R.
NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.
B. NAVARRO
MESTAS
B.
G.MESTAS
SUCASACA
G.
F. SUCASACA
ROMERO
PRACTICA 6
CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS
Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras
formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y combinaciones
que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y por esto el número posible
de proteínas es realmente muy grande.
Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones. Actúan
como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan también como
enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades estructurales, fuentes de
energía, etc.
Muchas proteínas son lábiles y fácilmente modificables por una serie de agentes:
variaciones del pH, radiaciones ultravioleta, calentamiento en solución acuosa, solventes
orgánicos, etc., que determinan cambios dentro de su molécula (alteraciones de la disposición
de las cadenas peptídicas) y modificaciones en sus propiedades, constituyendo la llamada
“desnaturalización”.
Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación de
proteínas para su caracterización y cuantificación posterior.
I. PRECIPITACION DE PROTEINAS
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan estabilizadas por
ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de estas influencias
estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces; cuando ambas de estas
influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita.
1.1. Precipitación en el Punto Isoeléctrico. Las proteínas, como los aminoácidos, son menos
solubles en su punto isoeléctrico. Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas
ajustando el pH de la solución al punto isoeléctrico de la proteína.
1.2. Precipitación por Sales. La adición de una sal neutra causa la precipitación de las
proteínas. Las diferentes proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto
ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico de la proteína. El efecto de la sal es eliminar el
agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la interacción
proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente usada para este
tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente soluble.
1.3. Precipitación por Solventes Orgánicos. La adición de ciertos solventes orgánicos, como
etanol y acetona, precipitan las proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en
el punto isoeléctrico de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así
disminuyen la interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de
otro modo puede ocurrir desnaturalización.
1.4. Precipitación por Aniones Complejos. Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico,
pícrico, tánico, tungstico, fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación
probablemente se debe a la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre.
Este tipo de precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que
se le lleva a la proteína.
1.5. Precipitación por Metales Pesados. Los cationes de metales pesados como mercurio,
plomo, cobre, plata, oro, platino, etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón
libre disminuye la carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos iones
algunas veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar
sulfuros.
1
52
R. NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R. NAVARRO
B. MESTAS
B. MESTAS
G. SUCASACA
G. SUCASACA
F. ROMERO
II. DESNATURALIZACION DE LAS PROTEINAS
Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier
fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del enlace
peptídico causa desnaturalización. Las proteínas desnaturalizadas tienen propiedades
diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad fisiológica. Además, la
desnaturalización disminuye la solubilidad de las proteínas en agua, porque el arreglo de los
grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie, está destruido. Son comunes agentes
desnaturalizantes, el calor, pH extremo, oxidación y reducción los cuales afectan el enlace
disulfuro, agitación, radiación y urea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades para
cada agente desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible. Algunas
veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la urea, a proteína nativa es
restaurada.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1. DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO Y SOLUBILIDAD DE
LA CASEINA.
El punto isoeléctrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la proteína es
eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al número total de
cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son muy insolubles y
precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina, gelatina). En este punto la carga
neta de todos los grupos disociables, como carboxilo, amino, imidazol, guanidino, etc., es igual
a cero. La superficie de la proteína siempre posee una carga eléctrica que depende del pH, de
los electrolitos presentes y del solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos;
pero existe un conjunto de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para
el cual la suma de las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este
momento el número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa es
mínimo o nulo. Como las cargas del mismo signo se rechazan, en estas condiciones algunas
moléculas pueden formar agregados en lugar de rechazarse. Pero a ambos lados del punto
isoeléctrico, todas las moléculas tienen una carga neta positiva o negativa; estas moléculas se
rechazan, y es mínima la tendencia a la agregación y precipitación. Por tanto, en general, el pH
coincide con la solubilidad mínima de las proteínas.
Los solventes orgánicos como el etanol, también causan precipitación de proteínas de
un proceso que puede ser atribuido generalmente a la acción deshidratante.
Cada proteína tiene un determinado punto isoeléctrico (Tabla 1) que puede ser
determinado aprovechando algunas propiedades de las proteínas que están comprometidas,
utilizando por lo general efecto del pH sobre la solubilidad de las proteínas. Algunas proteínas,
como la caseína de la leche son fácilmente precipitables, ajustando el pH de la solución a su pI,
por lo cual este procedimiento se describe como “precipitación isoeléctrica”.
Tabla 1. Punto Isoeléctrico de algunas proteínas
PROTEÍNA pI
Ovoalbúmina 4.6
Tiroglobulina 4.6
Caseína 4.7
Gelatina 4.7
Seroalbúmina 4.8
(humana)
Fibrinógeno 5.5
Seroglobulinas 6.4 – 7.2
Homoglobulina 6.9
(caballo)
Mioglobina (caballo) 7.0
2
53
R. NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.
B.NAVARRO
MESTAS
B.
G.MESTAS
SUCASACA
G.
