1.3.

Obtención de metabolitos
1.3.1 Productos extracelulares e intercelulares
•• Un
Como su nombre
metabolito lo indica,sustancia
es cualquier son componentes del metabolismo
que participa y se
en las reacciones
pueden que
químicas identificar como
tienen lugar en lassustratos,
células. metabolitos intermedios y
productos en las rutas metabólicas.

Ejemplo, la glucosa puede ser sustrato en la

glucogenogénesis, la ruta anabólica que transforma la
glucosa en glucógeno, o en la glucólisis, la ruta
catabólica que degrada la glucosa para formar ATP y
piruvato
• Podemos clasificarlos en dos grandes grupo:
a) Metabolitos primarios: involucrados de forma directa en el
crecimiento, desarrollo y reproducción normal de un organismo con
una función fisiológica importante.
b) Metabolitos secundarios: no están involucrados en estos procesos
de forma directa.

• La ausencia de un metabolito primario suele conllevar la muerte

inmediata o a corto plazo mientras que la ausencia de un metabolito
secundario no.
 ¿Cómo diferenciar metabolitos primarios de
secundarios?

Primarios Secundarios

Ejemplos: Ejemplos: antibióticos,

-Presentes de forma abundante en
todos los organismos.
carbohidratos,
- Son el resultado del metabolismo
general.
-Las rutas metabólicas en las que
participan, son iguales o muy
parecidas en todos los organismos.
- Están involucrados de forma
directa con el crecimiento,
desarrollo y reproducción.
aminoácidos, esteroides, alcaloides,
azucares, taninos, terpenoides,
-Específicos de grupos de compuestos fenólicos,
lípidos. organismos y presentes en carotenoides
pequeñas concentraciones.
-Resultado de metabolismo
especial derivado de
metabolismo primario.
-Involucrados en la defensa ante
patógenos, predadores o estrés.
 • Para la recuperación de metabolitos existe otra clasificación y esta
obedece la ubicación del producto celular de interés:
a) Extracelulares: en el caso de organismos unicelulares, son aquellos
que excretan (todo lo que se encuentra fuera de la membrana
plasmática).
• Para los organismos multicelulares, se refiere a
todo lo que está fuera de una célula, pero aún
dentro del organismo.
• Los productos genéticos de un organismo
multicelular que se secretan de una célula al
fluido intersticial o sangre, por lo tanto, pueden
anotarse en este término.
• Ejemplos: Aminoácidos, ácido cítrico, alcohol, algunos enzimas
(amilasas y proteasas) y la mayor parte de los antibióticos (penicilina,
estreptomicina).
• En unos pocos casos se encuentran metabolitos tanto en las células
como en el filtrado del cultivo (vitamina B12)
b) Intracelulares: Son los que forman parte de la estructura celular
interna de los organismos (todo compuesto que está dentro de la
membrana plasmática).

Ejemplos: los ácidos nucleicos, las vitaminas, enzimas y ciertos

antibióticos como la griseofulvina
• La separación de los metabolitos extracelulares de las células
microbianas y sus metabolitos intracelulares se puede lograr
mediante técnicas sencillas como la centrifugación y la filtración
• Mientras que la extracción de los metabolitos intracelulares de las
células microbianas es un proceso complejo (extinción microbiana,
lisis química, métodos físico-enzimáticos, digestión proteolítica…)

Metabolitos intracelulares
Metabolitos extracelulares
Separación de los metabolitos extracelulares
• Los metabolitos extracelulares se producen como subproductos de
las actividades metabólicas de los microorganismos que crecen en un
entorno específico.
• Algunos factores ambientales que afectan la absorción y secreción de
metabolitos son: temperatura, pH, concentración de nutrientes y
otros.
• La obtención de metabolitos extracelulares, generalmente inicia con el
calculo y conteo de células necesarias para cosechar el metabolito.
• Concentraciones celulares de 105 o 106 UFC/mL son recomendadas,
pero esto varía según el organismo y el metabolito a extraer.
• Posterior a el muestreo, se procede a la
separación del medio de cultivo y el
organismo por centrifugación y/o filtración
para frenar el desarrollo celular y reducir
contaminantes.
• Este paso también detiene la actividad
enzimática, pero si no sucede, es necesario
liofilizar el sobrenadante antes de la
derivación química.
• Cualquier restante de medio de cultivo sin
procesar puede guardarse en oscuridad a
temperaturas de -20 °C o menos.
• La derivación química se refiere a la separación del metabolito y el
medio de cultivo.
• Algunas opciones para la separación son:

a) Separación líquido-líquido. Los metabolitos de interés se separan

en un solvente inmiscible (poco recomendable).
b) Columna o matriz en fase sólida para atrapar los metabolitos.
c) Solubilización selectiva. Es la evaporación completa del solvente
para concentrar la muestra y los metabolitos luego se disuelven con
solventes adecuados
Separación de los metabolitos intracelulares
• Para separar un producto celular, es necesario frenar el crecimiento
de estas para evitar la degradación del metabolito (extinción celular =
templado celular= quenching).

