UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

Producción de ácido cítrico

ASIGNATURA:
Biotecnología Microbiana

AUTORES: GRUPO 3
Acuña Alarcón Luis Miguel
García Sánchez Noris Pilar
Infante Requejo Cesar Iván
Malca Granados Maricielo Lizbeth
Pardo Ramírez Kiara Geraldinny

ASESOR:
Cesar Guzmán Moreno

L
AMBAYEQUE-PERÚ
2022
 UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
VICERRECTORADO DE INVESTIGACIÓN
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
LAMBAYEQUE

PRODUCTO ACREDITABLE 1

I. INFORMACIÓN GENERAL

I.1. Título
Producción de ácido cítrico

I.2. Autores:
Acuña Alarcón Luis Miguel
García Sánchez Noris Pilar
Infante Requejo Cesar Iván
Malca Granados Maricielo Lizbeth
Pardo Ramírez Kiara Geraldinny

I.3. Asesor:
Guzmán Moreno Cesar

I.4. Línea de investigación:

Biotecnología

I.5. Lugar:
Investigación virtual

I.6. Duración estimada del proyecto:

4 meses

I.7. Fecha de inicio:

Enero 2022

I.8. Fecha de término:

Abril 2022
RESUMEN
ABSTRACT
I. INTRODUCCIÓN

El ácido cítrico fue cultivado en el año de 1784 por el investigador Scheedle, quien observó por
primera vez una estructura cristalizada generado por el jugo de limón, en 1860 el uso de sales de
calcio se obtenía de la fruta, el rendimiento que se obtuvo fue muy bajo, ya que en 1893 Wehmer
reportó que ciertos hongos (especies de Penicillium) los cuales producían ácido cítrico cuando se
cultivaban en una solución de azúcar y sal inorgánica. En 1920 se desarrolló un método muy
exitoso el cual fue el proceso de fermentación, donde comúnmente se utilizó el género de
Aspergillus niger las cuales fueron usadas como ayuda a la melaza de remolacha, esto elaborado
por los hermanos Pfizer (Pérez et al., 2016).

Desde la antigüedad, este ácido cítrico viene siendo un ácido orgánico débil que normalmente se
puede encontrar en todos los cítricos, actualmente constituye como uno de los más usados en la
industrias por tener variedad de propiedades y es por estas mismas propiedades que han ubicado al
ácido cítrico en una buena posición que predomina en el mercado internacional, generando
competencias en diferentes productores, haciendo una búsqueda de rutas en donde la producción
sea más eficiente reduciendo costos e incrementando ganancias. Esta sustancia se puede obtener de
manera industrial aunque los costos son más elevados en comparación al ácido obtenido mediante
rutas de fermentación microbiana (Guerra et al., 2019).

En escala porcentual el 99% de su producción a nivel mundial de ácido cítrico proviene de

procesos microbiológicos siendo la productividad al año de 1.5 millones de toneladas,
distribuyéndose el 70% en las industrias alimentarias utilizándose como acidificador o antioxidante
para mantener aromas y sabores de diferentes jugos de fruta, el 20% se utiliza en industrias
farmacéuticas mediante antioxidantes para que las vitaminas estén bien conservadas, y el 10% que
resta es útil en la industria química y en la metalurgia para la supresión del óxido que se encuentra
en los metales, siendo el bronce y aleaciones, también es utilizado en la industria encargadas de la
fabricación de los detergentes como un reemplazante de fosfato, debido a que presenta baja
contaminación en el ambiente (Guadalupe, et al., 2020).
 Los géneros como, Monilia, Aspergillus,Pichia, Penicillium, Candida y Citromyces son
capaces de producir y acumular ácido cítrico. Lo que diferencia a las cepas de
Aspergillus y Penicillium en el rendimiento de ácido cítrico es que el primer género
tiene una mínima eficiencia de las enzima aconitasas hidratasas e isocitrato
deshidrogenasa, y una elevada producción de citrato sintetasa, estas actividades son de
gran interés para el microorganismo ya que puede producir una gran cantidad de ácido
cítrico, y se puede suprimir fácilmente ácido isocítrico, ácido oxálico y ácido glucónico
los cuales son productos laterales no deseados (López et al., 2006).

