TÉCNICAS ANALÍTICAS

BASADAS EN ENZIMAS
INMOVILIZADAS

Bioquímica QFB 43
Aguirre Castañeda Lidia Areli
González Maya Kenya Ivonne
Pérez Blas Saraí
 Enzima inmovilizada
 Una enzima inmovilizada es aquella que se encuentra
confinada en un espacio definido en el que se retiene su
actividad catalítica y puede ser reutilizada continuamente
 Nos permite que el biocatalizador sea fácilmente separado de la
reacción, a diferencia si esta en solución.

Aspectos generales
 La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se localiza a la enzima en una región
definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica
y que pueden ser reutilizadas repetidamente.
 Antecedentes
 1815 Primer intento utilizando el ácido acético y el tratamiento de aguas residuales.
 1985 Inmovilización de múltiples enzimas incluyendo un cofactor y la inmovilización de
células.

Componentes principales de un sistema inmovilizador enzimático son:

 La enzima
 La matriz o soporte
 El método de fijación
 Reactor
Ventajas Desventajas

El aumento de la estabilidad de la enzima La alteración de la conformación de la

enzima respecto de su estado nativo
La reutilización del derivado, disminuyendo La gran heterogeneidad del sistema enzima-
los costes del proceso soporte donde pueden existir distintas
fracciones de proteínas inmovilizadas con
un diferente número de uniones al soporte.

La posibilidad de diseñar un reactor Pérdida de actividad de la enzima durante la

enzimático de fácil manejo y control, pon la inmovilización.
posibilidad de emplear cargas elevadas de
enzima, la cual mantendrá su actividad
durante más tiempo
El biocatalizador es más caro que la enzima
nativa.
 Efectos en la actividad enzimática

 La actividad enzimatica puede disminuir e incluso perderse por diversas razones. Si pierde
ser debido a que:
 La unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está
impedido.
 Los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del
centro activo o que sea esencial para la actividad catalítica
 La inmovilización puede originar un cambio conformacional.
 Las condiciones experimentales del proceso
Efectos en la estabilidad

 Generalmente se observa un incremento debido a:

 Una estabilización conformacional de la enzima por la existencia de uniones
multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor
rigidez y se hace más resistente a la desactivación térmica o química
 Una protección frente a las proteasas en el medio.
 Se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en
una determinada región del espacio.
 Una alteración del microentorno del enzima debida a la interacción de la enzima con el
soporte.
Tecnicas de inmovilización
 Métodos Químicos
 Son aquellos procedimientos que involucren la formación de al menos un enlace covalente
o parcialmente covalente entre una o varias moléculas enzimáticas y un polímero insoluble
en agua.
 Métodos Físicos
 Son aquellos procedimientos que involucran la fijación de una enzima en un soporte, sin la
formación de un enlace covalente.
 Técnica de Atrapamiento en Gel
 Consiste en dar lugar a la formación de un gel en presencia de la enzima. En condiciones
optimas de modo que quede atrapado en la matriz de gel con poros grandes para su
difusión y transformación del sustrato.
 Adsorción
 Se basa en enlaces débiles aunque tiene cierta eficiencia en los procesos, intervienen fuerzas de
Van der Waals, interacciones iónicas e hidrofóbicas y puentes de hidrógeno. Tiene
inconvenientes como alta tasa de fuga del biocatalizador, enlace inestable, por lo que no es
reproductible, así como es susceptible a cambios de temperatura, pH, etc.
 Atrapamiento
 Consiste en la inclusión de la enzima por unión covalente o no, dentro de geles o fibras.
 Unión covalente
 Se basa en el entrecruzamiento de la enzima y el material del soporte produciendo un enlace
fuerte y estable. El enlace covalente es formado entre el grupo funcional de la matriz del soporte
y la superficie de la enzima que contiene residuos de aminoácidos.
 Entrecruzamiento
 Consiste en la formación de una gran estructura tridimensional compleja entre las mismas
moléculas de la enzima por medios físicos o químicos.
 Microencapsulación
 Las enzimas estan rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de
moleculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Alta selectividd, no es afectado por
pH, temperatura, etc.
  El reactor enzimático
 Es el recipiente en el cual se lleva a cabo una reacción catalizada por enzimas o células
libres o inmovilizadas. El cual provee la unión central entre el lote de alimentación inicial
y el producto.

