Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.

El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos

y poder realizar la observación en microscopio óptico.

Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el medio en el

cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún

tratamiento previo.

De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

a) Tinción simple:

El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

b) Tinción diferencial:

El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o

entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan mas de un colorante o bien

ciertos reactivos complementarios para la tinción.

Ejemplos: Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.

3.1. Materiales

• Portaobjetos

• Cubreobjetos

• Microscopio óptico

• Solución de cristal violeta al 1 %

• Solución de azul de metileno al 1 %

• Solución de safranina al 1 %

• Solución decolorante (alcohol etílico y acetona 1:1)

• Solución de I2 / I

(yodo / yoduro al 0.1 %)

• Cultivo (caldo o agar) a teñir.

• Ansa de punta y ansa de aro.

• Mecheros

• Alcohol e

PROCEDIMIENTO
Preparación de la muestra:
1. Coloque la muestra en un portaobjetos de vidrio limpio para que producirán una capa
delgada y uniforme. Emulsionar colonias de un cultivo de 18-24 horas en solución
fisiológica estéril (Cat. No. R45), si es necesario, para lograr la densidad correcta.

2. Fijar frotis fluya usando uno de los siguientes técnicas de montaje:

A. La fijación de calor que pasa a través de diapositivas bajo el calor de 2-3 veces hasta
que toda la humedad se haya evaporado. Alternativamente, la corredera se puede colocar
en un bloque de calor (56 cSt.) Para algunos minutos. Deja la diapositiva enfriar a
temperatura ambiente antes de la tinción.
Nota: No calentar el portaobjetos. Un calentamiento excesivo causará coloración atípica.
B. El metanol trineo de corrección que desborda con metanol absoluto (95%) durante 1-2
minutos, luego incline la corredera para drenar metanol y secar al aire.
Nota: Para el montaje correcto, metanol absoluto debe almacenarse en botellas de color
marrón con tapón de rosca, y el trabajo se debe llenar cada dos semanas.
Nota: fijación con metanol es mayor que el ajuste de calor durante 5 razones:
1. Mantener la morfología de las células bacterianas y humana.
2. Mantener las células rojas de la sangre, lo que hace que sea particularmente útil con
muestras de sangre.
3. Proporciona un mayor control sobre el proceso de blanqueo, porque los organismos
fijados con metanol son más resistentes a la decoloración.
4. Evita muestras de líquido para lavar fuera de la diapositiva.
5. Dejar un fondo más claro.

La tinción de procedimiento:
1. Deslice la cubierta con el reactivo de cristal violeta durante un minuto.

deslice 2. Enjuague con agua desionizada o agua del grifo.

3. Cubrir la corredera con el reactivo de yodo durante un minuto.

4. Enjuague suavemente el portaobjetos con agua desionizada o agua del grifo y desagüe.

5. Inclinar la placa y las inundaciones, con unas gotas de decolorante hasta carreras de
color púrpura. Esto suele tardar 10 segundos o menos. No altera el color.

6. Enjuague el portaobjetos suavemente con agua desionizada o agua del grifo.

7. tapa deslizante con safranina, contrastar ™ avanzada o básica contraste fucsina por un
minuto.

8. Enjuague el portaobjetos suavemente con agua desionizada o agua del grifo. El agua de
enjuague en esta etapa debe ser ligeramente rosado. No lave también.

9. Dejar que los portaobjetos para drenar y secar al aire, o suavemente borra sin pelusa de
papel (Nº Cat. 28511007) o una toalla de papel.

10. Examine la diapositiva bajo el lente de inmersión en aceite (aumento 1.000X).

Gram Crystal Violet

COLORANTE PRIMARIO

Cristal violeta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,0 g

Isopropanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50,0 mL

Etanol/Metanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50,0 mL

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 900,0 mL

Gram Iodine

MORDIENTE

(Solución de trabajo preparada con diluyente para

Gram y yodo para Gram 100X)

Cristales de yodo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3,3 g

Yoduro potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6,6 g

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 L

Stabilized Gram Iodine

MORDIENTE

Complejo polivinilpirrolidona-yodo . . . . . 100,0 g

Yoduro potásico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19,0 g

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,0 L

Gram Decolorizer

DESCOLORANTE

Acetona. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250,0 mL

Isopropanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 750,0 mL

Gram Safranin

CONTRACOLORANTE

Safranina O en polvo (colorante puro). . . . . 4,0 g

Etanol/Metanol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200,0 mL

Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 800,0 mL

Gram Basic Fuchsin

CONTRACOLORANTE

Fucsina básica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,08 g

Fenol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,6 g

Alcohol isopropílico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4,5 mL

Agua destilada . .

