Cultivo tejidos laboratorio

Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales Universidad de Sucre
UNIVERSIDAD DE SUCRE.
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS.
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUIMICA.
PROGRAMA DE BIOLOGIA
ASIGNATURA DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.
PROFESOR: JAVIER D. BELTRAN H. Ph.D.
LABORATORIO CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Nº 1:
“INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS”
1. INTRODUCCIÓN.
El cultivo de tejidos vegetales abarca un grupo de técnicas que consiste en el

cultivo bajo condiciones asépticas de las diferentes partes de la planta. Estas
técnicas tienen gran potencial para estudios básicos y aplicados en la
micropropagación de especies económicamente importantes y como un modelo
para estudios fisiológicos, bioquímicos, genéticos y morfológicos. La mayoría
de las técnicas de cultivo de tejidos descritas en la literatura pueden ser
aplicadas universalmente, sin embargo, se deben hacer modificaciones para
adaptarlas a las condiciones locales de un laboratorio. Gran parte del equipo
empleado en el laboratorio de cultivo de tejidos tiene como propósito controlar
las condiciones bajo las cuales se desarrollan las técnicas in vitro.
2. AREAS QUE COMPRENDEN UN LABORATORIO DE CULTIVO DE

TEJIDOS VEGETALES
1. Área Prebox.
2. Área de lavado.
3. Área de esterilización.
4. Área de preparación de medios.
5. Área Cuarto oscuro.
6. Área de transferencia.
7. Área de incubación.
8. Área de procesamiento de datos.
9. Área de Patología.
10. Área de Diagnostico.
11. Área de Conservación
Javier D. Beltrán H...

10
7
6
5 1 9 11
2
3
8 4
Escala: 1 cm = 2m
.
3. NORMAS DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES.
- Es indispensable el uso de bata blanca, polainas, gorros, mascarillas, y

guantes totalmente limpios.
- No consuma ninguna clase de comidas ni bebidas dentro del laboratorio.
- No escriba sobre los mesones ni los raye.
- No pipetear ningún reactivo o solución con la boca, utilice las pipetas

automáticas o una pera de caucho.
- No colocar bolsos ni libros en las mesas de trabajo.
- Usted es responsable de los equipos y materiales que se le entreguen,

revíselos y límpielos antes y después de la práctica
- Si ocurre cualquier tipo de accidente comuníqueselo inmediatamente al

profesor o al técnico del laboratorio.
- Todo material debe estar rotulado, así evitara perdidas o confusiones.
- No ingresar, ni sacar ningún tipo de material al laboratorio sin previa

autorización.
- Cualquier irregularidad comuníquela inmediatamente al profesor o al

técnico de laboratorio.

- Seguir estrictamente las instrucciones contenidas en las guías de

laboratorio y/o las dadas por el profesor o técnico del laboratorio.
-
4. PREGUNTAS PARA LA DISCUSIÓN.
1. Cual es la función da cada una de las áreas que comprenden el laboratorio?

¿Cuánto mide el área (en metros cuadrados) de una de las áreas presentadas
en el plano de la guía, de acuerdo a la escala?
2. Cuáles son los equipos de un laboratorio de cultivo de tejidos, cual es su

área de ubicación y cuál es su función?
3. Diseñe con planos (incluya la escala) su laboratorio ideal para cultivo de

tejidos. Especifique el tipo de dedicación específica. (Ejemplo: académico
comercial, de investigación y/o rural de bajo costo).
4. Porque es importante registrar la marca del reactivo utilizado y su código de

fabricación?
5. ¿Cuál es la importancia del Manual de Bioseguridad de un laboratorio?
6. Explique una razón por la cual seria necesario hacer experimentos con
cultivo de tejidos de plantas in vitro en la Estación Espacial Internacional.
7. Hacer cualquier otra observación o recomendación que usted crea

conveniente.
Nota: Reporte fuentes consultadas como revistas, libros, URL´s entre otras.
Direcciones de interés:
https://www.growell.co.uk/advice/hints-tips/light-measurement-lumens-lux-par-
and-micromoles

PROFESOR: JAVIER D. BELTRAN H. PhD.
LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS N.º 2:
“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES Y STOCK’S”
I. INTRODUCCIÓN.
El éxito del cultivo de tejidos en las plantas esta muy influenciado por la
composición química de los medios de cultivo utilizados, y otros factores físicos
y/o ambientales. Es conocido que para un crecimiento adecuado las plantas
necesitan tomar del suelo cantidades importantes de nutrientes. Los
componentes del medio de cultivo de tejidos incluyen macronutrientes,
micronutrientes, suplementos de hierro, vitaminas, fuentes de carbono,
reguladores de crecimiento y eventualmente otros aditivos como antioxidantes,
y otras fuentes de compuestos orgánicos.
II. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES “STOCK”
Es necesario utilizar agua destilada, bidestilada o desmineralizada destilada, la

cual debe estar estéril. Todas las soluciones se deben preparar en un matraz
aforado, se deben rotular con el nombre de cada solución stock, y la fecha de
preparación. Se preparan de acuerdo al siguiente cuadro numero 1:
Cuadro 1.
REACTIVO CANTIDAD (gr) VOLUMEN (ml) SLN MADRE
(ml/250 ml de medio)
MgSO4 7H2O 3.7 100 6.25
MnSO4 1H2O 6.7 100 6.25
ZnSO4 7H2O 3.44 100 6.25
CuSO4 5H2O 0.1 100 0.625
KI 3.32 100 0.625
CoCl 6H2O 0.1 100 0.625
H3BO3 2.48 100 0.625
NaMo 2H2O 1.0 100 0.625
Nota: para diluir el H3BO3 se debe calentar el agua. ¿Por qué?
III. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES MADRES.
Es necesario utilizar agua destilada, bidestilada o desmineralizada destilada, la

cual debe estar estéril. Todas las soluciones se deben preparar en un matraz
aforado, se deben rotular con el nombre de cada solución y la fecha de
preparación. Se preparan de acuerdo al siguiente cuadro numero 2:

Cuadro 2.
SOLUCION REACTIVO Para 250 ml Para 500 ml Para 1000 ml
Nitratos NH4NO3 41.25 gr 82.5 gr 165 gr
KNO3 47.5 gr 95.0 gr 190 gr
MgSO4 7H2O 6.25 ml 12.5 ml 25 ml
Sulfatos MnSO4 4H2O 6.25 ml 12.5 ml 25 ml
ZnSO4 7H2O 6.25 ml 12.5 ml 25 ml
CuSO4 5H2O 0.625 ml 1.25 ml 2.5 ml
CaCl2 H2O 11.0 gr 22.0 gr 44.0 gr
Haluros KI 0.625 ml 1.25 ml 2.5 ml
CoCl 6H2O 0.625 ml 1.25 ml 2.5 ml
KH2PO4 4.25 gr 8.5 gr 17.0 gr
P Bo Mo H3BO3 0.625 ml. 1.25 ml 2.5 ml
NaMoO4 0.625 ml 1.25 ml 2.5 ml
Fe Na EDTA Na EDTA 0.93 gr 1.86 gr 3.72 gr
FeSO4 7H2O 0.645 gr 1.29 gr 2.58 gr
Nota: - Para diluir los nitratos se debe calentar el agua destilada. ¿Por qué?
- Los haluros se deben almacenar en frasco ámbar y todas refrigeradas.
- Anotar la temperatura inicial de reacción (endo(-),exo (+) y/o neutra(0)),
los tiempos de dilución de los reactivos, y el color final de la solución.
IV. PREGUNTAS:
1. Cuál es la concentración en mg/L de cada una de las soluciones stock

preparadas?
2. Calcule la concentración molar final de cada compuesto de la solución

madre de nitratos.
3. Porque es conveniente preparar stocks y/o soluciones madres de los

nutrientes?
4. ¿Cuál es la mejor forma de almacenar y conservar las soluciones?
5. ¿Cuales son las principales fuentes de contaminación de las soluciones?

¿Como evitarlo?
6. ¿Que son reacciones endo- y exo- térmicas? ¿Cuáles de los

compuestos utilizados presentan dichas características?
7. ¿Porque se deben almacenar algunas substancias en frascos ámbar?
8. ¿Cuál podría ser la importancia de detectar la temperatura, el color y el

tiempo de dilución de cada sustancia?
9. Anote cualquier otra sugerencia que UD. crea conveniente tener en

cuenta durante la preparación de las soluciones.
Nota: Incluir en el informe imágenes, cálculos y/o descripciones de las

preparaciones o diluciones realizadas.

