INTRODUCCION

OBJETIVOS ESPECIFICOS
Que al finalizar el laboratorio práctico en modalidad virtual el estudiante sea capaz de:

1. Comprobar la naturaleza
lipídica de los triglicéridos.
2. Cuantificar los triglicéridos en una muestra de suero utilizando un método enzimático.

3. Valorar la utilidad de técnicas adecuadas en la determinación de compuestos de importancia para

el diagnóstico clínico, como son los triglicéridos

INTRODUCCIÓN

Los lípidos son componentes celulares cuya característica común y definitoria es su'insolubilidad
en
agua; los más sencillos son los triacilgliceroles, también denominados triglicéridos, grasas o grasas

Dado que los hidroxilos polares del glicerol y los carboxilatos polares de los ácidos grasos están unidos
por enlaces éster, los triacilgliceroles son moléculas apolares, hidrofóbicas, prácticamente insolubles.

Las células especializadas en el ser humano, denominadas (adipocitos o células grasas, almacenan en el.
(citoso] grandes cantidades de triacilgliceroles
en forma de gotitas de grasa que ocupan casi totalmente
la célula.

[El tejido: graso, formado principalmente

por adipocitos, se encuentra debajo de la piel, en la cavidad

ESTERES DE GLICEROL

Los triglicéridos (triacilgliceroles) o ésteres de glicerol que prevalecen

en el plasma y en la grasa de
almacenamiento
'en los tejidos, están formados por ácidos grasos unidos a través de enlaces éster en
los tres átomos de carbono de la cadena de glicerol. Un triglicérido simple contiene tres ácidos grasos
idénticos y un triglicérido mixto contiene ácidos grasos diferentes.
Glicerol

o 1
| o-
Ácido graso libre

pa
H—C—-OH
PAS
o

Triglicérido

Estructura de las moléculas de glicerol, ácido graso libre y Triglicérido.

¡Los
triglicéridos que proceden (de fuentes animales tienen cadenas de ácidos grasos relativamente
Cortas y saturadas que se solidifican a temperatura ambiente y se llaman comúnmente grasas. Los que
 proceden de origen vegetal suelen tener cadenas más largas que son poliinsaturadas y permanecen
líquidas a temperatura ambiente e inclusive en refrigeración y son conocidos como aceites.
Las grasas y los aceites son las formas principales de almacenamiento energético, mientras que los
fosfolípidos y los esteroles constituyen los principales elementos estructurales de las membranas
biológicas

Otros lípidos desempeñan funciones cruciales como cofactores enzimáticos, transportadores

electrónicos, pigmentos que absorben la luz, anclas hidrofóbicas para proteínas, agentes
emulsionantes en el tracto digestivo, hormonas y mensajeros intracelulares.

Los estados patológicos que afectan el transporte de lípidos se deben principalmente a defectos
Ihereditarios, algunos de los cuales causan hipertrigliceridemia
y otros hipercolesterolemia o ambos
iy aterosclerosis prematura. La obesidad es un factor de riesgo para el desarrollo
de diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial, hiperlipoproteinemia y diversas disfunciones
endócrinas.

Medición de triglicéridos (TAG)

La medición de triglicéridos séricos junto con el colesteroles muy útil para detectar ciertos trastornos
genéticos y otros trastornos de tipo metabólicos, así como para evaluar el riesgo de desarrollar
“enfermedad coronaria. El valor de triglicéridos se emplea también por lo común en la
estimación del colesterol-LDL, mediante la ecuación de Friedewald.

Varias secuencias de reacciones enzimáticas están disponibles para la medición de triglicéridos,

en:
todas se emplean lipasas para separar los ácidos grasos del glicerol. Además se emplean glicerol cinasa

2. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL Y EQUIPO

. Espectrofotómetro o colorímetro.
. 2 Micropipetas (de 10 pL y de 1000 puL).
e Puntas amarillas y azules desechables.
e 1 Gradilla y tubos de ensayo.
. 3 cubetas espectrofotométricas para lectura.
e 1 frasco para descarte.
. Reloj.

REACTIVOS Reactivo de TAG

- Reactivo
de Color: con su estandar

Esíuna
buffereada
solución a pH 7.2 que contiene: 4 — clorofenol, 4 —aminoantipirina, innes magnesio,
ATP, lipasas, , glicerol kinasa, glicerol 3-fosfato oxidasa y peroxidasas.

- Estándar: contiene 200 mg/dL (2.28 mmol/L) de triglicéridos.

 MUESTRA
¡Suero,
heparinizado
plasma o plasma con EDTA, La muestra preferencial es suero, éste debe ser fresco,
claro y no hemolizado y debe ser/extraído del paciente por la mañana (después
de un ayuno de 12
horas. Estabilidad de la muestra: 3 días entre 2 -8*C; 4 meses a -20*C.

CONSERVACIÓN DE PLASMA Y SUERO:

: A temperatura ambiente no se debe observar modificación alguna de los metabolitos y enzimas
durante las primeras 6 horas.
+ A4? C y en recipiente cerrado, plasma y suero pueden ser conservados hasta 24 horas sin que
presenten modificaciones.