FUNDAMENTO DEL PROCEDIMIENTO

El procedimiento de tinción de Gram2

consta de las siguientes etapas:

Realizar la tinción de un frotis preparado con cristal violeta.

Aplicar yodo como mordiente.

Decolorar el colorante primario con alcohol/acetona; y realizar una contracoloración con safranina
o fucsina básica
Un complejo de cristal violeta-yodo se forma en el protoplasto (no en la pared celular) de todos los
organismos a los

que se aplica la tinción con este procedimiento. Los organismos capaces de retener este complejo
colorante después

de la decoloración se clasifican como grampositivos, mientras los que pueden decolorarse y

admiten contratinción se

clasifican como gramnegativos.

Si se altera o se elimina la pared celular, el protoplasto de células grampositivas (además de las

gramnegativas) pueden

decolorarse y el atributo grampositivo se pierde. Por consiguiente, el mecanismo de tinción de

Gram parece estar

relacionado con la presencia de una pared celular intacta capaz de actuar como barrera a la
decoloración del colorante

primario.

Por lo general, la pared celular es permeable de una manera no selectiva. Teóricamente, durante
el procedimiento de

tinción de Gram, la pared celular de las células grampositivas se deshidrata por el alcohol en el
descolorante y pierde

permeabilidad, por lo que retiene el colorante primario. Sin embargo, la pared celular de las
células gramnegativas

tiene un contenido lipídico mayor, y se vuelve más permeable cuando se le trata con alcohol, lo
que da como resultado

la pérdida del colorante primario.

La base molecular para la tinción de Gram no se ha determinado todavía

Materiales
 Mechero Bunsen o de Alcohol
 Asa de Siembra o aguja enmangada
 Pinzas
 Portaobjetos
 Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro
Dental, Suelo, etc.
 Palillos
 Microscopios
 Aceite de inmersión
 Soporte de Tinciones
 Goteros
 Pinzas
 Agua destilada
 Colorantes para Tinción: Solución de cristal Violeta
Lugol Safranina Etanol 95%
 DIFERENCIAS MOLECULARES ENTRE UNA BACTERIA GRAN
POSITIVA Y OTRA GRAN NEGATIVA.
BACTERIAS GRAM POSITIVAS BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Poseen una pared celular interna y Poseen una pared celular más
una pared de peptidoglucano. compleja:
*Peptidoglucano: es un -pared celular interna
exoesqueleto que da consistencia y -pared de peptidoglucano
forma esencial para replicación y - bicapa lipídica externa
supervivencia de la bacteria.
No tiene membrana externa Membrana externa: forma un saco
rígido alrededor de la bacteria,
mantiene estructura y es barrera
impermeable a macromoléculas,
ofrece protección en condiciones
adversas

Espacio periplasmático: espacio

No tiene espacio periplasmático
La red de mureína está muy
desarrollada y llega a tener hasta
40 capas
La penicilina mata a las gram
positivas, ya que bloquea la
formación de enlaces peptídicos
entre la superficie externa de la
membrana citoplasmática y la
interna de la membrana externa.
La red de mureína presenta una
sola capa
La penicilina no mata a las Gram
negativas, a causa de la capa de
lipopolisacáridos situada en la
entre las diferentes cadenas del parte externa de la pared celular.
peptidoglucano
Contiene LPS: estimulador de
No contiene LPS respuestas inmunes: activa células
B, liberación de IL, FNT, IL 6 por
macrófagos.
En la tinción de Gram, retienen la Quedan decoloradas.
tinción azul

Conservan el complejo Pierden el complejo yodocolorante

yodocolorante

Pueden ser anaerobios o aerobios

Son esporulantes y no
esporulantes, como Streptococcus,
Cisteria, Frankia.

Poseen otros componentes: ácidos Poseen proteínas con

teicoicos y lipoteicoicos, y concentraciones elevadas.
polisacáridos complejos.

Fundamento[editar]
Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen ácidos grasos (ácidos micólicos) de
cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracíón con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes básicos. Por esto se
denominan ácido-alcohol resistentes. Las micobacterias como Mycobacterium
tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia.
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua,
provoca una nueva solidificación de lo ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede
salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las
moléculas del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que
resisten la decoloración son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se
utiliza azul de metileno como tinción de contraste.

