Conjugación bacteriana, Acevedo et, al octubre 29 del 2021

CONJUGACIÓN BACTERIANA
Brieva A 1, Velásquez W1, Basilio W1 & Herrera L1

Universidad de Sucre, Facultad de Educación y Ciencias, Programa Biología, Línea de

Profundización en Biotecnología, Ingeniería Genética, Sincelejo (Sucre)
RESUMEN
La investigación realizada se llevó a cabo en las instalaciones de la universidad de sucre
en el laboratorio de cultivo de tejidos. En primer lugar, cabe resaltar que; es de suma
importancia reconocer que la resistencia a antibióticos, es la capacidad o habilidad de
una bacteria de transmitir su información genética a otras células por medio del
mecanismo de transferencia horizontal el cual se conoce como conjugación o
conjugación bacteriana (CB). La transferencia de información genética brinda a la
célula receptora el mejoramiento de su funcionalidad y adaptación al nuevo medio al
que habitable. En esta práctica Se utilizaron dos cultivos de E. coli resistentes a
distintos antibióticos, fueron implementados diferentes tratamientos con y sin
estreptomicina y ampicilina, así como también ambos antibióticos combinados. Fue
evidenciable la presencia de crecimiento en las cepas que son resistentes al antibiótico,
mas sin embargo, en otros casos los resultados no fueron los esperados, Debido a que
posibles alteraciones o mutaciones de los genes que hacen que estas sobrevivan al
antibiótico o también debido a fallas en la manipulación de los microorganismos; en
cuanto a CB se presentó una correcta transferencia de información ya que el crecimiento
en los tratamientos fue el esperado.
Palabras clave: crecimiento, conjugación bacteriana, Escherichia coli, Cepa, Genoma
bacteriano, resistencia, microorganismos.
ABSTRACT
The research carried out was carried out at the facilities of the University of Sucre in the
tissue culture laboratory. First of all, it should be noted that; It is very important to
recognize that resistance to antibiotics is the capacity or ability of a bacterium to
transmit its genetic information to other cells through the horizontal transfer mechanism
which is known as conjugation or bacterial conjugation (BC). The transfer of genetic
information provides the receiving cell with the improvement of its functionality and
adaptation to the new environment to which it is habitable. In this practice, two cultures
of E. coli resistant to different antibiotics were used; different treatments were
implemented with and without streptomycin and ampicillin, as well as both antibiotics
combined. The presence of growth in the strains that are resistant to the antibiotic was
evident, however, in other cases the results were not as expected, due to possible
alterations or mutations of the genes that make them survive the antibiotic or also due to
failures in the handling of microorganisms; Regarding CB, a correct transfer of
information was presented since the growth in the treatments was as expected.
Keywords: growth, bacterial conjugation, Escherichia coli, strain, bacterial genome,
resistance, microorganisms.
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1. INTRODUCCIÓN
Los sistemas dinámicos de caracteres complejos que resaltan gracias a la
interacción que hay en el que las bacterias coexisten, colaboran, compiten e
intercambian información entre sí, hace referencia a los conjuntos bacterianos. Estos
comportamientos se basifican en las propiedades emergentes del sistema. Una de
de las maneras que permiten la interacción de las bacterias son la detección de
quórum o quorum sensing y la respectiva conjugación bacteriana (CB) (Pardilla
2011).
En terminología, La CB fue estudiada por primera vez por Lederberg y Tatum
(1946), de la forma en que contribuyeron a los inicios de la biología molecular
(Lederberg y Tatum, 1946). La conjugación bacteriana en sus comienzos fue
considerada como un tipo de reproducción sexual, haciendo alusión en la
manipulación de la bacteria donante (“macho”) y la bacteria receptora (“hembra”)
en el que sufre modificaciones por la nueva información presentada. Es de suma
importancia señalar que; a diferencia de la CB en el cual no hay transferencia
recíproca del material genético, en su reproducción sexual dos organismos donan
casi la misma cantidad de información genética para la conformación del nuevo
organismo y que en ciertos casos cualquier organismo es alterado ( genetic
analysis.pdf, .f.) .
La conjugación ya mencionada, es uno de los mecanismos de transferencia
horizontal (unidireccional) de genes desde las bacterias emisoras hacia las bacterias
receptoras. De esta forma se dice que la CB se presenta en forma directa (contacto
intercelular) donde intervienen estructuras superficiales con funciones
especializadas llamadas pilus sexuales por medio de los cuales es transferida la
información genética después de hacer contacto con receptores específicos de la
pared celular de la bacteria receptora (Akiba T, 1960).
En casi todos los casos, la CB se encuentra regulada por diversos genes presentes
en el cromosoma bacteriano; mas sin embargo, en algunos momentos hay
plásmidos conjugativos que presenta capacidad para transferirse
independientemente entre las distintas bacterias (Betancor et. s.f.).Basicamente , los
genes transferidos benefician a la bacteria receptora con información de resistencia
antibiótica, nuevas vías metabólicas, adaptación o resistencia a sustancias tóxicas
(xenobióticos) para estos microorganismos (Watanabe , 1963).
OBJETIVOS
° Inducir la conjugación entre dos cepas bacterianas para identificar los elementos
participantes en el proceso de conjugación
° confirmar la transferencia de ADN recombinante en un sistema procariótico
° Hacer el uso adecuado de los elementos a utilizar con las respectivas medidas de
bioseguridad.
.
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2. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS, 2.1 METODOLOGIA