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS Nº 3:
“COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO Y PREPARACIÓN”
En general los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes

componentes:
1. Macronutrientes. Son compuestos inorgánicos requeridos en cantidades

relativamente grandes. Además, de C, H, y O, se requieren nitrógeno, fósforo,
potasio, magnesio, calcio, y azufre. El nitrógeno esta presente como iones
nitrato (NO3-) o amonio (NH4+) o en una combinación de ambos. El sulfato de
magnesio (MgSO47H2O) provee los requerimientos de Mg y S. El fosforo
puede estar también presente en la forma de NaH2PO 4H2O, KH2PO4, o
(NH4) H2PO4. Los requerimientos de calcio son aportados por el CaCl2 2H2O,
Ca (NO3)2 4H2O, o la forma anhidra de estas sales.
2. Micronutrientes. Pequeñas cantidades de ciertos minerales son también

necesarias a las células. Se requieren Fe, Mn, B, Cu, Zn, I, Mo, Co, Cl y Ni.
Estos nutrientes pueden estar en muy pequeñas cantidades y soluciones
concentradas de ellos, es necesario prepararlas con anterioridad (excepto para
el hierro). Por esto, es necesario preparar con anterioridad las soluciones
madres y “stocks” de macronutrientes, micronutrientes, reguladores de
crecimiento y vitaminas. Estas soluciones se puedan almacenar por periodos
limitados en frascos de vidrio a 4°C. Los micronutrientes esenciales para todas
las plantas superiores incluyen el hierro, manganeso, zinc, boro, cobre,
molibdeno, yodo y cloro.
Algunas plantas requieren micronutrientes, así mismos tejidos tomados de

estas plantas los necesitan. Sodio (Na) puede ser un micronutriente para
ciertos halófilos, plantas con metabolismo C4 y plantas crasuláceas (cactus). El
níquel es necesario en plantas como la soya. El yodo en la forma de KI forma
parte de diferentes medios, así como el cobalto, aunque el carácter de sus
funciones es indefinido o asociado a crecimiento y metabolismo. El agar es
fuente, también, de minerales, vitaminas y otras sustancias de carácter toxico.
3. Suplementos de hierro. Se prepara independientemente por el problema de

solubilidad. El hierro requiere condiciones acidicas para su solubilidad. Por lo
general la solución madre de hierro se prepara en forma quelatada como sal
sodica del ácido etilendiaminotetracetico (NaFeEDTA). El EDTA puede producir
efectos colaterales en ciertas enzimas y en procesos de morfogénesis.
También, la degradación del EDTA por la luz puede producir efectos
inhibidores en el desarrollo de las plantas in vitro.

4. Vitaminas. Se requieren en pequeñas cantidades y tienen funciones

catalíticas en sistemas enzimáticos. Tiamina (Vitamina B1) parece ser la única
vitamina esencial para cultivo de tejidos de plantas, mientras que el ácido
nicotínico (Niacina) y piridoxina (Vitamina B6) podrían estimular el crecimiento.
La tiamina (Tiamina HCl) es añadida en cantidades entre 0,1 a 100 mg/L. Su
necesidad es mayor cuando hay bajas concentraciones de citoquininas o
viceversa. Otras vitaminas (B2, B5, B6, B12, C, E y H) han sido usadas en
cultivo de tejidos.
5. Fuentes de carbón. El azúcar (sacarosa o D-glucosa), en general se usa en

concentraciones de 20.000 a 30.000 mg/L. Este azúcar permite el crecimiento
óptimo que puede variar si se cambia por otros monosacáridos o disacáridos.
Como el azúcar es sensitiva al calor, cuando se autoclava con el resto de
nutrientes puede convertirse en otros azucares como D-fructosa. Esto puede
conducir a resultados que serian diferentes si se utilizara una solución de
azúcar esterilizada por filtración.
6. El myo-inositol, un carbohidrato, es añadido como un factor de crecimiento

a la concentración de 100 mg/L. Este puede ser importante como en
almacenamiento, transporte y liberación de auxinas.
7. Reguladores de crecimiento. Se requieren combinaciones de auxinas y/o

citoquininas para la mayoría de los cultivos celulares. El termino “hormonas” o
fitoreguladores es para las de origen vegetal. Otras sintéticas como el 2,4-D y
la kinetina, no son hormonas vegetales. Las auxinas (acido indolacetico AIA, 2
4-D), estimulan las raíces adventicias, inhiben la formación de yemas y son
importantes en la embriogénesis. Las citoquininas (kinetina, zeatina, BAP)
promueven la división celular en presencia de las auxinas. Giberelinas (GA3)
pueden ser usadas para el crecimiento de meristemos apicales y diferenciación
de haces vasculares.
Otros componentes son aminoácidos, fuentes de nitrógeno, suplementos

orgánicos, carbón activado, osmóticos y calidad del agua.
8. PREPARACIÓN DEL MEDIO BASAL (MB)
Para preparar el MB (fuente de carbono + nutrimentos minerales + vitaminas)

se utilizará el procedimiento descrito por Murashige y Skoog (1962) el cual es
considerado de carácter universal. La preparación se puede realizar de
diversas maneras de acuerdo con el consumo y necesidades de cada
laboratorio. Generalmente se preparan unas soluciones concentradas
denominadas “stock`s”, de las cuáles se parte para preparar las soluciones
madres.
8.1 PREPARACIÓN DE 1 LITRO DE MEDIO MURASHIGE – SKOOG (MS).
1. Añada 200 ml de agua destilada en 1 beaker de 1 litro.
2. Adicione 10 ml de cada una de las soluciones madres (Nitratos, Sulfatos,

Haluros, P BoMO y Fe Na EDTA)

3. Pese 30 gr de sacarosa (3%) y disuélvalos
4. Pese 100 mg de Mioinositol
5. Pese 0.1 mg de tiamina HCL
6. Añada las hormonas o reguladores correspondientes (2,4 D, Picloram,

etc..: stocks 100 mg/mL) al medio (cuando sea necesario). En general,
para el establecimiento inicial de nudos o ápices in vitro no son
necesarias.
7. Añada agua destilada hasta que el volumen alcance unos 950 ml
8. Ajuste el pH a 5.8 mientras se agita la solución, con gotas de NaOH 1N

(o lentejuelas), para subirlo; o HCL 1N, para bajarlo. Estas soluciones se
aplican con goteros o pipetas individuales.
9. Complete al volumen final de 1000 ml.
10. Adicionar 0.6-0.8 % de agar, grado tejidos vegetales, o 0.2 % de gelrite

(2 gr).
11. Prepare de antemano los frascos de cultivo y esterilícelos
12. Vierta en cada uno la cantidad apropiada de medio
13. Tape cada frasco con papel aluminio. Empaque en papel Kraft o papel
periódico sellados con cinta de enmascarar o cinta para autoclave.
14. Autoclave los medios de cultivos y guárdelos hasta el momento de la

inoculación. (Anotar manejo y procedimiento del auto clavado).
9. PREGUNTAS:
1. Nombre otros tipos de medios de cultivo de tejidos vegetales diferentes

al MS, de que sustancias o compuestos están constituidos, y ¿cómo son
diferentes entre si? (comparar tres medios diferentes)
2. ¿Hay medios específicos para algunas especies vegetales? Nombre

cinco medios para cinco especies vegetales diferentes, y diga en que se
diferencian estos medios.
3. ¿Cuales son algunas fuentes de contaminantes orgánicos e inorgánicos

que se pueden presentar en los medios de cultivo?
4. ¿Cuáles podrían ser las evidencias, para afirmar que los cultivos de
tejidos de plantas in vitro, y/o el medio puedan experimentar cambios
bioquímicos con el tiempo?

5. ¿Cuál cree Ud. que son las posibles ventajas o desventajas de usar
medios sólidos, semisólidos, líquidos o doble fase, en el proceso de
micropropagación de tejidos vegetales?
6. Proponga un medio para cultivar in vitro una planta de su interés. Incluya

referencias.
Nota: Reportar referencias, cálculos, conversiones, concentraciones y

volúmenes (una gota: ± 40 µL, o peso de la lentejuela) de ácido o base, usados
para calibrar pH (pH inicial y final).

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Nº 4:
“ESTABLECIMIENTO DE MATERIALES DE LA PLANTA IN VIVO A IN

VITRO”
1. INTRODUCCION
Al iniciar un sistema de cultivo de tejidos como paso fundamental hay que

controlar y eliminar interacciones exógenas al sistema por parte de
microorganismos que pueden influir directamente en el establecimiento de los
cultivos in vitro, incubación y posterior manejo. Para controlar esos organismos,
se desinfectan las plantas madres con productos químicos que son tóxicos
para los microorganismos, pero relativamente inocuos para el material vegetal,
lo cuál ayuda en los tratamientos posteriores a la desinfección de los explantes.
Una vez se establece un método eficaz para eliminar los patógenos del
explante y considerando que el explante elegido es fisiológicamente
competente para sobrevivir al cultivo inicial, prácticamente se puede garantizar
su establecimiento in vitro. Su crecimiento y posterior desarrollo se darán
apropiadamente por las interacciones existentes entre el genoma de la planta y
el medio ambiente, es decir entre el medio intra, inter y extracelular de esta,
con las condiciones de luz, temperatura, humedad relativa, aporte de nutrientes
y agua que la ambientan.
2. MATERIALES Y METODOS.
2.1 Las plantas madres.
2.1.1 Desinfección de la semilla. Inicialmente lávela con un detergente

comercial por 20 minutos, luego enjuague dos veces con agua, y después
aplique una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 20 minutos y se
enjuagan con tres cambios de agua. Dependiendo del material inicial los
procedimientos pueden variar.
2.1.2 Tipo de sustrato. El sustrato a emplear debe estar compuesto por 2

partes de materia orgánica (aserrín y estiércol de ganado), 1 parte de arena y 1
parte de suelo arcilloso pardo oscuro.
2.1.3 Esterilización del sustrato. La mezcla se empaca en bolsas de papel

