Manual de prácticas de laboratorio de Bioquímica II

Práctica No. 2
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DIGESTIVAS SOBRE CARBOHIDRATOS, LÍPIDOS Y
PROTEINAS DE LA DIETA

INTRODUCCIÓN

La dieta provee al organismo de combustibles metabólicos, principalmente

carbohidratos, lípidos y proteínas; así como de fibra, minerales, vitaminas y ácidos grasos
esenciales. La mayor parte de los alimentos que son ingeridos se encuentran en una forma
inadecuada para poder ser absorbidos en el aparato digestivo hasta que son reducidos a
moléculas pequeñas. Los cambios químicos que ocurren durante la digestión se llevan a
cabo con la ayuda de enzimas hidrolasas del aparato digestivo, que degradan a los
polisacáridos, triglicéridos y proteínas de la dieta a sus unidades monoméricas antes de
ser absorbidos y utilizados por el cuerpo (Bender & Mayes, 2015).

La digestión de carbohidratos inicia con la hidrólisis enzimática que libera

oligosacáridos y luego mono- y disacáridos libres. En la dieta humana el almidón es la
principal fuente de carbohidratos, y por ende de energía. Es digerido por hidrólisis
enzimática catalizada por la ​amilasa salival (actúa en la boca), y por la ​pancreática​, que
ejerce su acción en el intestino delgado (Latorre, 2008; Silva, 2007). Las enzimas
α-amilasa (α-1,4-D-glucan 4-glucanohidrolasa) están presentes en los humanos;
catalizan la hidrólisis al azar de los enlaces glucosídicos α (1-4) de la región central de la
cadena de amilosa y amilopectina del almidón, exceptuando las moléculas cercanas a la
ramificación (enlaces glucosídicos α 1-6), obteniendo como resultado glucosa, maltosa,
maltotriosa y dextrinas ramificadas (Espitia, 2009; Bender & Mayes, 2015).
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Posteriormente, estos productos son digeridos por disacaridasas en el intestino

delgado, absorbidos por enterocitos en la mucosa intestinal y exportados hacia la
circulación porta (Harvey & Ferrier, 2011). Por otro lado, la celulosa contenida en
alimentos de origen vegetal contiene enlaces glucosídicos β (1-4) que no pueden ser
digerido por las α -amilasas de los mamíferos; junto con los polisacáridos de las paredes
celulares de los vegetales y la lignina de los alimentos son un componente importante de
la fibra dietética y forman la masa principal de los residuos de la digestión (Martin, Mayes,
Rodwell & Granner, 1986).

La mayor parte de los lípidos en la dieta son triacilglicéridos, los fosfolípidos

aparecen en menor proporción. Estas moléculas hidrofóbicas se deben hidrolizar y
emulsificar en forma de pequeñas micelas antes de poder ser absorbidas en el intestino.
Las vitaminas liposolubles y otros lípidos, incluyendo colesterol y carotenos, también se
absorben disueltos en estas micelas lipídicas. La hidrólisis de triglicéridos se inicia por
acción de ​lipasas linguales y gástricas​, que atacan el enlace éster en posición 3, liberando
1,2-diacilgliceroles y ácidos grasos libres, que actúan como agentes emulsificantes.
Posteriormente se secreta al intestino delgado ​la lipasa pancreática​, que requiere de la
proteína ​colipasa para activarse. Sus blancos principales son los enlaces éster de las
posiciones 1 y 3 de los triglicéridos, resultando en la liberación de 2-monoacilgliceroles y
ácidos grasos libres. La esterasa pancreática hidroliza monoacilgliceroles con baja
eficiencia en el lumen intestinal, de tal forma que solamente el 25% de los triglicéridos
ingeridos se hidrolizan completamente a glicerol y ácidos grasos antes de su absorción.

Las sales biliares permiten la emulsificación de los productos de la digestión lipídica

en micelas, junto con los fosfolípidos, colesterol y vitaminas liposolubles de la dieta. Son
transportados de esta forma hasta el borde de la mucosa intestinal, en donde son
absorbidas por las células epiteliales (Bender & Mayes, 2015; Harvey & Ferrier, 2011).
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Las proteínas de la dieta son naturalmente resistentes a la digestión, por lo que

deben ser desnaturalizadas previamente por calor y por la acción del ácido gástrico con el
fin de exponer sus enlaces peptídicos, volviéndolos accesibles a las enzimas proteolíticas.
La ​pepsina del jugo gástrico (pH 1 - 2) cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos
adyacentes a aminoácidos con cadenas laterales aromáticas, ramificadas y metionina. La
pepsina es una ​endopeptidasa​, puesto que hidroliza enlaces peptídicos entre aminoácidos
específicos dentro de la estructura polipeptídica, produciendo péptidos de diversos
tamaños. El paso del quimo ácido al duodeno induce la secreción pancreática y biliar, las
cuales son alcalinas, produciendo un cambio de pH necesario para la acción de las enzimas
contenidas en los jugos pancreático e intestinal (aproximadamente pH 8), pero que inhibe
la acción de la pepsina (Martin, et al., 1986). Dentro de las enzimas contenidas en el jugo
pancreático, la ​tripsina cataliza la hidrólisis de ésteres de lisina y arginina; ​quimiotripsina
los de aminoácidos aromáticos, y ​elastasa los de aminoácidos pequeños con cadenas
alifáticas neutras. Así mismo, las ​exopeptidasas catalizan la hidrólisis de un enlace
peptídico a la vez en los extremos de los péptidos, las ​carboxipeptidasas producen la
liberación de aminoácidos de los extremos carboxilo terminal libres. Las ​aminopeptidasas​,
secretadas por las células de la mucosa intestinal, liberan aminoácidos de los extremos
amino terminales libres.