• También es importante que se evite la exposición prolongada a la luz

y que las muestras se mantengan siempre a bajas temperaturas (<20
°C).
• Una vez que se ha detenido el crecimiento celular, se requiere
separarlas del medio de cultivo, para ello se emplean métodos de
filtrado, centrifugación o separación por polaridad.
Resumen de informes bibliográficos sobre métodos utilizados para extinguir
cultivos microbianos
Método de
Año Organismo Dejar caer los cultivos de
enfriamiento
micelio en nitrógeno
Bacterias
Solución de ácido líquido o rociar el cultivo
1963 (Aerobacter Hongos filamentosos
perclórico 1998 en una solución fría de
aerogenes ) (Monascus ruber)
metanol (60 % v/v)
Filtración rápida seguido de una
seguida de centrifugación rápida
1976 inmersión en Levadura
nitrógeno líquido
de la biomasa
Bacteria
Solución de Levadura 2004 Filtración rápida (Corynebacterium
1992 metanol frío (60 % (Saccharomyces glutamicum)
v/v) cerevisiae)
Solución Solución de metanol al
Hongos Microalgas
tamponada de 32,5% en agua
1996 filamentosos 2005 (Chlamydomonas
metanol (60 % suplementada con
(Aspergillus niger) reinhardtii)
v/v) a −45 °C CaCl 2 , MgCl 2 y KCl
 Inmersión de
matraces de cultivo en Protozoos ( Leishmania Bacterias y levaduras
2006
baño de hielo seco y donovani ) (Pseudomonas
etanol Solución salina de
2007 fluorescens , Streptomyces
glicerol fría
coelicolor y Saccharomyces
cerevisiae )
Solución de metanol
Bacterias ( Lactobacillus
2007 en frío al 60% v/v con
plantarum )
diferentes aditivos
Metanol puro a −40 Levadura ( Saccharomyces
2008
°C cerevisiae )

Solución fría de
Bacterias, levaduras y
Bacterias ( Bacillus 2010 glicerol y filtración
hongos filamentosos
subtilis , Corynebacterium rápida
glutamicum , Escherichia
2007 Filtración rápida coli , Gluconobacter Comparación de
oxydans , Pseudomonas cuatro métodos de
putida y Zymononas extinción diferentes
mobilis ) 2011 Levadura ( Pichia pastoris )
basados ​en una
solución acuosa de
metanol frío
 • Para mas información puede consultar el artículo:
Farhana R. Pinu, Silas G. Villas-Boas and Raphael
Solución de Moho Aggio. (2017). Analysis of Intracellular Metabolites
2012 metanol al 40 % ( Penicillium from Microorganisms: Quenching and Extraction
v/v a −20 °C chrysogenum ) Protocols. Metabolites. 7, 53;
doi:10.3390/metabo7040053.

Filtración rápida • Extracción de metabolitos extracelulares:

2014
automatizada y Bacterias Farhana R. Pinu, and Silas G. Villas-Boas. (2017).
extinción en el ( Escherichia coli ) Extracellular Microbial Metabolomics: The State of
filtro
the Art. Metabolites. 7, 43;
doi:10.3390/metabo7030043
• Como puede observar, la gran mayoría de los métodos de extinción y
extracción desarrollados hasta la fecha se dirigen a células bacterianas
y/o de levadura.
• Existen pocos métodos de extinción que detengan el metabolismo de
hongos filamentosos, microalgas y protozoos, esto es debido a la
composición variada de sus paredes celulares.

Alga
Planta Protozoo
• Antes de decidir frenar el crecimiento celular y después de esto, es
necesario asegurar una concentración adecuada de células para
obtener suficientes metabolitos.
• Esto se hace generalmente por prueba de turbidez.

• El muestreo después de extinguir las

células debe ser rápido, debido a que la
interconversión de metabolitos puede
ocurrir en el orden de segundos.
• Se utilizan pipetas o jeringas para
recolectar una cantidad específica de
muestra y rociarla rápidamente en un
matraz que contiene la solución de
extinción.
• Después de que se han aislado las células con metabolismo “frenado”,
se pasa a la extracción del metabolito.
• Para ello se usan técnicas que permiten la ruptura de la pared o
membrana celular y posteriormente liberar los metabolitos de interés.

• Estas técnicas dependerán de la composición de la pared o

membrana, así como de la concentración y naturaleza del metabolito.
• Existen métodos de disrupción celular mecánicos (ultrasonidos,
microondas, prensa francesa y molienda), enzimáticos y químicos.

• Los metabolitos generalmente se distribuyen entre dos fases de

acuerdo con sus coeficientes de partición, solubilidad, temperatura del
solvente y los volúmenes relativos de las fases.

• El objetivo en este caso es

concentrar los metabolitos en
una sola fase, lo que se puede
lograr mediante el uso de
agentes químicos.
• Tanto los disolventes polares (p. ej., metanol o etanol) como los no
polares (p. ej., acetato de etilo, hexano y cloroformo) se emplean
ampliamente para la extracción de metabolitos intracelulares
microbianos.
• Algunos ejemplos de extractores son:

-Etanol hirviendo.
-Metanol frio.
-Metanol tamponado-cloroformo-agua
(extraer lípidos totales).
-Agua caliente (extracción de
aminoácidos bacterianos).
-Extracción ácida
-Extracción alcalina