periódico de 1Kg y se esteriliza en autoclave a una temperatura de 259 ºF
(___ °C), y 20 libras de presión durante 25 minutos.
2.1.4 Sembrado y distribución de las plantas madres. Siémbrelas en vasos

desechables de 16 onzas o en bolsas de propileno de media libra, y para tener

un mayor control de cada una de las plantas madres distribúyalas en lotes de

varias plantas cada lote dentro de la casa malla.
2.2 El Explante
2.2.1. Tipo de explante. Pasados unos 45 días después de sembradas las

plantas madres, ser regadas diariamente con agua y fertilizadas cada 15 días
con una solución del 50% de las sales MS, se obtendrá un brote por planta de
aproximadamente 5 a 8 nudos los cuales se cosechan y toman como
explantes.
2.2.2 Corte y preparación del explante. Cada brote se corta dejando como
mínimo 1 yema axilar en la planta para que vuelva a rebrotar, al brote se le
cortan las hojas y la yema apical, luego se cortan los brotes por la parte
internodal y se dejan de un largo aproximado de 2 cm, luego deposítelos en un
erlenmeyer con agua limpia.
2.2.3 Lavado del explante. Agite los explantes en el erlenmeyer suavemente y

cambie el agua dos veces, luego lávelos con un detergente comercial una o
dos veces por 5 minutos cada vez y enjuáguelos tres veces con agua, retire el
agua con mucho cuidado de no dejar salir o caer a ningún explante. Luego
llévelos a la cámara de siembra.
2.3 El medio de cultivo - MC.

Se utiliza el procedimiento para preparar el medio basal (fuente de carbono +
nutrimentos minerales + vitaminas), el descrito por Murashige y Skoog (1962),
el cuál es considerado de carácter universal (Laboratorio N° 3).
2.4 Material utilizado en la siembra.

Todo el material que se utilizará en la siembra esterilícelo en el autoclave a una
temperatura de 259 ºF ( °C), 20 libras de presión durante 25 minutos. Estos
materiales son: las pinzas, los mangos de bisturí, el papel aluminio, el papel
absorbente, el algodón, los frascos auxiliares, y el agua destilada; las batas, los
gorros, los tapabocas y guantes, deben estar limpios o estériles. Las soluciones
que se utilizaran prepárelas con antelación y etiquételas bien para no ser
confundidas al momento de ser utilizadas. Estas soluciones son: la de
hipoclorito de sodio, de peróxido de hidrógeno, y la del alcohol.
2.5 Preparación de la cámara de siembra.

La limpieza y desinfección inicial de la cámara de flujo laminar, realícela por
todas partes con algodón humedecido en una solución de alcohol al 70%.
Ingrese todo el material necesario para la siembra y organícelos. Los frascos
con MC se limpian exteriormente con alcohol al 70% para minimizar el ingreso
de contaminantes al cubículo de trabajo, ingrese el resto del material de apoyo
exceptuando las soluciones de hipoclorito, peroxido y alcohol. Encienda la luz
ultravioleta por 30 minutos antes de iniciar la sesión de trabajo.
2.6 Desinfección del explante*.

Después de ingresar los explantes a la cabina de trabajo adicione la solución
de alcohol al 70% por 10-30 segundos agitando suavemente, enjuáguelo con

agua destilada y decante, luego adicione el peróxido de hidrógeno al 2% por 1-

5 minuto (s), agítelo de manera constante y suave durante todo el proceso,
luego retírelo, y enjuague inmediatamente con agua destilada estéril, y por
último adicione la solución de hipoclorito de sodio a la concentración y tiempo
establecido, luego enjuague cuatro veces con agua destilada estéril,
manteniendo en agua destilada estéril hasta su procesamiento.
2.7 Procesamiento del explante.

Luego del tratamiento de la solución de hipoclorito de sodio, usualmente los
cortes de los explantes expuestos se lesionan y queman o necrosan en sus
extremos, estas partes afectadas deben eliminarse así: tome el explante con
las pinzas y colóquelo sobre el papel absorbente estéril, con el bisturí proceda
a cortar, con movimiento de serrucho, las partes extremas quemadas teniendo
sumo cuidado de no estropear la yema del segmento nodal. El papel
absorbente se debe cambiar máximo cada 5 explantes procesados o cuando
Ud. intuya algún riesgo de contaminación.
2.8. Implantación del explante en el medio de cultivo.

Al abrir el frasco debe colocarlo paralelo al flujo de aire, luego tome
suavemente el explante con las pinzas y lo siembra en el MC, teniendo
especial cuidado de no introducirlo demasiado ni dejarlo muy superficialmente
que se pueda salir del MC, y correrse para los lados al transportarse. Al
terminar este procedimiento selle el frasco con 2 o 3 vueltas del plástico
sellante (cristaflex), para que el papel aluminio se fije bien a la boca del frasco y
evitar la deshidratación acelerada del medio de cultivo y la plántula.
2.9 Incubación de los explantes.

Se realiza en el cuarto especialmente adaptado y con condiciones controladas,
se incuban bajo condiciones de laboratorio, a una temperatura de 28ºC, un
fotoperíodo de 12 horas, y una intensidad lumínica fotosintéticamente activa
(PAR) de unos 30-50 µmol de fotones m-2 s-1.
Nota: (*) Si necesario diseñe tratamientos para el lavado y desinfección del

explante así: 1°. Proponga dos concentraciones de detergente para lavarlos;
2°. Desinfecte con diferentes concentraciones de hipoclorito, o con la misma,
en tiempos diferentes. 3. Cuando necesario trate con bactericidas y/o
fungicidas.
3. PREGUNTAS:
1. Cuáles son los agentes contaminantes, más comunes, que se presentan

en el establecimiento de los cultivos “in vitro”. Calcule el porcentaje (%)
para cada tipo de contaminante que se observa cada semana, y durante
5 semanas.
2. Como se pueden disminuir y/o eliminar estos contaminantes in vitro, sin

dañar los tejidos vegetales?
3. ¿Qué factores hay que tener en cuenta para el control de la

contaminación de los cultivos de in vivo a “in vitro”?

4. ¿De acuerdo a lo observado, porque el tejido de algunas especies

presenta mayor o menor contaminación que otras especies in vitro”?
¿Factores que podrían influir?
5. Posteriormente, anote que factores influyen negativa y/o positivamente

en el buen desarrollo de los explantes? ¿Qué otra clase de explante o
tejido utilizaría?
6. ¿Como comprobaría usted la acción de las auxinas y citoquininas, si

fuesen incorporadas al medio de cultivo?
7. Realice un seguimiento de la longitud del tallo, número de nudos,

número de hojas verdes, número de hojas cloróticas (amarillas), número
de hojas muertas, medición de número y largo de raíces (cms), color del
medio (diseñando su propia escala o usando la sugerida), y con los
datos obtenidos realice las graficas correspondientes y sus respectivos
análisis estadísticos (promedios). Evaluar contaminación (%) con
presencia o ausencia de hongos, bacterias, y/o algas entre otros.
8. Reporte referencias.

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACIÓN Y CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA Y QUIMICA
ASIGNATURA DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
“MULTIPLICACION DE CULTIVOS IN VITRO”
1. INTRODUCCION
El objetivo de la multiplicación de plántulas in vitro es el de obtener mediante la

propagación agámica, un conjunto de individuos genéticamente estables e
iguales a la planta de la cuál estos se tomaron. Estos individuos deben reunir
una serie de características deseables, asegurando e incrementando la
productividad del cultivo. Existen diferentes estrategias dentro del proceso
morfogenético para la multiplicación clonal, utilizando brotes de yemas
terminales, axilares o laterales. Es así, como el punto de inicio son los
meristemos, las puntas de los brotes, las yemas, los nudos o los brotes de
yemas en tallos. En síntesis, las células somáticas pueden ser inducidas a la
morfogénesis, dando paso a la aparición de estructuras que se convertirán en
los órganos que hacen parte de la arquitectura normal de la futura planta. Así,
la micro propagación clonal permite la obtención del material necesario para la
siembra masiva de plantas artesanales, alimenticias, medicinales,
ornamentales e industriales.
2. MATERIALES Y METODOS
2.1 Preparación de la cámara de siembra. La limpieza y desinfección inicial

de la de la cámara de flujo laminar, realícela con una mota de algodón
impregnada de alcohol al 70% y/o hipoclorito de sodio al 3%, y deje secar.
Ingrese todo el material necesario para la siembra y organícelos. Los frascos
con MC se limpian exteriormente con alcohol al 70% para minimizar el ingreso
de contaminantes a la cámara, ingrese el resto del material de apoyo,
exceptuando las soluciones de alcohol, peróxido e hipoclorito. Encienda la luz
ultravioleta por 30 minutos antes de iniciar la sesión de trabajo.
2.2 Multiplicación de los explantes. Después de haber crecido

suficientemente (4 a 6 nudos), los explantes se encuentran en condiciones
optimas para ser multiplicados; previamente se ha preparado el medio de
multiplicación seleccionado, se procede a llevar los frascos a la cámara
previamente desinfectada y acondicionada (2.5)
2.3 Preparación de los explantes para ser multiplicados. Tome el frasco, le