II. MARCO TEÓRICO

1. Microorganismo empleado
Aspergillus niger
Es un hongo filamentoso, ya que hace referencia al color negro de sus esporas.
Clasificación taxonómica:
Filum Ascomycota
Clase Eurotiomycetes
Orden Eurotiales
Familia Trichocomaceae
Género: Aspergillus
Especie: Aspergillus niger
Con respecto a sus estructuras microscópicas presenta: hifas tabiculares y conidioforas
cuya cabeza está localizada en el extremo de una hifa, ya que está compuesta por una vesícula
rodeada por una corona de fiálides en forma de botella la cual está directamente insertada
sobre la vesícula. De las fiálides se van a desprender las esporas (conidios).

El A. niger consume el ácido cítrico en medios que presenten el ión Mn+2 (5 x10-5
μ), de lo contrario la secreción aumentaria significativamente. Se dice que a niveles de 1 ppm
de Mn+2 va a reducir el rendimiento del ácido cítrico en un 10 %. Asimismo, el Mn+2
produce algunos efectos en la morfología del microorganismo, ya que favorece a la
formación de pequeños pellets esponjosos y redondeados, estos son los mas deseados para
una mayor productividad de ácido cítrico. Además que a altos niveles de zinc van a mantener
al microorganismo en una fase de crecimiento (cultivo de hongos), por lo que el ácido cítrico
no se acumulara; los valores óptimos para el Zn+2 y el Fe+2 son 0,3 ppm y 1,3 ppm
respectivamente. Otra forma de aumentar significativamente la producción de ácido cítrico es
adicionando Mg+2 y Cu+2, en pequeñas cantidades.
En algunos casos se emplea el suero de leche como medio de crecimiento, ya que en
la remoción de metales divalentes no es necesaria, por lo que los elementos de mayor
influencia como el manganeso, el zinc y el hierro que se encuentran en concentraciones de
0,001, 0,2 y 1 ppm, respectivamente, ya que están dentro de los intervalos recomendados para
la producción de ácido cítrico con A. niger.

2. Medios y condiciones del cultivo

Para la producción de ácido cítrico por acción de un microorganismo se necesita un
medio el cual presente una fuente de carbono y energía necesaria para llevar a cabo dicha
producción. Diferentes alternativas como suero de leche que es un principal desecho de la
industria láctea siendo el Aspergillus niger quien tiene la capacidad de desdoblar la lactosa y
convertirla en ácido cítrico. Asimismo la utilización de la sacarosa obtenida del azúcar refino
como medio de cultivo; la melaza siendo una de las mejores opciones en la producción del
ácido cítrico son fuentes de carbono muy importantes ya que al ser desechos de algunas
industrias disminuyen el costo en la producción (Perez et al. 2016).
En el caso del Aspergillus niger diferentes estudios utilizan como fuente de carbono la
melaza esterilizada, aunque esta sea rica en nutrientes es necesario suplementar algunos
nutrientes para que no afecte o limite el crecimiento microbiano con nitrógeno, fósforo,
magneso, hierro y azufre (siendo el Mn y Fe en concentraciones muy bajas) así como también
los parámetros utilizados ya sea temperatura, pH y aireación (Rivada Nuñez, 2008).

3. Producción de ácido cítrico

La producción de estos ácidos orgánicos que se genera mediante microorganismos es
de consideración para los procesos metabólicos, de modo que pueda permitir el progreso de la
biotecnología. En la elaboración de ácido cítrico se utiliza el hongo Aspergillus niger y
levaduras las cuales son posibles de sintetizar y excretar ácido cítrico, aunque las levaduras
presentan una dificultad para la purificación de dicho ácido, ya que no solo excreta ácido
cítrico sino que también ácido isocitrico. Cuando estas levaduras generan ácido cítrico estas lo
producen partiendo de hidratos de carbono, principalmente los géneros Candida, Hansenula,
Pichia, Debaromyces, Torula, Torulopsis, Kloekera, Saccharomyces, Yarrowia y
Zygosaccharomyce.
3. Metabolismo
Para la producción del ácido cítrico existen dos formas, la fermentativa y la sintética; cabe
resaltar que el proceso más utilizado y adecuado a nivel industrial por sus buenos
rendimientos, es el proceso fermentativo.
El ácido cítrico se puede encontrar como intermediario en el ciclo de krebs o en el ciclo de
los ácidos tricarboxílicos.