F. SUCASACA
ROMERO
Material
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Ácido acético 1 N
Ácido acético 0.1 N
Ácido acético 0.01 N
NaOH al 10%
Método de Trabajo
Acceda al siguiente enlace
https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=63&sim=158&cnt=210
Preparar el siguiente sistema de tubos:
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Agua destilada 8.38 7.15 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Ac. Acético 0.01 N 0.62 1.75 - - - - - - -
Ac. Acético 0.1 N - - 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -
Ac. Acético 1.0 N - - - - - 1.6
Caseína 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Agitar los tubos antes y después de agregar la solución de caseína. Haga el cálculo del
pH teórico para cada uno de los tubos. Anote los resultados, marcando la falta de turbidez con
0, los grados de la misma con signos + (emplee hasta ++++ con la máxima turbidez), según
corresponda para cada tubo. Determinar con la mayor precisión el tubo que presenta el máximo
de precipitación, lo cual se producirá en el tubo que tiene un pH próximo al punto isoeléctrico y
al de solubilidad mínima de la caseína. Observar a los 10 minutos, anote los cambios.
Seguidamente calentar los tubos en baño maría a 37 °C y anote sus apreciaciones. Agregar
NaOH al 10% gota a gota y observe los cambios.
Datos Experimentales
Tubo Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9
pH teórico
Turbidez inmediata
Turbidez a los 10 min
Turbidez y precipitado
después de calentar
NaOH 0.1 N
Resultados, Discusión, Conclusión, Bibliografía
EXPERIMENTO 2. DESNATURALIZACION DE PROTEINAS
Una proteína está en su estado nativo cuando existe en su forma natural dentro de las
células. El aislamiento de proteínas tiene por objeto no alterar este estado nativo y si este se
altera se dice que la proteína se ha desnaturalizado. La desnaturalización proteica se debe a la
ruptura de los enlaces secundarios, como puentes de hidrógeno y enlaces de tipo iónico, lo que
hace que la estructura globular de la proteína se altere desenrollándose la molécula, ocurriendo
la precipitación. En el estado desnaturalizado, las proteínas se vuelven menos solubles. Esta
solubilidad puede ser restablecida por acción de álcalis o bases.
54
3
R. NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.
B.NAVARRO
MESTAS
B.
G.MESTAS
SUCASACA
G.
F.SUCASACA
ROMERO
Material
Tubos de ensayo o vasos
Pipetas
Gradillas
Solución de ovoalbúmina al 1%
Leche
Vinagre
Jugo de limón
Lejía o bicarbonato de sodio
Método de Trabajo
a) Desnaturalización de las proteínas por acción del pH:
En 3 tubos de ensayo o vasos agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina o leche a cada uno
de ellos. Al tubo 1 agregue 2 ml de vinagre, al tubo 2 agregue 2 ml de jugo de limón y al tubo
3 agregue 2 ml de lejía.
Datos Experimentales
Tubo Observación
Ovoalbúmina + vinagre
Ovoalbúmina + limón
Ovoalbúmina + lejía
b) Desnaturalización de las proteínas por acción de la temperatura:
En un tubo de ensayo agregar 2 ml de solución de ovoalbúmina. Lleve el tubo al calor (llama
de mechero).
Datos Experimentales
Tubo Observación
Ovoalbúmina + Calor
Resultados, Discusión, Conclusión, Bibliografía
EXPERIMENTO 3. ESTIMACION CUANTITATIVA DE PROTEINAS.
1) Método de Biuret
Este método colorimétrico es una prueba confiable para determinar la concentración de
proteínas, pero requiere cantidades relativamente grandes de proteínas.
La reacción de biuret es una reacción general de las proteínas, y se producen con
proteínas que presentan al menos dos enlaces peptídicos o dos grupos amida consecutivos.
Estos grupos son capaces de reducir el Cu2+ a Cu+, formando el Cu+ un complejo con las
proteínas en medio alcalino, que produce una coloración azul con máximos de absorbancia a
545 nm.
Materiales
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Espectrofotómetro
Estándar de proteínas (Albúmina de suero Bovino) 10 mg/ml en NaOH 1 N
NaOH 1 N
Reactivo de Biuret: Disolver 1.5 g de sulfato de cobre y 6 g de Tartrato de sodio y potasio en
500 ml de agua destilada. Añadir agitando constantemente 300 ml de NaOH al 10%.
Completar a 1000 ml con agua destilada.
Procedimento
Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos que contienen el estándar y muestras problema
4
55
R. NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.
B.NAVARRO
MESTAS
B.
G.MESTAS
SUCASACA
G.
F.SUCASACA
ROMERO
como se indica a continuación
REACTIVOS RESULTADOS
Estándar Reactivo
H2O
Tubo (20 mg/ml) de Biuret Ab545 nm [Proteína]
(µl)
(µl) (ml)
Blanco 0 100 1
1 25 75 1 0.139
2 50 50 1 0.265
3 75 25 1 0.393
4 100 0 1 0.460
MUESTRAS RESULTADOS
M1 100 0 1 0.769
M2 100 0 1 0.380
Incubar a 37 °C por 30 minutos y leer la absorbancia a 545 nm frente al blanco. Recuerde
el color es estable 1 hora.