quita la tapa de papel aluminio, y con la pinza, tomando suavemente la plántula
por el tallo, la saca y la coloca en el papel absorbente estéril. Luego retire las
hojas necróticas o en mal estado, y corta el tallo, entre los nudos, para sacar

varios explantes; las hojas y el material de desecho los echa dentro del frasco
auxiliar destinado para tal fin.
2.4 Siembra de explantes. Tome el frasco receptor, flamee suavemente, luego

retira la tapa y con mucho cuidado se toman los explantes a razón de uno a la
vez y lo implanta en el medio, introduciéndolo hasta la mitad. Se pueden
sembrar de 2 a 5 explantes por frasco, sellándolo de nuevo con el papel
aluminio y el cristaFlex. Luego se llevan al cuarto de incubación para su
observación y desarrollo.
3. MODELO DE MICROPROPAGACION POR SEGMENTOS NODALES.
CIAT
4. PREGUNTAS:
1. ¿En relación a la práctica anterior es mayor o menor el porcentaje de

contaminación? Anote los agentes contaminantes (%), más comunes
que se presentan en la multiplicación de estos cultivos “in vitro”.
2. ¿Cuál sería la causa y como se podría prevenir la presencia de estos

contaminantes al multiplicar material de in vitro a in vitro?
3. Que otros factores habría que tener en cuenta para disminuir o eliminar la
contaminación de los cultivos “in vitro”.
4. ¿Qué factores (internos- externos, fisicoquímicos) manipularías para

inducir yemas múltiples a partir de explantes individuales?

5. ¿Para producir múltiples brotes o yemas múltiples, incorporarías al medio

de cultivo, preferentemente, reguladores de crecimiento tipo auxinas o
citoquininas? Explique.
6. Realice un seguimiento (por 6 semanas) de la longitud del tallo, número

de ápices, # de nudos, N° de hojas verdes, N° hojas muertas, longitud de
raíces (radial), color del medio (o código, diseñando su propia escala).
Así, con los datos obtenidos realice los análisis estadísticos básicos con
las gráficas correspondientes a sus promedios y/o porcentajes (%).
7. Bibliografía consultada.

ASIGNATURA DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES. 0
“ESTABLECIMIENTO IN VIVO DEL MATERIAL IN VITRO”
1. INTRODUCCIÓN
La aclimatización de plántulas procedentes de ambientes artificiales in vitro, es

uno de los componentes cruciales, dentro del proceso de adaptación de
materiales a nuevos ambientes, y es uno de los requisitos indispensables que
debe cumplir cualquier especie para su acomodo a un sitio definitivo (al
campo). Uno de los obstáculos para aclimatizar especies procedente de
sistemas in vitro es el desconocimiento de técnicas y métodos que se ajusten a
nuestras condiciones de ambiente tropical, lo cual repercute, desde el punto de
vista técnico y económico, en una nula o baja eficiencia en el número de
plantas a producir. Este proceso debe tener la mayor eficiencia en la fase de
invernadero (casa malla) como en la fase de vivero, para poder reducir los
niveles de mortalidad y aumentar el endurecimiento de las plántulas, en forma
tal que no reduzcan su crecimiento y desarrollo, permitiendo llevar plantas
sanas y vigorosas al campo.
2. MATERIALES Y METODOS
Las plantas in vitro deben pre-aclimatarse en el laboratorio antes de

transplantarlas a condiciones in vivo. La pre-aclimatación consiste en exponer
las plántulas in vitro a condiciones de mayor intensidad luminosa (mayor a 60
μmoles m-2s-1) y de temperatura (28 a 38 °C), de dos a tres semanas antes de
su transplante a suelo.
2.1 Transplante de las plántulas. Debe hacerse en la sombra y en un lugar

cerrado con ambiente húmedo, o bajo el sombrío en condiciones higiénicas.
Sacar las plántulas y aislarla con delicadeza, a medida que se sacan de los
recipientes de cultivo, deben enjuagarse con agua limpia, y después se colocan
en un recipiente con agua, y que no esté muy fría o muy caliente. Se eliminan
las hojas necróticas (dañadas) de cada plántula, y las raíces se cortan a 1 o 2
cm del tallo, para evitar dificultades en el transplante. El corte se hace con
tijeras desinfectadas con Vanodine al 5%, u otro desinfectante adecuado. Se
retiran las plántulas del agua y se colocan en una solución fungicida de Dithane
M-45 con 0.5 a 1.0 g/l. o Benlate 0.5 a 1.0 g/l durante 5 a 10 minutos, agitando
con suavidad para eliminar cualquier residuo de Agar que haya quedado
impregnado en las raíces.
2.2. Preparación del sustrato. Se puede utilizar una mezcla de sustrato

permeable de tal forma que drene bien; este puede ser de arena, tierra parda

oscura, y cascarilla de arroz. También se puede utilizar tierra parda oscura,

ceniza de cascarilla de arroz y bobinaza en relación 1:1:1 respectivamente, u
otro sustrato recomendado.
2.3 Desinfección del sustrato. La mezcla del sustrato debe desinfectarse con
formol al 5% la cual, conviene taparlo con un plástico durante varios días (5-7)
y después se remueve para la aireación y evaporación del resto del
desinfectante.
2.4. Transplante: Se realiza en bolsas o bandejas, que se llenan con el

sustrato (suelo) y se hace un pequeño hueco de 1 a 2 centímetros de
profundidad donde se coloca las plántulas y se pone sustrato alrededor.
Teniendo cuidado de no enterrar demasiado la plántula para evitar procesos de
pudrición, sino, ponerla hasta el cuello o inicio del tallo (sin cubrir hojas).
También se puede hacer la siembra sobre camas de maderas con suelo y
cubiertas de plástico, en forma masal, tratando de agrupar las plantas por
tamaño.
2.5. Riego, nutrición y manejo de la temperatura, humedad relativa y luz

solar. El riego debe ser frecuente preferiblemente nebulizado, pero poco
abundante de manera que se mantenga permanentemente una película de
agua sobre las hojas, y el sustrato húmedo, pero no inundado, para que haya
una correcta emisión de raíces.
Se deja filtrar un 30 % de luz dentro de la casamalla o invernadero núcleo

(Estructura con Riego programado). La humedad del ambiente a nivel de las
plántulas se debe mantener así: El 90% en la primera semana, 80% la segunda
y el 70% a la tercera y cuarta semana. La temperatura se debe mantener de
25° C hasta 32° C.
Pasados los primeros 15 días, se debe reducir la frecuencia de los riegos, es

decir, de cada media hora al inicio, pasa a 1 hora por espacio de 5 segundos.
El drenaje del suelo debe ser muy bueno para evitar las acumulaciones de
agua. Si las hojas se ablandan, se amarillean y después se negrean en el
borde para finalmente necrosarse, es signo de un mal control de la humedad
del ambiente o excesiva humedad en el suelo. Esto debe corregirse
inmediatamente.
La nutrición se debe efectuar dos veces por semana con bomba de espalda
con una solución de Wuxal o Nutrifoliar completo (2 cc/L), más aceite
adherente agrícola. Debe aplicarse en el último riego de la tarde durante la
primera semana.
Si se utiliza una buena mezcla de sustrato, las plantas se pueden nutrir
complementando con fertilizante foliar (2 veces por semana), esto evitaría
utilizar la mezcla de productos costosos y de difícil consecución.
Otra forma de nutrir las plantas es aplicar fertilizante líquido al sustrato (al
suelo) dos veces semanales de acuerdo a la siguiente fórmula:

En 10 litros agregar los siguientes componentes:
Nitrato de calcio 132 gr.

Agrimins 5 gr
Kelatex 9 gr
Nitrato de amonio 92 cc
Acido fosfórico 20 cc
Nitrato de potasio 136 gr.
Agitar hasta disolución completa. Los componentes pueden ser de grado

agrícola; esta solución puede almacenarse a temperatura ambiente sin ningún
problema; al momento de la fertilización, diluir la cantidad necesaria de la
solución en proporción 1:10 con agua corriente. Las plántulas permanecen 45
días y pasan a la fase de vivero. Esto puede ser complementado con una
fertilización foliar.
2.6 Manejo de enfermedades e insectos
Programar una aplicación semanal de fungicidas (Dithane o Benlate 1.0 gr/L)

durante las dos primeras semanas y un tratamiento de insecticidas, sólo en
caso de que sea requerido para controlar hormigas, áfidos y trozadores como
grillos y aplicación de sal para el caso de ataques de babosas. Las plantas
duran en esta fase de 5 a 8 semanas y tienen de 4 a 6 hojas.
3. PREGUNTAS PARA LA DISCUSION.
1. Cual es una de las principales razones por las cuales el establecimiento

in vivo sea tan importante?
2. Diga cual seria para Ud. el sustrato más adecuado y condiciones

ambientales (% HR, Luz y T°C) que garanticen la supervivencia de las
plántulas?
3. Proponga un protocolo o modelo de aclimatación de plántulas desde su

estadía in vitro hasta su establecimiento in vivo.
4. Explique como aceleraría el proceso de multiplicación de las plántulas in

vivo. Tenga en cuenta las diferentes técnicas de propagación vegetativa.
5. ¿Cuál sería la estructura de su planta ideal para llevar de in vitro a

campo? Descríbala de acuerdo a su percepción del tipo de planta que
sembrarías en campo. Tenga en cuenta características de la raíz, tallo y
hojas. -
6. Evaluar porcentaje (%) de sobrevivencia, cada 8 días, y hasta la cuarta

semana.
7. Referencias consultadas.