Finalmente, las dipeptidasas y tripeptidasas presentes en los bordes en cepillo de

las células intestinales, catalizan la hidrólisis de di- y tripéptidos, que no son sustratos de
las amino-y carboxipeptidasas (Bender & Mayes, 2015). El producto de esta digestión
enzimática es una mezcla de aminoácidos libres, di- y tripéptidos y oligopéptidos, los
cuales son absorbidos por las células intestinales. En general los di y tripéptidos son
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hidrolizados dentro de los enterocitos a aminoácidos libres y se transportan a la vena

hepática portal.

En la presente práctica se determinará de forma experimental la acción de cuatro

enzimas de la digestión sobre almidón, fibra, grasas de la leche entera, gelatina y caseína.
Los azúcares reductores producidos durante la hidrólisis enzimática del almidón por la
amilasa pancreática pueden ser detectados cualitativamente por medio del ensayo de
Benedict. Este consiste en medir colorimétricamente la reducción de iones Cu​2+ a Cu​+​,
inducida por la acción de los azúcares reductores que se formarán en el medio conforme
la degradación enzimática avanza. La producción de azúcares reductores se evidenciará
por la formación de un precipitado de color rojo-naranja (Plummer, 1981). La producción
de ácidos grasos libres y 2-monoacilglicéridos durante la digestión de triglicéridos por la
lipasa pancreática produce acidificación del medio conforme avanza la reacción (Cardellá
& Hernández, 2007). El cambio de pH en la leche entera se detectará mediante el uso de
una solución indicadora que virará de morado (en medio alcalino) a rojo (medio ácido)
(Luna, 2015). Para evidenciar la digestión de proteínas en condiciones de pH ácido o
básico, la acción de la enzima pepsina se demostrará por medio de la degradación de
gelatina, una proteína derivada de la degradación del colágeno (Easote, 1955), y la de la
tripsina sobre la caseína, proteína encontrada comúnmente en la leche. La degradación de
gelatina producirá su licuefacción en tubo, mientras que la degradación de caseína
producirá halos claros o transparentes en el agar.

OBJETIVOS
Al finalizar la práctica el estudiante estará en la capacidad de:

● Conocer el efecto degradativo de cuatro enzimas digestivas sobre carbohidratos,

lípidos y proteínas.
● Determinar de forma experimental el efecto que tienen la variación de pH y
temperatura sobre la acción de las enzimas digestivas.
● Describir el tipo de enlace químico sobre el cual actúan las cuatro enzimas digestivas
empleadas en la práctica.
● Extrapolar sus observaciones al proceso fisiológico de la digestión humana, que tiene
lugar en diferentes ambientes en donde varía el pH
● Realizar un sumario de los procesos digestivos en el humano con énfasis en sus
aspectos bioquímicos.

MATERIALES Y EQUIPO

● Pipetas pasteur de vidrio

● Pipetas de 1, 5 y 10 mL
● Bulbos
● Cajas de Petri
● Tubos de ensayo
● Marcador rotulador
● Gradillas
● Estufa
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● Papel parafilm
● Baño de María a 37°C
● Incubadora microbiológica a 37°C
● Campana de flujo
● Regla

REACTIVOS

● Solución de leche entera al 12 % p/v

● Solución de pancreatina (lipasas, proteasas y amilasas) al 5% p/v
● Solución indicador universal pH 4-10
● Solución de gelatina al 16 % p/v
● Solución de tripsina al 0.05% p/v en HCl 0.1 N
● Solución de tripsina al 0.05% p/v en PBS 0.01 M pH 8.1
● HCl 0.1 N
● PBS 0.01 M (pH 8.1)
● Leche descremada en polvo
● Agar
● Medios de agar-caseína al 1% p/v: disolver 1.25 g de leche descremada en polvo en 125
mL de agua destilada, calentar. Mientras se calienta, agregar 1.875 g de agar poco a poco,
agitando constantemente. Dejar calentando hasta que se disuelva todo el agar. Servir en
cajas de Petri y dejar enfriar dentro de campana de flujo.
● Solución de pepsina al 10% p/v en buffer de acetatos 0.4 M pH 4.4
● Solución de pepsina al 10% p/v en NaOH 0.1 N
● Buffer de acetatos 0.4 M pH 4.4
● NaOH 0.1 N pH 13
● Solución de fibra al 1% p/v en buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio, pH 6.8
● Solución de almidón al 1% p/v en buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio pH 6.8
● Solución de amilasa diluida: Macerar 0.1 g de amilasa (5,000 unidades SKB/g), en 10 mL de
buffer de fosfato de sodio y cloruro de sodio, pH 6.8. Centrifugar la suspensión a 3,000
rpm por 5 minutos y guardar el sobrenadante. Diluir esta solución para obtener una
dilución 1:50.
● Solución de Benedict