Aquí es donde empieza con una reacción, entre el

ácido dicarboxílico de cuatro carbonos (oxalacetato)
y el Acetil CoA, esta reacción da como resultado un
ácido tricarboxílico de seis carbonos llamado citrato.

Bioquímica del ácido cítrico

Las reacciones que siguen el paso a la producción del ac. cítrico se da fuera de la célula y
empieza a partir de la sacarosa, con una invertasa que tiene la función de hidrolizar a la
sacarosa, convirtiéndola en glucosa y fructosa para ser transportadas dentro de la célula.
Una vez que la glucosa y fructosa están dentro de la célula, son dirigidas hacia la vía
metabólica de la glicolisis, aquí es donde se degradara la molécula de glucosa, dando como
producto a dos moléculas de piruvato más otras dos moléculas del mismo también obtenidas
por degradación de la fructosa.
El piruvato es oxidado en condiciones aeróbicas, para dar como resultado a H2O y
CO2 que se da en el ciclo de ácido cítrico. Para que el piruvato pueda entrar ciclo, este
debe sufrir un oxidacion para dar paso a acetil-coenzima A (acetil-CoA) del grupo
acetilo y CO2 mediante una agrupación estructurada de tres enzimas, siendo esta el
complejo piruvato deshidrogenasa.
El piruvato pierde el grupo carboxilo en forma de molécula de CO2 y los carbonos
que quedan libres son transformados en grupo acetilo del acetil-CoA.
PROCESOS DE FERMENTACIÓN DEL ÁCIDO CÍTRICO
 ● FERMENTACIÓN DE SUPERFICIE
Este proceso es el más longevo en la producción de ácido cítrico, y actualmente solo
el 20% de todo el ácido cítrico se produce mediante este proceso. El cultivo se lleva a cabo
en un plato cóncavo que contiene un medio líquido mientras los microorganismos se
desarrollan en la superficie y los agregados de ácido cítrico en el medio. Dicho proceso
fermentativo, consta de varias etapas: primero, la solución nutritiva (medio de crecimiento) se
esteriliza a un pH de 5. Esta solución se carga en una bandeja de aluminio previamente
desinfectada en la cámara de fermentación; por lo que se hace circular aire filtrado y se enfría
aproximadamente a 25ºC, cuando la temperatura ambiente es alta. Se rocía una suspensión de
esporas de moho sobre la superficie de cada bandeja y se mantiene la temperatura a 30-32 °C
para lograr la germinación del micelio, esto tomará de 3 a 5 días. Luego de esto comienza la
fermentación, la temperatura sube a 35°C y se libera CO2. Después de 12-13 días, se obtiene
un líquido que contiene 8-12% de ácido cítrico. El micelio se lava para producir una solución
que contiene 2,5-3,5% de ácido cítrico. Esta solución se envía a la planta de purificación y
cristalización junto con el líquido obtenido directamente de la bandeja.

El medio con ácido se puede retirar por salidas laterales y para la capa de micelo se
suele agregar medio fresco sin perturbar. Estas bandejas para que sean resistentes a la
corrosión están construidas de acero y de aluminio puro y su tamaño varía entre los 2 a 4
metros de lado y de l5 a 25 cm de profundidad, esto quiere decir que en tan solo una bandeja
al ras de medio puede pesar de 400 kilos a 1.2 toneladas. Las bandejas se ponen en las
estanterías de un ambiente cerrado con sistemas de aireación para los diferentes lados. Esta
ventilación es muy importante ya que sirve para poder controlar las temperaturas, y en baja
medida para dar oxígeno y controlar la humedad. Los cuartos de fermentación se limpian
cuidadosamente con desinfectantes y antes de iniciar cada ciclo de operaciones, se logran
condiciones asépticas con vapores de formaldehído o dióxido de sulfuro. Las materias primas
son melazas diluidas hasta concentraciones de azúcar entre 15 y 20%. Se agregan los otros
nutrientes al medio y la solución se acidifica con ácido fosfórico hasta pH 6.0-6.5.
Posteriormente es tratado a calor por 15 a 45 minutos y al final se le añade ferrocianato de
potasio, lo cual tiene la finalidad de precipitar o complejar los metales que no favorecen en el
proceso de fermentación (Fe, Mn, Zn, etc.), tiene la función de inhibir el crecimiento y
estimular la producción de ácido cítrico. El proceso empieza cuando las esporas son
inoculadas sobre el medio de cultivo. Se pueden utilizar suspensiones de esporas o esporas
secas las cuales son mezcladas con el aire de la ventilación. Existen casos en los que se utiliza
el micelio disgregado en un homogeneizador. Pasados de uno o dos días termina la
germinación de las esporas y 6-8 dias después la concentración de ácido cítrico alcanza su
punto máximo, aunque, dependiendo de la cepa, en otros procesos la duración total alcanza a
30 días y se obtienen concentraciones de ácido cítrico mayores de 90 g/l. Es aquí donde se
puede retirar el medio consumido para extraer el citrato y agregar medio fresco.