“AISLAMIENTO Y EXTRACCIÓN DE MERISTEMOS”
1. INTRODUCCION
El desarrollo de modalidades de crecimiento especializado y de órganos para la

regeneración, es particularmente significativo, y si el explante o tejido se extrae
en el momento adecuado, y se le suministra el medio de cultivo correcto, se
logrará una buena respuesta de acuerdo a los intereses del investigador. En
teoría, todas las células de las plantas son totipotentes, o sea capaces de
producir nuevas regiones de crecimiento, tejidos, órganos, e incluso nuevas
plantas; aunque hasta el momento las puntas del tallo han tenido mayor
importancia para la multiplicación clonal. En los últimos años el desarrollo de
procedimientos para multiplicar y mantener las plantas en cultivos asépticos
recibió un impulso dramático; debido al descubrimiento de la capacidad que
tienen los meristemas, procesados correctamente y sembrados en cultivo
aséptico, para obtener, mantener y multiplicar plántulas. En realidad, en cada
caso se espera a menudo lograr la formación de ramas axilares que puedan
separarse y enraizarse; teóricamente los brotes axilares o laterales pueden a
su vez producir ramas axilares adicionales a perpetuidad, a medida que se
subcultiva cada brote recién formado o cada explante de nudo. Por lo tanto, el
método es bueno para obtener una rápida multiplicación clonal, y se ha
aplicado en una gran variedad de especies, desde las herbáceas hasta las
leñosas.
También, la extracción de meristemos se aplica eficientemente en los procesos
de erradicación de patógenos sistémicos, garantizando la producción de
semillas sanas.
2.1 Las plantas madres.
2.1.2 Esterilización de la semilla. Inicialmente, lávela con un detergente

comercial por 20 minutos, luego enjuague dos veces con agua, y después
aplique una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 20 minutos, y se
enjuagan con tres cambios de agua.
2.1.3 Tipo de sustrato. El sustrato a emplear debe estar compuesto por 2

partes de materia orgánica (aserrín y estiércol de ganado), 1 parte de arena y 1
parte de suelo arcilloso pardo oscuro.

2.1.4 Esterilización del sustrato. La mezcla se empaca en bolsas de papel

periódico de 1Kg y se esteriliza en autoclave a una temperatura de 259 ºF
____°C, 20 libras de presión durante 25 minutos.
2.1.5 Sembrado y distribución de las plantas madres. Siémbrelas en vasos

desechables de 16 onzas o en bolsas de propileno de media libra. Para tener
un mayor control de cada una de las plantas madres distribúyalas en lotes de
varias plantas, cada lote dentro de la casa malla.
2.2 El explante.
2.2.1. Tipo de explante. Pasados unos 15 días después de sembradas las

plantas madres, ser regadas diariamente con agua y fertilizadas cada 15 días
con una solución al 50% de sales MS; se obtendrá uno o dos yemas apicales
por planta los cuales se cosechan y toman como explantes.
2.2.2 Corte y preparación de las yemas apicales. Cada brote se corta

dejando como mínimo 1 yema axilar en la planta para que vuelva a rebrotar, al
brote se le cortan las hojas y se toma la yema apical, déjelos con un tamaño
aproximado de 2 cm, luego deposítelos en un erlenmeyer con agua.
2.2.3 Lavado de las yemas apicales. Agite las yemas en el erlenmeyer

suavemente y cambie el agua dos veces, luego lávelos con un detergente
comercial dos veces por 5 minutos cada vez y enjuáguelos tres veces con
agua, retire el agua con mucho cuidado de no dejar salir del erlenmeyer ningún
explante. Luego llévelos a la cámara de siembra.
2.3 El medio de cultivo. Se utiliza el procedimiento para preparar el medio

basal (fuente de carbono + nutrimentos minerales + vitaminas) descrito por
Murashige y Skoog (1962), el cual es considerado de carácter universal, y
suplementado con reguladores de crecimiento adecuados para el cultivo de
meristemos.
2.4 Material utilizado en la siembra. Todo el material que se utilizara en la

siembra esterilícelo en la autoclave a una temperatura de 259 ºF_____°C, 20
libras de presión durante 25 minutos como son: las pinzas, los mangos de
bisturí, el papel aluminio, el papel absorbente, el algodón, los frascos auxiliares,
el agua destilada, las batas, los gorros, tapabocas. Las soluciones que se
utilizaran, prepárelas con antelación y etiquételas bien para no ser confundidas
al momento de ser utilizadas, como son la solución de hipoclorito de sodio,
peróxido de hidrógeno y el alcohol.
2.5 Preparación de la cámara de siembra. Inicialmente, limpie todo el interior

de la cámara de flujo laminar con un algodón humedecido de alcohol al 70%.
Ingrese todo el material necesario para la siembra de forma organizada, los
frascos con MC se limpian exteriormente con alcohol al 70% para minimizar el
ingreso de contaminantes al cubículo de trabajo, el estereoscopio es
desinfectado externamente con alcohol al 70% con mucho cuidado; e ingrese el
resto del material de apoyo exceptuando las soluciones de hipoclorito, peroxido

y alcohol. Encienda la luz ultravioleta por 30 minutos antes de iniciar la sesión

de trabajo.
2.6 Desinfección de las yemas apicales. Después de ingresar los explantes

a la cabina de trabajo adicione la solución de alcohol al 70% por 30 segundos,
agite suavemente, enjuague con agua destilada estéril, proceda a adicionarle el
peróxido de hidrógeno al 2% por 1 minuto, agítelo de manera constante y
suave durante todo el proceso, luego retírelo, y enjuáguelo con agua destilada,
y por último adicione la solución de hipoclorito de sodio con surfactante, a la
concentración y tiempo establecido para proceder a darle cuatro enjuagues con
agua destilada estéril, dejándolos en agua destilada estéril.
2.7 Procesamiento de las yemas apicales. Luego de la desinfección de los

tejidos o yemas, los sitios de corte de los explantes se lesionan y queman, por
lo que es necesario eliminarlos con un corte en movimiento de serrucho con el
bisturí. Luego, tómelos con las pinzas y lo colóquelos sobre el papel
absorbente estéril y bajo el estereoscopio colóquelo en posición vertical y con
las microcuchillas rasgue la base de las hojas o primordios y luego proceda a
retirarlos empujándolos con la microaguja, en la parte superior hacia afuera;
igual con las brácteas. Al dificultarse la operación con las microcuchillas utilice
las microagujas y rasgue la base de los primordios y retírelos hasta llegar al
domo del meristemo. Para cortar el meristemo, realice a sus lados un corte en
V, y retírelo con mucho cuidado en la punta de la mini cuchilla. Esta listo para
sembrarse.
2.8. Implantación del meristemo en el medio de cultivo. Al abrir el frasco

debe colocar la boca hacia el interior, o sea, hacia el flujo de aire, luego tome
con mucho cuidado el meristemo y lo siembra en el MC teniendo especial
cuidado de no introducirlo demasiado ni dejarlo muy superficialmente que se
pueda salir del MC y correr para los lados al transportarse. Al terminar esta
operación, selle el frasco con 2 o 3 vueltas con el cristaflex para que el papel
aluminio se fije bien a la boca del frasco y no se levante.
2.9 Incubación de los meristemos. Se realiza en el cuarto especialmente

adaptado y con condiciones controladas, se incuban bajo condiciones de
laboratorio. Deben incubarse en oscuridad los primeros días, cubriéndoles con
cinco capas de tul, o servilletas, o de tela blanca, que se retiraran una cada día
a partir de la siembra, hasta dejarlos expuestos a la luz directa el quinto día.
Luego, se mantienen a una temperatura de 28ºC, un fotoperiodo de 12 horas
día/noche, con una intensidad lumínica gradual, que va desde 0 hasta los
45 µmolm-2s-1 (en promedio).
Observaciones:
En este curso introductorio de cultivo de tejidos, y para el desarrollo especifico
de la presente practica (sección 2.7) , dos de sus principales objetivos son:
primero, la preparación de herramientas de bajo costo; y segundo: la extracción
de los meristemos. Para la fabricación de las herramientas, los estudiantes
proveerán las cuchillas de afeitar (Ex: Dorco), para las minicuchillas, las agujas
o puntas de jeringa (N° 21 o 25), manguitos de madera (tipo brocheta), para
enchazar las minicuchillas y agujas, y gota mágica para pegar y fijar las

minicuchillas y agujas a los manguitos de madera. Para lo primero y lo

segundo, el profesor y/o los técnicos de laboratorio darán las respectivas
instrucciones para su ejecución con seguridad.-
MODELO DE EXTRACCIÓN DE MERISTEMOS
CIAT
3. PREGUNTAS:
1. Cual es la importancia del cultivo de meristemos.
2. Que factores hay que tener en cuenta para optimizar el cultivo y desarrollo de los
meristemos.
3. Como afecta el medio de cultivo al desarrollo de los explantes.
4. Cuales son los reguladores de crecimiento más utilizados en el cultivo de meristemos
5. Investigue y describa otros métodos y/o tejidos utilizados para sanear material vegetal
contaminado con patógenos sistémicos. ¿Diga cual le gusta más y por qué?
6. Describa el proceso de colecta, aislamiento e identificación del meristemo de la planta

utilizada en la práctica.
7. Referencias.
Nota: Presentar fotografías estereoscópicas de meristemos con sus respectivos aumentos