Se utilizaron una serie de materiales tales como tapabocas, marcadores para rotular, guantes
quirúrgicos, goteros, asas bacteriológicas de siembra y cajas de Petri.
Reactivos
Etanol al 70%
°Subcultivo de E. coli con resistencia a estreptomicina (alusión a la cepa l)
°Subcultivo de E. coli con resistencia a ampicilina (alusión a la cepa ll)
°Caja de Petri con medio de cultivo LB
°Caja de Petri con medio de cultivo LB con estreptomicina
°Caja de Petri con medio de cultivo LB con ampicilina
°Caja de Petri con medio de cultivo LB con ampicilina/ estreptomicina
Equipos utilizados
°Incubadora a 37°c
°Micropipetas
°Mechero de alcohol al 96%

2.1METODOLGIA
Como pre experimentación, fueron incubados los subcultivos R-strep (cepa I), R-amp
(cepa II), y la placa de conjugación a 37 °C por 1 hora antes de iniciar el procedimiento.
Transcurrido este tiempo, se agitó el contenido de cada tubo por cada 13-15 minutos.
Posteriormente, se usó una pipeta estéril para mezclar 1 ml de subcultivos de E. coli R-
strep con 1 ml de E. coli R-amp en la placa ya calentada. Luego se agitó el contenido
e inmediatamente se regresó junto con los subcultivos a la incubadora agitando los
cultivos cada 20 minutos por un periodo de 2 horas más o menos.
Mientras se incubaba la mezcla, se dividieron en dos secciones o etapas las placas (con-
sin antibióticos) marcando una sección como (cepa I) y la otra como (cepa II)
respectivamente. Posteriormente se sembraron en estrías con ayuda del asa el subcultivo
(cepa I) en la sección marcada para esta en la placa, luego se sembró la (cepa II) en su
sección correspondiente. Siguiente a esto, se sembró la placa que se había incubado
previamente llenándose las placas para ser se llevadas a incubación a 37 °C (ver fig.
1). Por último, también se realizó la predicción de los posibles resultados que
obtendríamos para finalmente al día siguiente hacerle seguimiento de lo obtenido
verdaderamente.( ver fig 1 del procedimiento metodológico presentado en la guía de
laboratorio)
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Figura 1. Procedimiento mostrado en la metodología de la guía

A: Placas de recombinación
B: Placas de confirmación
C: Placas para confirmar la conjugación

RESULTADOS
Resultados esperados vs observados
Resultados esperados vs
observados
Tratamientos
ESP------OBS

LB agar +,- +,+

LB agar/str +,- +,+

LB agar/ amp -,- ¿+,+?

LB agar/str/amp +,- +,+

Tabla 1: Resultados esperados y obtenidos de los distintos medios en cajas de Petri.

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Figura 2.Observacion del conjugado de las columnas de bacterias. Aquí se logra observar la
homogenización de cada muestra.

A B C D

Figura 3. Crecimiento de las cepas en los distintos tratamientos con-sin antibióticos. A). LB agar. B). LB
agar + str. C). LB agar + amp. D). LB agar + str + amp.Se logra apreciar que las colonias de bacterias se
fusionaron lo que no era lo esperado

TRSTAMIENTOS CEPA I STR CEPA II

AMP
LB agar + +
LB agar/str + +
LB agar/ amp + +
LB agar/ str/amp + +

Tabla 2. Confirmación de los crecimientos en las cepas de los distintos tratamientos.