NOTA: Las muestras lipémicas generalmente generan turbidez en la mezcla del reactivo con la
muestra, lo que lleva a resultados elevados falsos. El Factor Aclarante de Lípidos (LCF) evita que se den
resultados elevados falsos, ya que aclara completamente la turbidez causada por las muestras
lipémicas.

METODO

“"GPO - PAP”. ANALISIS ENZIMATICO FOTOMETRICO.

Prueba enzimática colorimétrica con factor aclarante de lípidos (LCF):

Los triglicéridos son determinados después de hidrólisis enzimática con la lipasa. El indicador obtenido
'es
quinoneimina
la formada a partir de peróxido de hidrógeno, 4 — aminoantipirina y 4 — clorofenol
bajo la influencia catalítica de la peroxidasa (reacción de Trinder). La intensidad del color producido es:
directamente proporcional a la concentración de triglicéridos en la muestra.
PRINCIPIOS DE LA REACCION

Triglicéridos IN Glicerol + Acidos Grasos

Glicerol + _ATP A Glicerol 3 — Fosfato + ADP

GPO
Glicerol 3 — Fosfato + 0 ——————> Fosfato dihidroxiacetona + H202

H202+ 4 — aminoantipirina + 4 — Clorofenol FOR Quinoneimina + HCl + H20

GK= Glicerol Kinasa

GPO =Glicerol 3 — Fosfato Oxidasa
POD= Peroxidasa

PRECAUCIONES

Los reactivos contienen azida de sodio como preservante. Evitar el contacto con la piel y las
membranas mucosas.
El reactivo de color debe protegerse de la luz. Evitar contaminación y almacenarlo
entre 2 a 8 *C.
NOTA: No interfieren en las pruebas valores de hemoglobina hasta 150 mg/dL o de bilirrubina hasta
40 mg/aL. Ascorbato > 4 mg/dL puede interferir.

2. PROCEDIMIENTO
1) Rotule 3 tubos de ensayo: 1 (muestra), 2 (estándar) y 3 (blanco).

2) A continuación siga las instrucciones de acuerdo al cuadro siguiente. (Agregar los reactivos en el
orden indicado).

Tubos 1 2 3

¡Reactivos Muestra Estándar Blanco

Suero A A
Estándar Lo cmammmean
¡Reactivo de color

Agregamos el suero Agregamosel reactivo (mi)

3) Mezclar, dejar en reposo a temperatura ambiente por 10 minutos o por 5 minutos a 37" C.

Prepare 3 cubetas espectrofotométricas completamente limpias y secas.

4) Leer la absorbancia de la muestra y el estándar frente al blanco de reactivo antes de 60 minutos, a

una longitud de onda de 550 nm.

VALOR DE REFERENCIA NORMAL DE TAG EN SUERO = < 150 mg/dL.

VALOR DE REFERENCIA NORMAL DE COLESTEROL EN SUERO = < 200 mg/dL.

 FORMULAS PARA REALIZAR CALCULOS:
D.O. (absorbancia) M = 0.222
D.O. (absorbancia) St = 0.183
Concent. TAG = 242 mg/dl

Efectúe los cálculos.

¿Cuáles son sus conclusiones de acuerdo al valor de la concentración de TAG del paciente
que Ud. calculó? Están por encima de los valores normales, requiere tratamiento.

Resuelva el siguiente problema:

Aplicando la fórmula, calcule la concentración de TAG de un paciente si los resultados del análisis
fueron:

D.O. de la muestra = 0.042

D.O. del estándar = 0.060

Concent. TAG = 140 mg/dl

De acuerdo a los valores de referencia, ¿cuáles son sus conclusiones? Los niveles de TAG están por
debajo de los valores normales pero sin riesgo

3. VALORES DE REFERENCIA
Lípido Sin Riesgo Intervalo Requiere

Sospechoso Tratamiento

Triglicéridos < 150 mg/dL 150 a 200 mg/dL |» 200 mg/dL

Colesterol LDL < 100 mg/dL 100 a 129 mg/dL [> 130 mg/dL

Colesterol HDL > 40 mg/dL

Deseables Límite de Bajo Riesgo Valor de Alto

riesgo

Niveles de Colesterol |< 200 mg/dL 200 — 239 mg/dL > 240 mg/dL
(adultos mayores de
(< 5.2 mmol/L) (5.2 — 6.2 mmol/L) (> 6.4 mmol/L)
20 años)
 a ABS (muestra) Valor de referencia de los
cálculos [MD Triglicéridos= E” X200 mg/dl | triglicéridos es <150 mg/dl|

5) mm» 0,183
CM mo 0,222 0 bi 1200 me/a "242 mg/dl

no
| Fundamento del método

Triglicéridos mama), Glicerol + ácidos grasos

Glicerol + ATP e Glicerol-SP + ADP

3-glicerol tostato
Glicerol-3P +02 id
mean. — DHA-P + H202
Peroxidasa
H202 + 4-amino antipirina + 4 cloro fenol ma, Quinoneimina + 4H20

Esto desarrolla un color y La intensidad del color se determina

con el espectrofotómetro o colorímetro, a una longitud de
onda (A) de 550 nm.