(ocular x objetivo) o respectivas escalas relativas al tamaño natural o real. -

“INDUCCIÓN Y MANTENIMIENTO DE CALLOS”
1. INTRODUCCION.
Desde que en 1902 Haberlandt propuso la teoría de que todas las células vegetales
tienen capacidad para formar plantas nuevas y completas, se dice que las células
tienen totípotencialidad. Esta capacidad de regeneración de plantas directamente de
los explantes o a partir de callos, por medio de la organogénesis o embriogénesis
somática, se ha utilizado como una alternativa en los métodos de propagación; sin
embargo, su aplicación en algunos casos, se ha visto limitada a causa de la poca
estabilidad genética en las plantas obtenidas a partir de los cultivos de callo.
Hay, en cambio la necesidad de regenerar plantas a partir de células selectas, como

también necesidad de establecer métodos genéticos celulares aplicables en el
mejoramiento de las plantas y en la recuperación de variantes somaclónales: en
consecuencia, existe un considerable interés en definir las vías de regeneración para
la aplicación de la ingeniería genética a plantas de importancia económica.
La iniciación de los callos se puede presentar en el explante cuando se ubica en un

medio apropiado, colocándolo usualmente en forma horizontal, al seccionarlo, puede
inducirse una mejor formación de callo debido al mayor y mejor contacto con el medio
de cultivo. Hay que tener en cuenta que la inclusión de auxinas y citoquininas en el
medio de cultivo son necesarias para la formación y proliferación de callo, en algunos
casos solo es necesaria la inclusión de altas concentraciones de auxinas para la
iniciación del callo.
2.1 Esterilice superficialmente los tejidos, como los pecíolos, de aproximadamente 1

cm de largo, ó los ápices radiculares, o discos de tejidos de 0,5 cm de diámetro.
También, conforme disponibilidad puede utilizar otros tipos de material vegetal
como cotiledones de fríjol soya, hipocotilo, tejido embrionario, medula de
zanahoria o repollo. Para la desinfección superficial de los materiales no
provenientes de in vitro. se realiza un lavado previo con detergente, y cuando sea
conveniente con fungicida o antibióticos. Con el material lavado y preparado, se
procede, en cámara de flujo laminar, a sumergir los tejidos totalmente en una
solución de etanol al 70% por 30 segundos, luego enjuagar con agua destilada
estéril; luego sumergir los tejidos en Peróxido de Hidrogeno al 5% por 3-5 min,
luego enjuagar con agua destilada estéril; luego sumergir los tejidos en NaOCl al
5% por 5 min, el cual debe contener 1-2 gotas de Tween 20 por cada 100 ml de
solución; enjuagar 3-4 veces con agua destilada estéril y proceder al corte y
siembra de los tejidos en sus respectivos tratamientos.
2.2 Preparar mechero, medios, y demás materiales para el trabajo en cámara.

2.3 Utilizando pinzas y bisturí, previamente estériles, remueva las partes lesionadas
de los tejidos.
2.4 Cultive los explantes en un medio sólido de Murashige- Skoog suplementado con
0.5-0.7% de agar – agar, auxinas como AIA, 2,4-D y/o Picloram, y 3% de
sacarosa (Laboratorio N°3). Cuando disponible, utilizar otras auxinas en medios
de cultivo previamente preparados a diferentes concentraciones o conforme
instrucciones del laboratorio.
2.5 Incube los cultivos a 28 oC, y en oscuridad permanente durante 8 a 10 semanas.
3. PREGUNTAS.
1. Porqué los explantes que contienen células de cambium son excelentes

selecciones para la iniciación de cultivos de callos?
2. Describa dos de las metodologías más adecuadas para medir el crecimiento de

callos.
3. Explique tres razones que justifican la necesidad de subcultivo del tejido inicial
para la inducción de callo?
4. ¿A cuántas partes por millón equivalen las concentraciones de los reguladores

utilizados en el medio para callo, y cual es su equivalencia en moles para cada
una de ellas? Indique los cálculos.
5. Diga cuáles son las posibles etapas en el desarrollo del callo y su posible
significado. Si no todos los tejidos iniciaron callo, explique por qué.
6. ¿Fue la contaminación un problema? Explique y recomiende un posible control.
7. Describa tres aplicaciones prácticas del cultivo de callos para la agricultura y/o
la industria.
8. Evaluar los cultivos de callo cada 15 días, durante 8 semanas. Reporte el

porcentaje (%) de callo en cada tipo de tejido y concentración especifica de
regulador de crecimiento.
Nota: Consolidar datos con estadísticas básicas para las variables a evaluar como
presencia de callo, contaminantes, presencia de raíces, color del medio; para cada
uno de los diferentes tratamientos y tejidos utilizados.

“AISLAMIENTO DE PROTOPLASTOS”
1. INTRODUCCIÓN
Se dice que los protoplastos aislados son células desnudas porque ya no poseen la pared
celular que ha sido removida por un proceso mecánico o enzimático. El protoplasto es
así una forma inusual donde solo la membrana plasmática separa el ambiente externo
del protoplasma celular. A pesar de algunas dificultades técnicas, como la regeneración
de plantas, que han retardado su potencial en algunas investigaciones, los protoplastos
son actualmente utilizados en varias áreas de estudio:
a. En fusión de protoplastos de diferentes especies para producir una nueva planta

hibrida, este uso se hace cuando hay incompatibilidad sexual o física, para que
se produzcan híbridos por polinización o cruzamiento convencional.
b. En transferencia de genes. Una célula desnuda o protoplasto presenta una mayor
posibilidad de admitir material extraño o ADN en su citoplasma por procesos
similares a la endocitosis como ocurre en algunas células animales y
protozoarios, como también por otras técnicas de transformación como
electroporación o microinyección.
c. Pared celular. También es un sistema muy interesante para estudiar los sistemas
de biosíntesis y regeneración de la pared celular.
d. Manejo unicelular. Las poblaciones de los protoplastos también pueden ser
estudiados como un sistema celular simple que permite manipulaciones
similares a la de otros microorganismos como los de tipo bacteriano.
e. Relaciones huésped parasito. Los protoplastos igualmente han sido utilizados
para estudiar relaciones del tipo planta-patógeno y en particular estudios para
determinar el proceso de la penetración y replicación de virus.
Se han realizado muchos trabajos en los cuales se utilizan el aislamiento de protoplastos

del tejido correspondiente al mesófilo de empalizada, a partir de hojas de tabaco y
petunia; aunque también es posible aislar protoplastos de muchos géneros de plantas y
tejidos, como de anteras y de otras plantas del tipo C3 y C4, incluyéndose hasta las
plantas de áreas desérticas como los cactus.
2.1 Método I
Extracción de protoplastos por plasmólisis y centrifugación

-Pese 0,05 grs. y 1.0 grs. de hojas jóvenes o de in vitro (ex. frijol, ñame..).
-Retire la cutícula de la hoja (in vivo) y cubra con la solución osmótica
-Deposite los 0.05 gr. de hoja en dos tubos eppendorf, y 1.0 gr. de hoja en dos
cajas Petri o mortero, y adicione en uno de los eppendorf 1ml de la solución de
manitol 0.7 M y en el otro 1 ml de la solución de sacarosa 0.7 M. Igual
operación realice con las dos cajas Petri, pero adicionando 10 ml de cada una
de las soluciones, hasta cubrir completamente el tejido. Deje plasmolizando
por espacio de 30 minutos.
-Transcurrido este tiempo, decante las soluciones, y adicione a cada uno de los
recipientes, el mismo volumen indicado anteriormente de manitol y sacarosa,
pero a una concentración menor, de 0.4 M. Ahora, macere suavemente con el
mini pistilo el tejido en los eppendorf, y con el mazo en el mortero, los tejidos
de las cajas Petri.
-Tome 1 ml de macerado de cada tubo en tubos eppendorf, filtre y centrifugue
a 1500 rpm. durante 5 minutos.
-Tome con la micropipeta muestras del sobrenadante y cerca al pellet, de cada
uno de los tubos, y deposite 100 µl de cada muestra en los extremos del
portaobjetos y cubra suavemente con la laminilla. Ahora observe al
microscopio.
2.2 Método II
Extracción de protoplastos por corte “espina de pescado”.
-Prepare una caja petri con agua destilada estéril (10-20 ml)
-Tome una hoja, con el envés hacia arriba, y/o tejido sano y fresco del material
disponible, hasta cubrir la superficie de la placa Petri. Asegurarse que los tejidos
de la hoja estén sumergidos y/o en buen contacto con el agua.
-Sujetándola por el pecíolo o nervaduras, proceda a realizar, con el bisturí, cortes
“espina de pescado” desde la nervadura central hacia fuera, Espere 30 min.
-Luego, tome 1 ml de muestra del líquido con una pipeta Pasteur o micropipeta,
deposítela en un tubo eppendorf , centrifugue, y luego observar al microscopio.
Nota: a) Simultáneamente, realizar el mismo procedimiento anterior en otras dos

cajas Petri, pero en una caja adicionar de solución de manitol al 0.4 M, y
en la otra sacarosa 0.4 M.
b) Para cada tratamiento cuente el Nº de protoplastos por campo en el
aumento más conveniente.
3. PREGUNTAS
1. Realice un listado de las posibles aplicaciones de aislamiento y uso de

protoplastos en experimentación y/o en el campo de la biología y la
agricultura.
2. Cuáles podrían ser las ventajas de utilizar una técnica mecánica sobre la
digestión enzimática en el proceso de aislamiento de protoplastos.