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4. ANÁLISIS
Las enterobacterias a nivel mundial presentan alta resistencia a ampicilina
(betalactámico), Aminoglucósidos como estreptomicina, entre otros (Mosquito et al.,
2014). El fenotipo de resistencia antibiótica es perceptible gracias a la presencia de uno
o más mecanismos moleculares de resistencia antibiótica en la bacteria, como lo es la
inactivación enzimática, alteraciones en el sitio blanco y alteraciones de la
permeabilidad (Akın et al., 2020).
Por lo tanto, se determina que existe la prevalencia de diferentes genes relacionados a
nivel molecular que le confieren la capacidad de tolerar esos compuestos a través de
mecanismos como expulsión, modificación, entre otros (Jiménez Mejía et al., 2017). El
mecanismo de resistencia de ampicilina en E. Coli está mediado por las Betalactamasas,
estas son enzimas que se caracterizan por hidrolizar el enlace amida del núcleo
betalactámico, inactivando de esta manera el antibiótico. Los genes que participan y
codifican las betalactamasas son blaTEM, blaSHV, blaCARB, blaOXA, blaCTX-M y
blaGES. (Mosquito et al., 2014).
Mientras que los mecanismos de resistencia bacteriana a los aminoglucósidos son
diversos, el mecanismo más común es la inactivación de aminoglucósidos por una
familia de enzimas denominadas enzimas modificadoras de aminoglucósidos
[acetiltransferasas (AAC), nucleotidiltranferasas (ANT) o fosfotransferasas (APH)].
Además, la resistencia bacteriana a la estreptomicina está asociada a mutaciones del
ribosoma diana y, cada vez más comúnmente mediante la modificación del ribosoma
por una familia de enzimas ribosomales metiltransferasas. La pared celular bacteriana
sirve como barrera intrínseca, y la impermeabilidad puede aumentar por modificaciones
lipídicas adquiridas que provocan repulsión de los aminoglucósidos. Incluso si los
aminoglucósidos entran en la célula bacteriana, las concentraciones intercelulares
pueden permanecer bajas debido a la expulsión activa de aminoglucósidos fuera de la
célula mediante bombas de flujo (Garneau-Tsodikova, 2016).
De acuerdo con lo anterior, en este estudio se puede decir que los anteriores genes
actuaron en la cepa II para codificar la beta-lactamasas, puesto que en los distintos
tratamientos (FIG 2, TABLA 2) se observó la respuesta esperada de aumento del
crecimiento debido a resistencia del antibiótico ampicilina, igual en la mortalidad con
estreptomicina indicando que no poseen la resistencia para este. Esto demuestra una alta
prevalencia de genes de resistencia a los antibióticos logrando adaptarse al medio. Caso
particular se presentó en los tratamientos de la cepa I, done se obtuvo un crecimiento
no esperado de bacterias en los tratamientos LB agar/amp y LB agar/str/amp (tabla 2,
FIG 2), indicando que posiblemente estas bacterias son cada vez más adaptables a los
tipos de antibióticos, la única alternativa aparente a esta interpretación sería ser la
ocurrencia en el medio de factores transformantes capaces de inducir la mutación de
genes, sin embargo, puede que también hayan existido errores en el procedimiento de
transformaciones en los cultivos individuales mediante el filtrado de estériles. Otra
alternativa a la resistencia es debida por la presencia de integrones, cuya particularidad
se correlaciona comúnmente con aislados multirresistentes, sugiriendo que los genes
pueden estar asociados a esos elementos. Los integrones son piezas genéticas capaces
de captar genes que codifican determinantes de resistencia antibiótica u otras funciones.
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El grupo I o también llamado “integrones móviles” relacionados con los casetes de