● PROCESO DE FERMENTACIÓN SUMERGIDA

La producción de ácido cítrico a través de la fermentación sumergida requiere poco
espacio y tiene una gran capacidad de producción, la fabricación se puede llevar a cabo ya
sea en un reactor de tanque agitado o en una torre de fermentación. Teniendo en cuenta el
bajo nivel de pH que se produce durante la fermentación y el hecho de que el ácido cítrico se
degrada, es mejor el uso de compuestos orgánicos resistentes al ácido cítrico (biorreactores).
Los métodos de preparación de la fermentación sumergida incluyen la extracción eficiente de
la melaza, el pre tratamiento, la suplementación de nutrientes y la esterilización del sustrato.
La inoculación se lleva a cabo bien sea agregando una suspensión de esporas, cuando se usan
esporas deben encontrarse dispersas en el medio, por lo que es necesario la adición de un
agente tensoactivo. Para que crezca el micelio pre cultivado, su tamaño adecuado (inóculo)
debe ser aproximadamente el 10% del medio fresco (Reyes et al., 2003).
El aire está cubierto por un sistema de enfriamiento en el rango de entre 0.5 a 1.5
vvm, sin embargo, por consideraciones económicas, es mejor comenzar con un flujo de
ventilación pequeño (0.1 a 0.4 vvm). Durante la fermentación, se puede producir grandes
cantidades de espuma, estos son eliminados o corregidos por medio de antiespumantes o
rompedores. En condiciones ideales, la fermentación se completa de 5 a 10 días, dependiendo
de las especificaciones del proceso. La fermentación sumergida se lleva a cabo de manera
continua o en lote, el proceso continuo se realiza el laboratorio pero no están disponibles
comercialmente (Medina, 2014).

Este proceso de fermentación tiene de tres etapas:

Etapa 1: En esta etapa se prepara el inóculo en base a la germinación de esporas de

Aspergillus niger, su acumulación y producción en la masa de semillas.
Etapa 2: Consiste en transferir parte del inóculo a la masa fermentada (principal) para
permitir que los microorganismos cumplan con sus requerimientos de crecimiento.
Etapa 3: Retrasa el crecimiento de microorganismos y promueve la fermentación y
la producción de ácido cítrico. Esto se logra limitando la concentración de uno de los
nutrientes como fósforo, magnesio, hierro y zinc. Para la preparación del inóculo, se prepara
utilizando esporas de Aspergillus niger infundidas en condiciones estériles sobre un sustrato
de crecimiento con nutrientes fortificados, añadidos y a condiciones de pH ajustadas. Una vez
que se siembran las esporas, la mezcla requiere aireación y agitación adecuada. Esto se logra
soplando o burbujeando aire en el inóculo. El período de duración de la incubación es de 18-
30 horas y la temperatura es de 20 a 35ºC. El inóculo se puede presentar en forma de esporas
o en pequeños gránulos de micelio. El sustrato de crecimiento debe de ajustarse a un pH de
4.0 a 2.8 para que las esporas puedan lograr un crecimiento adecuado y concentración
suficiente. Esto es necesario para lograr buenos resultados en la producción de ácido cítrico.
El inóculo debe ser el 10% de la masa total. Si la temperatura en el fermentador no se
mantiene en el rango de 28-30ºC la producción de ácido cítrico disminuirá y la acumulación
de ácido oxálico aumentará. Si la agitación en el fermentador es inadecuada, el micelio se
colocará en capas o estratificaciones en el fermentador. Ocurre durante períodos en donde se
suprime el crecimiento de hongos y aumenta la producción de ácido cítrico. La formación de
esta estratificación hará decrecer la velocidad de formación de ácido cítrico, pero una
agitación suficiente evita este comportamiento y proporciona una buena eficiencia.