3. ¿Qué otros reguladores osmóticos además del manitol y la sacarosa, se pueden

utilizar para el proceso de aislamiento de protoplastos?
4. Dibuje o fotografíe lo observado con su correspondiente medida o escala de

referencia para tamaño. Reporte el número de protoplastos por campo
(100X, 400X), para cada uno de los métodos aplicados.
5. Describa una metodología para cuantificar el número de protoplastos aislados.
6. Explique cómo se hace y para qué sirve la fusión de protoplastos.
7. Anote los cálculos necesarios para preparar los azucares (manitol y sacarosa) de
la práctica a 0.4 M y 0.7 M.
8. Reporte bibliografía consultada y plantee sugerencias y/o observaciones sobre

como evaluar la viabilidad de los protoplastos.
9. Referencias

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD: Educación y Ciencias
DEPARTAMENTO: Biología y Química
PROGRAMA: Biología
ASIGNATURA: Cultivo de Tejidos Vegetales.
PRACTICA No. 10
VISITA A LABORATORIO RURAL DE CULTIVO DE TEJIDOS DE BAJO

COSTO.
INTRODUCCIÓN
Se espera que la agricultura alimente a una población humana en aumento,

previéndose que alcanzara los 8 billones de habitantes para el año 2020 (actual
2021: 7.8); de estos, seis mil setecientos (6700) millones pertenecen a la
población de los países en desarrollo. Aunque el ritmo de crecimiento
demográfico está disminuyendo progresivamente, el aumento del número
absoluto de personas que hay que alimentar puede ser tal que podría
alcanzarse pronto la capacidad de carga de las tierras agrícolas con la
tecnología actual. Con una orientación apropiada, las nuevas tecnologías,
como las biotecnologías, ofrecen una manera responsable de aumentar la
productividad agropecuaria ahora y en el futuro.
Se considera que el cultivo de tejidos es una tecnología importante para los

países desarrollados y en desarrollo, con vistas a la producción de material
vegetal de alta calidad libre de enfermedades. El cultivo de tejidos comprende
la micropropagación, el aislamiento y el cultivo de embriones, la regeneración a
partir de callo y de suspensiones celulares y el cultivo de protoplastos, anteras
y microsporas. Estas técnicas se están utilizando en particular para la
multiplicación de plantas en gran escala. La micropropagación ha resultado
especialmente útil en la producción de material de plantación, de gran calidad y
libre de enfermedades, de una amplia variedad de cultivos.
La investigación biotecnológica requiere personal capacitado, con el respaldo

de laboratorios bien equipados y unas condiciones de trabajo apropiadas, un
abastecimiento constante de agua de buena calidad, un suministro fiable de
electricidad y un apoyo institucional organizado, con la entrega a tiempo de
reactivos y el acceso a internet y otras redes internacionales del conocimiento.
Se requiere una base tecnológica mínima incluso para adaptar la tecnología

ensayada y comprobada en otras partes a las condiciones ecológicas y de
producción locales para cumplir integralmente con el desarrollo rural y calidad
de vida de los productores.
OBJETIVO GENERAL
-Reconocer y evaluar la estructura general del laboratorio.

-Analizar con la comunidad, o los encargados del laboratorio, su

funcionamiento, costo e impacto en la producción de campo.
-Discutir limitaciones y soluciones.
COMPETENCIAS
-Incorporar capacidades para integrar formación académica en el aula y

laboratorio con actividades complementarias en campo.
-Reconocer necesidades del entorno para incorporarlas al ejercicio académico,
investigativo, de proyección social y extensión.
-Desarrollar compromisos de formación para orientar el ejercicio investigativo y
profesional a la solución de problemáticas de forma contextualizada.
MATERIALES Y MÉTODOS
La visita se realizará al laboratorio de bajo costo, para la producción de

semillas por micropropagación, que se encuentra establecido en la
empresa comunitaria denominada “Asociación Municipal para el
Desarrollo Sostenible de los Pequeños Agricultores de San Jacinto
Bolívar” (ASOMUDEPAS).
Se utiliza la metodología del conversatorio para interactuar con la comunidad, y
analizar su desarrollo y prospectivas para el futuro; para luego hacer el
recorrido por el laboratorio y los cultivos presentes en la comunidad. El
informe de la práctica de campo podrá incluir copias de documentos,
registros y/o fotografías ilustrativas de la misma.
Los estudiantes deben llevar vestimenta adecuada para el lugar para
protegerse del sol, botas pantaneras, gorras, sombreros o sombrillas,
protector solar, repelente para insectos, agua para hidratarse, y cámara
fotográfica para ilustrar actividades.
Los estudiantes reportaran respuestas al cuestionario, y una relatoría del
evento indicando el lugar, nombres de los participantes y actividades
desarrolladas.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuáles son las técnicas in vitro utilizadas y en que cultivos?

2. ¿Por qué este laboratorio rural es considerado de bajo costo?
3. Realice una comparación de la distribución de los espacios o áreas, los
equipos, y los materiales de dotación del laboratorio rural con los que se
encuentran en los laboratorios de cultivo de tejidos de la Universidad de
Sucre. (Revisar presentaciones de los laboratorios anteriores)
4. ¿Cuál es la forma adecuada de eliminación de los residuos que genera
el laboratorio de bajo costo?
5. ¿Cómo se podrían mejorar las condiciones de funcionamiento del
laboratorio rural?
6. ¿Cuál es el impacto en la producción de campo de los cultivos in vitro?
7. ¿Cómo es el proceso de aclimatación y cuál es su porcentaje de
sobrevivencia?
8. ¿Proyecciones actuales y futuras del laboratorio?

9. ¿Qué fuente de agua utilizan para preparar los medios y como los
esterilizan?
10. ¿Qué medios de cultivo utilizan, con que reguladores de crecimiento, y si
incorporan antibióticos o fungicidas al medio?
11. ¿Como es el proceso de aclimatación de las plántulas de in vitro a
campo, y cuánto dura?
LITERATURA CITADA
-Escobar R. Caicedo E, Muñoz L., Ríos A., Azcárate A., Dorado C., y Tohme J.
2013. El cultivo in vitro: Otra manera de propagar la yuca. CIAT. Palmira-V.
Colombia.
-http://siteresources.worldbank.org/KFDLP/Resources/461197-
1199907090464/4554803-1210107115154/Uganda.pdf. “Transfer of Banana
tissue culture technology to small-scale farmers”, Agro-genetic Technologies
Ltd. (AGT). 2002.
- IAEA, 2004. LOW-COST OPTIONS FOR TISSUE CULTURE TECHNOLOGY

IN DEVELOPING COUNTRIES. IAEA, VIENNA, AUSTRIA. ISBN 92–0–
115903–X, ISSN 1011–4289.February.
- M.M. Njuguna1, F.M. Wambugu1, S.S. Acharya2 and M.A. Mackey3.

2010.Socio-Economic Impact of Tissue Culture Banana (Musa spp.) in Kenya
through the Whole Value Chain Approach. Acta Hort. 879.
-N.M. GITONGA, O. OMBORI, K.S.D. MURITHI and M. NGUGI , 2010. LOW

TECHNOLOGY TISSUE CULTURE MATERIALS FOR INITIATION AND
MULTIPLICATION OF BANANA PLANTS, African Crop Science Journal, Vol.
18, No. 4, pp. 243 – 251