resistencia antibiótica, donde el integrón de clase 1 (Int1) es el más relacionado con
resistencia antibiótica en Gram negativos; y el otro grupo II o “superintegrones”
presentes, a diferencia de los primeros, a nivel cromosómico y no relacionados con la
resistencia antibiótica salvo algunas excepciones (Jiménez Mejía et al., 2017).
En cuanto a los resultados de la conjugación o recombinación (figura 3, tabla 3), se
puede identificar como los valores esperados estaban en acuerdo con los obtenidos, esto
se trata de explicar por los efectos de la estreptomicina, la cual ejerce su efecto
antibiótico uniéndose a una zona concreta del ARNr del ribosoma eubaceriano. Otra
forma de explicar estos resultados seria por la mutación de resistencia a la
estreptomicina, aquí se sabe, que con relativa frecuencia gracias a sucesivas divisiones
surgen en la población bacteriana una mutación espontanea que hace que la bacteria
afectada sea resistente al antibiótico (fenotipo StrR ). Esta mutación afecta al gen str que
codifica una proteína de la subunidad pequeña del ribosoma, asi, el efecto de la
mutación es alterar una proteína de modo que el ribosoma que contenga esa proteína
mutante evite la unión de la estreptomicina con el ARNr.
La conjugación bacteriana tiene lugar cuando el material genético pasa de forma directa
de una bacteria a otra. Un plásmido o parte del cromosoma bacteriano (células Hfr),
pasa de una célula dadora a otra receptora. Después de la conjugación, se produce el
entrecruzamiento entre las secuencias homólogas de ADN transferido y el cromosoma
de la célula receptora. En la conjugación el ADN solo se trasfiere de la célula donante a
la receptora. La célula con el plásmido F integrado se denomina (Hfr) (Pierce, 2014).
En la mayoría de las bacterias, la conjugación depende de un factor de fertilidad (F), que
está presente en la bacteria dadora (F+) y ausente en la receptora (F-). El factor F
contiene genes que codifican para los pilus sexuales, que son prolongaciones de la
membrana celular. Sirven para anclar la bacteria donante a la receptora y como canal de
transferencia del material hereditario. La transferencia se inicia cuando una de las
cadenas del plásmido F, se corta en el sitio de origen de la transferencia (oriT). Un
extremo del ADN fragmentado se separa del círculo y pasa a la bacteria receptora. En la
bacteria donante se produce la replicación en la cadena rota alrededor del plásmido, en
reemplazo de la cadena transferida. Dado que el plásmido de la célula F+ siempre se
abre en oriT, este sitio siempre ingresa primero en la bacteria receptora. Así la
transferencia del material genético siempre tiene una dirección definida. Una vez dentro
de la bacteria receptora la cadena simple se replica y se produce una copia del plásmido
F. Si se transfiere totalmente el plásmido, la célula receptora F- se convierte en F+.
5. CONCLUSIONES
Los mecanismos de resistencia antibiótica en E. coli hacia estreptomicina o ampicilina,
se adquieren mediante mutaciones puntuales a nivel cromosómico o transferencia
horizontal de material genético entre especies relacionadas o diferentes facilitada por
algunos elementos móviles tales como los integrones. Para cada familia de antibióticos
existe más de un mecanismo de resistencia antibiótica.
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Los métodos de transformación para las construcciones genéticas son relativamente un

poco mas simples y estas incluyen tanto los genes de interés como los de selección con
sus respectivas secuencias regulatorias.
6. CUENTIONARIO
➢ ¿En las pruebas de confirmación, cuál cepa crecería en la placa LB+Amp? En
esta prueba, se observó el crecimiento en ambas cepas tanto en la I como en la
II, ya que presentaron ser resistentes a este antibiótico. Cabe mencionar que los
resultados obtenidos no fueron los esperados comúnmente.

➢ En las pruebas de confirmación, ¿Cuál cepa no crecería en la placa LB+Estrep?

En esta prueba, la cepa que no crecería seria la II, debido a que no es resistente a
este antibiótico pero en esta práctica creció lo que no debió suceder

➢ ¿Qué respuesta esperaba usted para la placa de confirmación, conteniendo

estreptomicina y ampicilina? ¿Qué pasó? Explique
En el tratamiento de Str + Amp, esperábamos que no ocurriera crecimiento, lo
que pudimos observar en los resultados que en ambas cepas hubo crecimiento ,
aunque se observó un crecimiento reprimido en la cepa I, lo que se pudo por
adquirir resistencia a este tratamiento o en su defecto pudo ocurrir una
contaminación.

➢ ¿Puede Ud. decir o afirmar que el crecimiento bacteriano en la placa de

recombinación (Fig. 2), consiste solamente de células recombinantes o solo del
crecimiento de ambas cepas (individuales)? Explique.
Consiste de células recombinantes o conjugadas. Este resultado, se observa en
las colonias o puntos individuales que crecen en la placa de LB+S/A, o sea, la
confirmación del inicio de crecimiento de estas y su dispersión por la placa. Por
otro lado, hay que tener en cuenta que no toda la mezcla funciona para toda la
cepa y que en este caso las conjugadas crecieron.

