Prctica N7: Cintica Enzimtica.

Experimento I.- Concentracin de Substrato

Objetivo:
a. Conocer como la concentracin de substrato puede modificar la velocidad de reaccin
y calcular la constante de Michaelis de una enzima.
Teora:
Si se analiza la influencia de la concentracin del substrato, manteniendo la
concentracin de la enzima constante, y se dibuja una grfica con los resultados, se obtiene
una hiprbola rectangular. Esta curva est expresada matemticamente por la ecuacin de
Michaelis:
Vmax
Vmax S
v = -------------- v = ------------1 + Km. / S
S + Km.
Donde v es la velocidad de la reaccin, Vmax es la velocidad mxima, S es la concentracin
molar de substrato y Km. es una constante equivalente a la concentracin de substrato con la
que se obtiene la mitad de velocidad mxima. Suele usarse la expresin de Lineweaver-Burk,
que es la reciproca de la ecuacin de Michaelis y da una lnea recta.
1 Km.
1
1
--- = ------- . ---- + ---v Vmax S
V
Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Solucin Sustrato almidn 500 mg/L, en buffer 0.01 M Acetato de sodio y CaCl2 0.003
M (pH 5.6)
Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo en HCl 0.02M
Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37 C

Procedimiento
Se montar el siguiente set de trabajo:
Reactivos
1
1B
2
2B
3
3B
4
H2Od
(mL)
0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1
Substrato almidn (mL) 0.1 0.1 0.2 0.2 0.3 0.3 0.4
Enzima (L)
50
50
50
50
Inmediatamente mezcle e incube a 37C por 7.5 min
Solucin de Yodo (mL)
4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
Enzima (L)
50
50
50
Leer al espectrofotmetro a 640nm
El blanco para el espectrofotmetro se realizar mezclando 0.5mL
de solucin de yodo.
Mg. Carlos M. Santa Cruz C. (santacruzcm@yahoo.es)

4B
0.1
0.4

5
--0.5
50

5B
--0.5

4.5
50

4.5

4.5
50

de agua con 4.5mL

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Resultados y Discusin.
A. Anote sus resultados y realice los clculos respectivos.
Tubo

Sustrato

[S]inicial

mL

mg/mL

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

Abs.

[S]final

Vel

1/V

1/S

mg/mL

mg/mL.min

mL.min/mg

mL/mg

* Para determinar la concentracin final de sustrato ([S] final) emplear el coeficiente de

absorcin de la curva estndar de almidn realizada anteriormente.
* Para determinar la velocidad de reaccin en cada tubo:
V= [S] inicial [S]final (g/L)
Tiempo
(min.)

B. En un papel milimetrado grafique la curva de Velocidad vs. [S]inicial (representacin de la

ecuacin de Michaelis) y determine la Velocidad mxima de la reaccin (Vmax).

C. Realice la representacin de Lineweaber-Burk (representacin de las inversos de las

velocidades enzimticas frente a los inversos de las concentraciones de sustrato)
graficando en un papel milimetrado 1/V vs. 1/S. Determine Km y Vmax de la reaccin.
Km =

Vmax =

D. Discuta sus resultados.

Mg. Carlos M. Santa Cruz C. (santacruzcm@yahoo.es)

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Experimento II.- Concentracin de la Enzima

Objetivo:
a.

Conocer como la concentracin de la enzima puede modificar la velocidad de

reaccin.

Materiales y Reactivos:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Solucin Sustrato almidn 500 mg/L, en buffer 0.01 M Acetato de sodio y CaCl2 0.003
M (pH 5.6)
Reactivo de yodo 0.01 eq/L de Yodo en HCl 0.02M
Enzima amilasa
Tubos de prueba y pipetas
Centrfuga clnica
Espectrofotmetro o fotocolormetro
Bao de mara a 37 C

Procedimiento:
Se montar el siguiente set de trabajo:
Reactivos
1
1B
2
2B
3
3B
4
H2Od
(L)
90
90
80
80
70
70
60
Substrato almidn (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Enzima (L)
10
20
30
40
Inmediatamente mezcle e incube a 37C por 7.5 min
Solucin de Yodo (mL) 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5
Enzima (mL)
10
20
30
Leer al espectrofotmetro a 640nm

4B
60
0.5

5
50
0.5
50

5B
50
0.5

4.5
40

4.5

4.5
50

Resultados y Discusin:
A. Anote sus resultados y realice los clculos respectivos.

1
2

Enzima
ml
0.01
0.02

[S]inicial
mg/mL
10
10

3
4
5

0.03
0.04
0.05

10
10
10

Tubo

Abs.

[S]final
mg/mL

Vel
mg/mL.min

*Para determinar la concentracin final de sustrato ([S] final) emplear el coeficiente de

absorcin de la curva estndar de almidn realizada anteriormente.
*Para determinar la velocidad de reaccin en cada tubo:
V= [S] inicial [S]final (g/L)
Tiempo
(min.)

Mg. Carlos M. Santa Cruz C. (santacruzcm@yahoo.es)

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B. En un papel milimetrado grafique la curva del efecto de la cantidad de enzima sobre la

Velocidad de la reaccin (velocidad de reaccin vs. cantidad de enzima).
C. Discuta sus resultados (usar la parte posterior de su grfico para los clculos).

BIBLIOGRAFA
1.
2.

Gutirrez R., Ana y Santa Cruz C., C. (1998) Gua de Prcticas Bioqumica.
Universidad Nacional Federico Villarreal.
WIENER LAB. 1995. Vademcum. Edicin Revisada y Actualizada. Rosario-Argentina.

Mg. Carlos M. Santa Cruz C. (santacruzcm@yahoo.es)

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