BIBLIOGRAFÍA GENERAL
1. BHOJWANI S.S., RAZDAN M.K. 1996. Plant tissue culture: theory and
practice. A revised Edition. Elsevier Science, Amsterdam.
2. BORDAS M. B: Moreno V. F. 1994. Ingeniería Genética de Plantas.
Universidad Politécnica de Valencia. 148 p.
3. BU'LOCK J.D., KRITIANSEN B. (Eds.). 1991. Biotecnología Básica, Acribia,
Zaragoza (trad. de: Basic Biotechnology, Academic., London, 1987).
4. CASTILLO R. El cultivo de callos y suspensiones celulares en el cultivo
plantas. En curso sobre técnicas avanzadas de la Biología vegetal. Memorias
Medellín, 1996. 320p.
5. DASHEK W.W. (1997): Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology.
Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York.
6. DICOSMO F., MISAWA M. 1996. Plant Cell Culture. Secondary Metabolism
Toward Industrial Application, Springer, Berlin-Heidelberg-New York.
7. Dixon R. A; González R.A. 1994. Plant Cell Culture. A practical Approach.
Second Edition. Oxford University Press. 230 p.
8. DODDS, J. H. and ROBERTS L. W. 1995. Experiment in plant tissue culture.
Third Edition.
9. EDWARS S., COLLIN. H.A. 1997. Plant Cell Culture, Springer, Berlin-
Heidelberg-New York.
10. Edwin F. G; 1993. Plan propagation by Tissue Culture. Exegetics limited.
England. 574 p.
11. ENDRESS R. 1994. Plant Cell Biotechnology, Springer, Berlin-Heidelberg-New
York.
12. GAMBORG O.L., PHILLIPS G.C. (eds.) (1995). «Plant cell, tissue and organ
culture. Fundamental methods». Springer, Berlin.
13. GEORGE E. F. Plant propagation by tissue culture. Part 1: The technology.
Edington wilts: Exegetics limited. 2 ed., 1993. 574p
14. GROUNT B. (Ed.). 1995. Genetic Preservation of Plant Cells in vitro. Springer,
Berlin-Heidelberg-New York.
15. HARTMANN H. T Y KESTER D. E. Propagación de plantas, principios y
técnicas. México: Compañía Editorial Continental. 1987. 760 p.
16. HARTMANN H.T., KESTER D.E., DAVIES F.T. 1990. Plant propagation:
principles and practices. Prentice Hall, Englewood Cliffs, New Jersey.
17. HIATT A. 1992. Transgenic Plants. Fundamentals and Applications. Marcel
Dekker Inc., Nueva York.
18. HUGHES K.W. Ornamental species. En: Conger, B.V. (Ed). Cloning
agricultural plants via in vitro techniques. CRC. Press. Boca Ratón, Florida,
E.U. 1981
19. IZQUIERDO M.R.1993. Ingeniería Genética. Ediciones Pirámide. 221 p.
20. LINDSEY K. Y JONES M. G. K Biotecnología vegetal Agrícola: Acerbia
Zaragoza España, 1992. 276 p.
21. LÓPEZ C. Fundamentos Teóricos - Prácticos del Cultivo de Tejidos. La
Habana: Acerbia, 1993. 419 p.
22. MANTELL S., MATTHEWS J.A., MCKEE R.A. 1985. Principles of Plant
Biotechnology. An Introduction to Genetic Engineering in Plants. Blackwell,
Oxford.

23. MARGARA J. 1988. Multiplicación vegetativa y cultivo in vitro. Ed. Mundi-

Prensa, Madrid.
24. Martínez-Ruiz Rosa, Hilda S. Azpíroz-Rivero, José Luis Rodríguez-De La O,
Víctor M. Cetina-Alcalá, y M. A. Gutiérrez-Espinosa. 2005. ACLIMATACIÓN
DE PLANTAS OBTENIDAS in vitro de Eucalyptus urophylla S.T. BLAKE y
Eucalyptus grandis HILL EX MAIDEN. Ra Ximhai. Vol. 1. N° 3:591-597.
25. NEUMANN K.H. 2010. Plant Cell and Tissue Culture a Tool in Biotechnology:
Basics and Application (Principles and Practice). Springer.
26. PBA-CORPOICA, 2002. Programa de Biotecnología Agrícola, Curso taller
"Cultivo de tejidos Empleando la Técnica de Multiplicación Clonal In Vitro para
la obtención de plantas sanas de ñame, yuca y plátano", abril 8 al 12.
27. Pierik R. L. M. 1990. Cultivo IN VITRO de las plantas superiores. Ediciones
Mundi-Prensa. 326 p.
28. PIERIK R.L.M. (1990). Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones
Mundi-Prensa, Madrid.
29. POTRYKUS I., SPANGENBERG G. 1995. Gene Transfer to Plants. Springer,
Berlin-Heidelberg-New York.
30. ROCAW. Y MROGINSKI 1991.Cultivo de tejidos en la agricultura.
Fundamentos y Aplicaciones. Cali: CIAT.969 p.
31. RODRÍGUEZ C., PÉREZ J. Y FUCKS A. Mejora de plantas... La Habana: Félix
Varela, 1995. 456 p.
32. Rosell C. H.; Villalobos A.V. Fundamentos teórico – prácticos del cultivo de
tejidos vegetales. Estudio FAO. 1990. 112 p.
33. SERRANO M., PIÑOL M.T. 1991. Biotecnología Vegetal. Ciencias de la Vida
Vol. 11. Editorial Síntesis, Madrid.
34. SMITH R. H. 2000. Plant issue culture. Tecniques and experiments, Second
Edition
35. STAFFORD A., WARREN G. (Eds.). 1991. Plant Cell Tissue Culture. Open
University, Balmoor.
36. TINGIANO R.N., GRAY D.J. 1996. Plant Tissue Concepts and Laboratory
Exercises. Springer, Berlin-Heidelberg-New York.
37. VERMA D.P. 1993. Control of Plant Gene Expression. CRC Press, Inc.
38. WU W., WELSH M.J., KAUFMAN P.B., ZHANG H. 1998. Methods in Gene
Biotechnology, Springer, Berlin-Heidelberg-New York.
39. Otras fuentes de información científica de cultivo de tejidos vegetales y sus
aplicaciones (journals o revistas especializadas):
- American Journal of Botany
- Annals of Applied Biology
- Biotechnology
- Cariologia
- Euphytica
- Heredity
- HortScience
- In Vitro
- In Vitro Cellular & Developmental Biology
- Plant Breeding
- Plant Cell, Tissue and Organ Culture
- Plant Growth Regulation
- Plant Physiology
- Physiological and Molecular Plant Pathology

- Plant Pathology
- Scientia Agricola
- Weed Research
- Zeitschrift fuer Pflanzenzuechtung
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Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales Universidad de Sucre

LABORATORIO CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES Nº 1:

“INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS”

El cultivo de tejidos vegetales abarca un grupo de técnicas que consiste en el

2. AREAS QUE COMPRENDEN UN LABORATORIO DE CULTIVO DE

4. Área de preparación de medios.

5. Área Cuarto oscuro.

8. Área de procesamiento de datos.

10. Área de Diagnostico.

11. Área de Conservación

Javier D. Beltrán H...

- Es indispensable el uso de bata blanca, polainas, gorros, mascarillas, y

- No consuma ninguna clase de comidas ni bebidas dentro del laboratorio.

- No escriba sobre los mesones ni los raye.

- No pipetear ningún reactivo o solución con la boca, utilice las pipetas

- No colocar bolsos ni libros en las mesas de trabajo.

- Usted es responsable de los equipos y materiales que se le entreguen,

- Si ocurre cualquier tipo de accidente comuníqueselo inmediatamente al

- Todo material debe estar rotulado, así evitara perdidas o confusiones.

- No ingresar, ni sacar ningún tipo de material al laboratorio sin previa

- Cualquier irregularidad comuníquela inmediatamente al profesor o al

Javier D. Beltrán H...

- Seguir estrictamente las instrucciones contenidas en las guías de

1. Cual es la función da cada una de las áreas que comprenden el laboratorio?

2. Cuáles son los equipos de un laboratorio de cultivo de tejidos, cual es su

3. Diseñe con planos (incluya la escala) su laboratorio ideal para cultivo de

4. Porque es importante registrar la marca del reactivo utilizado y su código de

5. ¿Cuál es la importancia del Manual de Bioseguridad de un laboratorio?

7. Hacer cualquier otra observación o recomendación que usted crea

Javier D. Beltrán H...

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS N.º 2:

“PREPARACIÓN DE SOLUCIONES MADRES Y STOCK’S”

II. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES “STOCK”

Es necesario utilizar agua destilada, bidestilada o desmineralizada destilada, la

Nota: para diluir el H3BO3 se debe calentar el agua. ¿Por qué?

III. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES MADRES.

Es necesario utilizar agua destilada, bidestilada o desmineralizada destilada, la

Javier D. Beltrán H...

1. Cuál es la concentración en mg/L de cada una de las soluciones stock

2. Calcule la concentración molar final de cada compuesto de la solución

3. Porque es conveniente preparar stocks y/o soluciones madres de los

4. ¿Cuál es la mejor forma de almacenar y conservar las soluciones?

5. ¿Cuales son las principales fuentes de contaminación de las soluciones?

6. ¿Que son reacciones endo- y exo- térmicas? ¿Cuáles de los

7. ¿Porque se deben almacenar algunas substancias en frascos ámbar?

8. ¿Cuál podría ser la importancia de detectar la temperatura, el color y el

9. Anote cualquier otra sugerencia que UD. crea conveniente tener en

Nota: Incluir en el informe imágenes, cálculos y/o descripciones de las

Javier D. Beltrán H...

LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS Nº 3:

“COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO Y PREPARACIÓN”

En general los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes

1. Macronutrientes. Son compuestos inorgánicos requeridos en cantidades

2. Micronutrientes. Pequeñas cantidades de ciertos minerales son también

Algunas plantas requieren micronutrientes, así mismos tejidos tomados de

3. Suplementos de hierro. Se prepara independientemente por el problema de

Javier D. Beltrán H...

4. Vitaminas. Se requieren en pequeñas cantidades y tienen funciones

5. Fuentes de carbón. El azúcar (sacarosa o D-glucosa), en general se usa en

6. El myo-inositol, un carbohidrato, es añadido como un factor de crecimiento

7. Reguladores de crecimiento. Se requieren combinaciones de auxinas y/o

Otros componentes son aminoácidos, fuentes de nitrógeno, suplementos

8. PREPARACIÓN DEL MEDIO BASAL (MB)