➢ Si hay crecimiento bacteriano en la placa con Amp. + y Strep. + (Fig.3), se

confirmaría la predicción de recombinación de los genes de resistencia a
antibióticos a una nueva cepa bacteriana? Explique.
Si, ya que esto indica que hubo un intercambio de material genético entre las dos
cepas de E. Coli R- Amp y R- Strep, obteniendo así una nueva cepa resistente a
los dos antibióticos E. coli R amp, strep.

➢ De acuerdo a los resultados de esta práctica, se podría determinar si el gen de la

resistencia a Strep. fue transferido a la otra cepa; o si el gen para la resistencia a
la Amp. en el plásmido fue transferido a la cepa con resistencia la Strep.?
Explique.
Si se podría determinar el intercambio y transferencia recíprocos de los genes
para la resistencia a ampicilina y a estreptomicina entre las dos cepas. Debido a
que se logró un crecimiento de bacterias en el experimento de Recombinación
en la placa con LB + ampicilina + estreptomicina, se confirma que el gen de
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resistencia a la ampicilina de la cepa I fue transferida a la cepa II y el gen de

resistencia a
estreptomicina de la cepa II fue transferido a la cepa I. Lo anterior creó bacterias
con el genotipo de resistencia a ambos antibióticos (E. coli R amp, strep).

➢ ¿cuál es el genotipo de la cepa donadora y la cepa receptora empleada en este

procedimiento?
Las cepas donadoras se caracterizan por presentar un genotipo de resistencia a la
ampicilina y estreptomicina, las cepas receptoras se caracterizan por su
sensibilidad a estos antibióticos como las dos son donadoras y receptoras ya que
la primera presenta resistencia a la estreptomicina y la segunda es sensible a este
antibiótico, en cambio la segunda cepa presenta resistencia a la ampicilina, pero
es susceptible a la estreptomicina.

➢ ¿Qué marcadores genéticos fueron empleados para verificar la conjugación?

El marcador genético empleado fue el gen del lac Z, que codifica la
βgalactosidasa.

➢ Mencione otros marcadores de selección que podrían utilizarse como criterio

para identificar bacterias conjugadas.

Tetraciclina, Kanamicina, Quinolonas, Trimetoprim, Sulfametoxazol,

Ampicilina, Cloranfenicol.

➢ Explique la composición y preparación del medio LB. el medio LB, según la

descripción de Miller, para el crecimiento y mantenimiento de las cepas
recombinantes de E. coli utilizadas en procedimientos de microbiología
molecular. Estas cepas generalmente derivan de E. coli K12, que no pueden
producir vitamina B, por lo que este medio está formulado para promover el
crecimiento de microorganismos nutricionalmente exigentes. Esta cepa de E. coli
se ha modificado aún más a través de una mutación específica para crear una
cepa auxotrófica que no es capaz de crecer en medios nutricionalmente
deficientes. La triptona proporciona nitrógeno, vitaminas, minerales y
aminoácidos esenciales para el crecimiento. El extracto de levadura es fuente de
vitaminas, particularmente del grupo B. El cloruro de sodio suministra
electrolitos esenciales para el transporte y el equilibrio osmótico. El agar
bacteriológico es el agente solidificante. Si se desea, agregar asépticamente 10
ml de solución estéril al 20% de glucosa y mezclar bien para un mejor
crecimiento. Las bacterias que contienen plásmidos tienden a crecer mejor en
caldos que contienen entre 5 y 10 g de sal. También pueden agregarse cofactores
al caldo cuando se trabaja con ciertos tipos de bacteriófagos. Por ejemplo, la
bacteriófaga lambda requiere un exceso de magnesio en el caldo para infectar
bacterias de forma adecuada. Su composición es 15gr/L de Agar bacteriano, 10
gr/L de Cloruro de Sodio, 10 gr/L de Triptona y 5 gr/L de extracto de levadura.
Su preparación usual es, se suspenden 40 gramos de medio en un litro de agua
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destilada. se mezcla y se disuelve, se calienta con agitación frecuente. y se deja

hervir durante un minuto hasta disolver por completo. posteriormente se
esteriliza en autoclave a 121 oC durante 15 minutos. y se Enfrian a 45-50 oC,
mezclar bien y dispensar en placas. (Atlas, R.M., L.C.Parks. 1993)

7. BIBLIOGRAFÍAS

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ancestralmenteamáquinas de conjugación.Mol Microbiol.2001Abril;40(2):294 – 305.

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