Para obtener la curva de calibración, grafique los valores de absorbancia en las
ordenadas y la concentración de proteína en las abscisas. Para determinar la concentración de
proteínas totales de las muestras puede utilizar la curva de calibración o el factor de calibración.
2) Método de Lowry
El método de Lowry utiliza tres sistemas para producir coloración por la presencia de
proteínas. En primer lugar, el Cu+, forma complejos de coordinación con los dos enlaces
peptídicos consecutivos de las proteínas, dando lugar a un compuesto coloreado azul (de
manera similar al método de biuret). En segundo lugar, este compuesto es capaz de reducir el
reactivo de Folin-Ciocalteu (ácido fosfotúngstico y fosfomolíbdico), dando un color más azulado.
Por último, el reactivo de Folin-Ciocalteu también reaccionan con los restos tirosinil de la cadena
polipeptídica, produciendo asimismo un color azul por la r4educción del fosfomolibdato en medio
básico.
Materiales
Solución estándar de proteína [200ug / ml]
Reactivo de cobre alcalino
Reactivo de Folin-Ciocaltaeu
Espectrofotómetro
Pipetas
Tubos de ensayo
Procedimiento
Acceda al siguiente enlace:
https://vlab.amrita.edu/?sub=3&brch=64&sim=1087&cnt=2112
Agregue solución estándar en los tubos de ensayo (0.2 a 1 ml), complete el volumen de
cada tubo de ensayo 1 ml con agua destilada. Agregue 5ml de reactivo alcalino de cobre a todos
los tubos de ensayo. Agite en el vórtex e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. La
solución en todos los tubos de ensayo se ha vuelto de color azul. Después de la incubación,
agregue 600 µl del reactivo de Folin-Ciocalteau a todos los tubos de ensayo usando una
micropipeta. Agite en el vórtex e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.Después
de la incubación, la intensidad del color varía de acuerdo con la concentración de proteína
presente en los tubos. Ahora registre la absorbancia de cada solución a 650 nm usando un
espectrofotómetro.
Grafique la absorbancia frente a la cantidad de proteína en miligramos para obtener una
curva de calibración estándar.
Compruebe la absorbancia de la muestra desconocida y determine la concentración de
la muestra desconocida a partir de la curva estándar.
5
56
R. NAVARRO
MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA R.
B.NAVARRO
MESTAS
B.
G.MESTAS
SUCASACA
G.
F.SUCASACA
ROMERO
Datos Experimentales
Estándar de
Tubo
Proteína Ab Fc
N
µg/ml
Bl -
1 40
2 80
3 120
4 160
5 200
CUESTIONARIO
1. Qué pH eligiría para separar mediante electroforesis una mezcla de las siguientes proteínas:
Mezcla A: Ureasa (pI = 5.0) y Seroalbúmina (pI = 4.9)
Mezcla B: Mioglobina (pI = 7.0) y Citocromo C (pI = 10.6)
2. La insulina es sintetizada en las células ß del páncreas a partir de la proinsulina, que es un
polipéptido de una sola cadena. Señale los métodos que Ud. utilizaría para realizar la
separación de ambas proteínas, teniendo en cuenta los siguientes datos fisico-químicos.
Indique los resultados que esperaría encontrar al usar cada uno de los métodos que propone.
Proinsulina: PM = 9000d, pI = 6.3; Insulina: PM = 5808d , pI = 5.4.
3. Una muestra de suero sanguíneo tiene 6.7 g de proteínas totales. Mediante la electroforesis
en papel se analizan sus fracciones proteicas y se encuentran los siguientes porcentajes:
Albúmina 55%, -1-Globulina 6%, -2-Globulina 9%, -Globulina 11% y -Globulina 19%.
Encontrar el contenido de cada fracción proteica en g%. Determine si existe alteración en la
concentración de cada una de estas proteínas.
4. Trace la estructura del dipéptido Lys-Glu a pH 7.0. Señale lo siguiente: a) enlace peptídico,
b) extremo N terminal, c) extremo C terminal, d) un grupo amino α y un grupo amino ε, e) un
grupo α carboxilato y un grupo γ carboxilato.
5. La hormona peptídica glucágon del pez tilapia del Nilo se trató con quimotripsina, y los
fragmentos resultantes se secuenciaron. Una segunda muestra del polipéptido se trató con
tripsina, y los fragmentos se secuenciaron. ¿Cuál es la secuencia del polipéptido?
Fragmentos por quimotripsina Fragmentos por tripsina
LMNNKRSGAAE AQDFVRWLMNNK
SNDY HSEGTFSNDYSK
HSEGTF RSGAAE
LEDRKAQDF YLEDRK
VRW
SKY
6
57