Los reactivos necesarios para su realización son los siguientes:

1. ácido peryódico 58%

2. carbol fucsina de Ziehl culina (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden
dado:
1. 0,5 g fucsina básica
 2. 50 ml agua destilada
3. 5 ml etanol absoluto
4. 28,5 g cristales de fenol derretidos
3. hematoxilina
4. alcohol ácido 1%:
1. alcohol de 35º
2. ácido clorhídrico

El procedimiento es el siguiente:

1. desparafinar e hidratar los cortes

2. ácido periódico 5%, 10 min
3. lavar con agua destilada
4. fucsina fenicada, 15 min
5. decolorar en alcohol ácido al 50%
6. lavar con agua destilada
7. hematoxilina, 10 min
8. azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
9. deshidratar, aclarar y montar preparaciones

10. Reactivos
11. Colorante primario
12. Se usa carbol fucsina al 0,3 % (filtrado). Este colorante se
prepara a partir de una mezcla de alcoholes: fenol en etanol (90 %)
o metanol (95 %), y en esta mezcla se disuelven 3 gramos de fucsina
básica.
13. Solución decolorante
14. En este paso se pueden emplear soluciones de ácido alcohol al
3 % o ácido sulfúrico al 25 %.
15. Colorante secundario (contra-colorante)
16. El colorante más empleado para realizar el contraste en las
muestras suele ser el azul de metileno al 0,3 %. Sin embargo,
también se pueden emplear otros, como el verde malaquita al 0,5 %.
17. Procedimiento:
18. Frotis:
 19. 1. Colocar los frascos con las muestras en orden consecutivo de izquierda a derecha
20. 2. Poner las láminas en la mesa (en este caso dentro de la CSB) y numerarlas con
los números correspondientes a las muestras usando 1/3 de la lámina al reverso (para
que al momento de hacer la decoloración no se borre)
21. 3. Abrir el frasco de la muestra de manera firme y lenta
22. 4. Ver el contenido del frasco y obtener la parte más purulenta
23. 5. Con un palillo de madera escoger la porción más purulenta/sanguinolenta/sólida,
no se debe batir demasiado la muestra
24. 6. Extender la muestra en un frotis de una capa no muy gruesa (sobre loso 2/3 de
lámina sobrante) sin llegar a los bordes
25. 7. Si es necesario, desmenuzar las partículas grandes con las puntas del palillo de
madera quebrado por la mitad
26. 8. Desechar el aplicador en un frasco de boca ancha con alcohol o cloro
27. 9. Dejar secar el frotis
28. 10. Tomar la lámina por el extremo numerado con la muestra hacia arriba, pasarla
tres veces por la llama del mechero para fijar el frotis, dejar enfriar el frotis (2-3 min.)
29. Tinción:

30. Tinción:
31. 1. Cubrir todo el porta-objeto con fucsina filtrada
32. 2. Calentar hasta la emisión de vapores (aprox. 5 min.)
33. 3. Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
34. 4. Cubrir con solución decolorante durante 2 min.
35. 5. Lavar con agua (poniendo la lámina de una manera inclinada para evitar
barrer la muestra) y escurrir
36. 6. Cubrir con azul de metileno de 45seg.-1min.
37. 7. Lavar con agua y luego poner en la tabla de secado (para escurrir)
MATERIALES:

 Equipo de tinción
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Portaobjetos
 Asa de siembra de platino

REACTIVOS

 Fucsina fenicada
 Alcohol- ácido
 Azul de metileno
Agua destilada

PROCEDIMIENTO:

1. Extensión, desecación y fijación

2. Echar fucsina fenicada durante 1 minuto en frio y 5 minutos a emisión de vapores.

3. Decoloración con alcohol-ácido unos 30 segundos, hasta que se elimine el rojo.

4. Lavar con agua destilada.
5. Azul de metileno durante 1-2 minutos
6. Lavar, secar y observar.
Algunos microorganismos ácido-alcohol resistentes[editar]

 Mycobacterium: fuertemente ácido-alcohol resistentes.1

 Nocardia y Actinomices: débilmente ácido-alcohol resistentes.2
 Parásitos coccídeos (Cryptosporidium) de muestras fecales.3