Aplicaciones:

 Analíticas: biosensores
 Médicas: tratamientos con enzimas inmovilizadas
 Industriales: en la industria química, farmacéutica, alimentaría y de tratamiento de
residuos.
Biosensores
 Es un dispositivo analítico que incorpora un material biológicamente activo en contacto
con un elemento de transducción para detectar (reversible y selectivamente) la
concentración o actividad de las especies químicas en cualquier tipo de muestra.
 Es capaz de traducir informacion uimica de una muestra en una señal util.
 Los sensores se componen de un sistema de reconocimiento o receptor y el transductor.
 El receptor reconoce selectivamente la informacion quimica presente en la muestra y la
convierte de forma en que pueda ser reconocida por el trannsductor, este convierte la señal
electrica
 Tipos de receptores
 Fisicos: no hay reacciones quimicas
 Quimicos:hay reacciones qumicas
 Biologicos: el material receptor tiene procedencia biologica. Como antivuerpos, enzimas,
ADN, etc.

Transductores electroquimicos
 Conductimetricos: Se basan en la medida de cambioo de la conductividad o alguna
propiedad asociada, por el analito en solucion o membrana selectiva, la cual es
proporcional a la concentracion de iones.
 Donde
 K= conductividad especifica S
 C= concentracion de iones mol
 Potenciometricos
 Consisten en la detrminación de una diferencia de potencial en condiciones de circuito
abierto entre un electrodo de trabajo y uno de referencia, esta diferencia de potencial se
relaciona con la ecuacion de Nerts.

 a1 es la actividad del ion principal

 Aj es la actividad del ion interferente
 Z i y j cargas de los iones principales e interferentes
 K coeficiente de selectividad
 Ejemplo de ello son los ISFET con membranas selectivas.
 Amperométricos
 Se basan en la aplicacion de un potencial fijo sobre un electrodo de trabajo, respecto a un
electrodo de referencia. Registra la corriente respecto a la concentracion de especie
electroactiva.

 Dnde A: area de electrodo de trbajo

 Do: coeficiente de difusion
 Co: Concentracion del analito
 X: distancia de la doble capa
Receptores biológicos

 Receptores mas eficientes debido a su especificidad.

 Existen diferentes tipos de receptores biológicos inmovilizados sobre transductores
electroquímicos:
 Anticuerpos
 Ácidos Nucleicos
 Microorganismos
 Tejidos Orgánicos
 Enzimas

 Los enzimas son los biosensores mas utilizados por ser barato fácil de conseguir y
manipular.
 Anticuerpos:
 Agente biológicos mas selectivos, se enlazan al antígeno de una manera muy especifica.
 No tiene capacidad catalítica, por lo que es complicado fabricar biosensores con anticuerpos. Su
realización implica el empleo de anticuerpos o antígenos marcados (isotopos radioactivos, enzimas,
partículas luminiscentes)
 Ácidos Nucleicos
 Alta especificidad de los pares de bases (adenina/timina y citosina/guanina)
 No tiene capacidad catalítica
 Microorganismos
 Pueden asimilar compuestos orgánicos.
 Tejidos orgánicos o celulares.
 Pueden ser utilizados como elemento de reconocimiento sin preparación
 No son tan selectivos
 El tiempo de vida del biosensor es mayor.
Enzimas

 Son proteínas capaces de catalizar una reacción química

 Reaccionan de manera selectiva con un sustrato.
 Acelera las reacciones sin consumirse.
 Formadas por una estructura tridimensional con una zona activa que reacciona con el
sustrato
 m as que
s on e nz i
d u c ta s a s o -
s o x i r e sd e o x i d
 La a c c i o n e
re
catalizan transferencia de
e d u c c i ó n( ne s ) . E s ta
r e l e c tr o
r o g e n o o e n u n
h i d o n vie r t e
d l o c
capacida muy eficiente.
i o re c e p to r
b
 Biosensores mas utlizados.
 Menor tiempo de respuesta en la reacción en los biosensores
 Una desventaja es que pierden actividad al ser inmovilizadas, lo que les limita su tiempo
de vida.