilización y el
rendimiento de producción de acuerdo a Calero y col. 2008.

2.11. Índice de inmovilización

fue directamente proporcional a la cantidad de polímero empleada, observando que a
una concentración de 2% el índice fue del 90%, esto puede atribuirse a que existe
 una gelificación más completa debido a que hay una mayor concentración de
unidades de ácido gulúronico que actúan con los iones calcio originando que la
estructura de la matriz sea más firme. En cuanto al rendimiento de producción este
fue mayor al emplear una concentración de alginato al 1%, esta dispersión fue más
fácil de manipular debido a que presentó un valor de viscosidad inferior (387.6 cp)
en comparación con las otras dos concentraciones de soporte empleadas (1.5 % y
2.0%) mostrando valores de 1346 cp y 3240 cp respectivamente.

III. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. MATERIALES
 1 matraz erlenmeyer de 250 mL.
 1 vaso de 250 mL
 1probeta de 100 mL
 1 pipeta de 10 mL
 Papel filtro
 Embudo
 Vaso de 100 mL
 Matraz de 100 mL

3.2. REACTIVOS
 Alginato de sodio
 Cloruro de calcio
 Agua destilada
 Solución de enzima

3.3. MÉTODOS

3.3.1. Procedimiento experimental

  Prepare en un matraz de 100mL 20mL de alginato de sodio al 2% y caliente a 45ºC
por 10 minutos, luego dejar enfriar.
 En otro matraz de 100 mL prepare solución de 20 mL de cloruro de calcio al 2%
 En otro matraz de 250 mL saque 20mL de levadura que ha preparado anteriormente,
luego a la solución de enzima añada 20 mL de alginato de sodio y homogenice toda
esta solución.
 Si es posible calentando un poco a 30ºC a continuación enfríe y añada gota a gota
solución de cloruro de sodio preparado utilizando una pipeta y después de un
tiempo observara la formación de esferas de alginato de calcio y dentro de estas
esferas contendrá las enzimas inmovilizadas.
 Luego filtre cuidadosamente las esferas y después de lavar con agua destilada
guarde en el matraz para la siguiente practica en refrigeradora.

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la práctica se realizó la inmovilización de enzimas por método físico, utilizando el
alginato, lo cual se realizó un atrapamiento de la enzima deseada, se puede observar en
la figura 3. Entre estas técnicas podemos mencionar la gelación iónica, la cual consiste
en extrudir una solución de alginato de sodio a través de una aguja para formar gotas
que se hacen caer en una solución entrecruzante de cloruro cálcico en este sentido, las
enzimas inmovilizadas presentan diversas ventajas sobre las enzimas en solución libre
ya que a través de este método se facilita la recuperación y reutilización de las enzimas.
En donde el proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la
enzima en una solución del monómero. Seguidamente se inicia la polimerización por un
cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico.

Figura 3: atrapamiento de la enzima con alginato.

Figura 4: formación de esferas de alginato de calcio
 En la figura 4 se observa la formación de las perlas de las enzimas de caña de
azúcar, donde se obtuvieron esferas con un intervalo de diámetros entre 1.41 a 2.38
mm, estos resultados coinciden con lo reportado por Calero y col. (2008) ya que
mencionan que la gelificación iónica permite obtener tamaños de cápsulas que van
desde 1 a 5 mm.
10 equivalente a una abertura del tamiz de 1.68 mm con valores que van de 73 a
80%.
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a
numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para
todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información
disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de
inmovilización (Tabla Nº01) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada
aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la
reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato
que tenga que ser procesado y otros factores

Tabla 1: comparación de los diferentes métodos de inmovilización

En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan

biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más
sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el
soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de
actividad y que deben ser repuestos continuamente.

V. CONCLUSIONES
 Se inmovilizo enzimas para uso continuo en procesos de fermentación.
 Se inmovilizó enzimas de fuente microbial, se formaron las perlas.
 Se logró determinar que los parámetros más importantes en la inmovilización de
las enzimas son los controles en la temperatura y concentración de la solución
del alginato de sodio que se preparó.
VI. BIBLIOGRAFÍA
 Arroyo, Miguel (1999) “Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y
Aplicaciones”. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de
Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid.

 Arroyo, Miguel et al. (2000) “Thermal stabilization of immobilized lipase B from

Candida antarctica on different supports: effect of water activity on enzymatic
activity in organic media Enzyme Microb Technol. 2000.24:3–12.

 Universidad Nacional de Quilmas (2005) “Bioprocesos II 2005 Segundo semestre”

Departamento de Ciencia y Tecnología

 Dra. Ana Blandino Garrido, Obtención y uso de las enzimas en la industria.

Actualización en conocimientos de Biología Molecular y Biotecnología.

 Vallejo Becerra V, Calixto Romo MA, Vega Estrada J, Montes Horcasitas MC e

Hidalgo Lara ME. (2005) “Efecto de la remocion del tag- s en la cristalizacion de
la invertasa recombinante DE Zymomonas mobilis” Depto. de Biotecnología y
Bioingeniería, CINVESTAV.