● PROCESO DE FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO

Este método es muy sencillo para la producción del ácido cítrico, hace uso de las materias
primas ricas en almidón provenientes de la producción de almidón, entre ellos encontramos
pulpa de batatas, salvado de trigo y arroz. Para su fácil almacenamiento y transporte estas
materias primas se secan hasta un 5 a 15% de humedad.
El paso 1 para la producción de A. cítrico es humedecer el sustrato hasta un 65 a 70% de
contenido de H2O, luego se seca el excedente de agua, seguido a eso se trata la masa con
vapor, generando como resultado una masa de almidón relativamente estéril. La inoculación
se procede con esporas del microorganismo (hongo), luego estos germinan y el micelio
degrada el almidón, el hongo hace uso a los hidratos de carbono adquiridos como fuente de
carbono del ácido cítrico que es segregado, tiene una duración de 90 hrs, transcurrido ese
lapso se comprime el sustrato y se saca con agua caliente una solución que posee 4% de ácido
cítrico, estos son extraídos por precipitación y extracción, obteniendo el producto final al
citrato de calcio.La inoculación se procede con esporas del microorganismo (hongo), luego
estos germinan y el micelio degrada el almidón, el hongo hace uso a los hidratos de carbono
adquiridos como fuente de carbono del ácido cítrico que es segregado, tiene una duración de
90 horas, transcurrido ese lapso se comprime el sustrato y se saca con agua caliente una
solución que posee 4% de A. cítrico, estos son extraídos por precipitación y extracción,
obteniendo el producto final al citrato de calcio.
Las cepas utilizados en este método tienen que poseer cualidades en acumular el citrato en
presencia de trazas, ya que no se pueden remover del sustrato, una de las formas de aligerar
es agregando amilasas al sustrato, la cual acelera la sacarificación del almidón. También hay
variantes del cultivo en esta fase sólida para hacer uso de otros sustratos como el azúcar de
caña y bagazo.

Proceso de recuperación del ácido cítrico

El ácido cítrico se repara de forma efectiva y esta se pueda purificar sencillamente. El
agente que presenta ácido cítrico se pone en presencia a una resina básica libre, de la fase
sólida que tiene grupos amina terciarios para así absorber el ácido cítrico. Luego se
absorbe dicho ácido a través de un desplazamiento con otro ácido más fuerte y se
recolecta una parte que contenga ácido cítrico y que no esté contaminada por el ácido más
fuerte. Para otro proceso de recuperación, el elemento que contiene ácido cítrico se pone
en contacto con el polímero de la fase sólida que tenga piridina para así poder absorber el
ácido cítrico, el cual va a tener una conexión con una temperatura menores a 40 °C. Luego
el ácido cítrico es absorbido con H2O caliente a temperatura de 75 °C, evitando la
impureza, como las que se dan con la utilización de solventes orgánicos.

APLICACIÓN DEL ÁCIDO CÍTRICO

El ácido cítrico es utilizado debido a sus propiedades como aditivo:

● Conservante: Es utilizado como acidulante ya que de esta manera va

a disminuir el pH del producto, y los alimentos tendrán un periodo de
conservación más amplio y así también reducirán los
microorganismos que puedan crecer en él.
● Saborizante: El ácido cítrico aporta propiedades organolépticas de
los alimentos, estos son agregados a diferentes alimentos, por
ejemplo: helados, refrescos, mermeladas, entre otros.
● En la industria alimentaria: Gracias al delicioso sabor y su elevada
disolución en el agua.

● Las industrias farmacéuticas: Se encuentran los efervescentes en

polvo y en los comprimidos en conjugación con los bicarbonatos.
● La industria cosméticas: Aporta en los productos para el uso
personal, ya que esta sustancia puede aclarar la tonalidad de la piel y
eliminar manchas oscuras
● Para usos médicos: Es utilizado para eliminar bacterias
perjudiciales, así como infecciones que se encuentran en el área
superficial de la piel, mayormente en personas que tienen
comorbilidad ya sea pacientes mayores de edad, con diabetes o
personas adictos al tabaco.
● Productos de limpieza: El ácido cítrico se añade a detergentes y productos de
limpieza para darles estabilidad, acidez y reemplazar a los agentes corrosivos
más fuertes ya que puede provocar corrosión en los metales

● Ayuda a prevenir el deterioro de la decoloración tanto de frutas como vegetales.

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