IMPORTANTE
Asegúrese de haber leído el manual de toxicidades de los reactivos a utilizarse en esta práctica
(estructura, descripción, seguridad, toxicidad, descarte), así como saber cuál es el procedimiento
adecuado para el manejo de biológicos y el procedimiento a seguir en casos de emergencia que
pudieran surgir durante la práctica con estos reactivos. Para consultas por favor acceda a:

Documentos Electrónicos de consulta:

1. Manual Toxicidades - Depto. Bioquímica - USAC.pdf. Recuperado de:
https://drive.google.com/file/d/0B6jPwByhE5KJcEYza1FHNWVYVmM/view
2. Guía de Respuesta en caso de Emergencia. (2017). Recuperado de:
https://www.tc.gc.ca/media/documents/tmd-fra/SpanishERGPDF.pdf

PROCEDIMIENTO
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A. Digestión de grasas por enzimas lipasas contenidas en la pancreatina.

1. A un tubo de ensayo rotulado como PanH (solución de pancreatina hervida), agregar

2 ml de solución de pancreatina al 5% p/v, y colocar en un baño de agua hirviendo
durante 5 minutos. Dejar enfriar.

2. Prepare 3 tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

Número de tubo
Reactivo
1 2 control
Solución de leche entera al 12% p/v 1 ml 1 ml 1 ml
Solución de indicador universal 2-3 gts 2-3 gts 2-3 gts
Solución de pancreatina al 5% p/v 1 ml ----- -----
Solución de pancreatina hervida
---- 1 ml -----
(PanH)
Agua destilada ----- ---- 1 ml

3. Tapar cada tubo con papel parafilm y mezclar suavemente por inversión.

4. Colocar los tres tubos en baño de María a 37°C por 20 minutos.

5. Anotar cambios en la tabla 1 de resultados.

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B. Digestión de gelatina por pepsina

1. Prepare 4 tubos de ensayo con los siguientes reactivos:

Número de tubo
Control Control
Reactivo
1 2 (solución (solución
ácida) básica)
Solución de gelatina al 16 % p/v 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Solución de pepsina al 10 % p/v en medio ácido 1 ml ----- ----- -----
Solución de pepsina al 10 % p/v en medio básico ----- 1 ml ----- -----
Control de solución tampón de acetatos pH 4.4 ----- ---- 1 ml -----
Control de NaOH 0.1 N ----- ----- ----- 1 ml

2. Colocar los cuatro tubos en baño de María a 37°C por 20 minutos. Mezclar
suavemente eventualmente durante la incubación.

3. Luego de transcurridos los 20 minutos, dejar enfriar a 4°C por 30 minutos.

4. Anotar los cambios en la tabla 2 de resultados.

C. Digestión de caseína por tripsina

1. En el plato que contiene agar caseína, realizar un mapa de la posición en que se servirá
cada solución de la siguiente manera:

Posición Componente
1 Solución de tripsina al 0.05 % en
medio ácido
2 HCl 0.1 N
3 Solución de tripsina al 0.05 % en
medio básico
4 PBS 0.01 M pH 8.1

2. Servir 15 μl de cada componente en la posición correspondiente.

3. Incubar la caja a 37°C en incubadora y observar cambios a las 2 horas y 24 horas.

4. Anotar cambios en la tabla 3 de resultados.

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D. Digestión de almidón y fibra por amilasa

1. Servir 2 ml de amilasa diluida a un tubo de ensayo y colocarla en un baño hirviendo
por 5 minutos. Dejar enfriar.

Rotular tres tubos y prepararlos de acuerdo a la siguiente tabla:

Reactivo Tubo
1 2 3
Solución de almidón 1 ml 1 ml
Solución de fibra 1 ml
Solución de amilasa diluida 1 ml 1 ml
Solución de amilasa diluida hervida 1 ml

2. Mezclar los tubos cuidadosamente e incubar por 30 minutos a 37°C.

3. Agregar a cada tubo 1 ml de Reactivo de Benedict.

4. Mezclar y calentar en un baño de agua hirviente por 5 minutos.

5. Anote los cambios de color observados en las muestras, en la tabla 4 de resultados.

DIAGRAMA DE FLUJO
Esquematice el procedimiento a emplear en la realización de la práctica.
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DIAGRAMA DE FLUJO
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ANOTACIONES
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RESULTADOS

Tabla 1. Digestión de grasas por lipasas contenidas en la pancreatina

Tubo Color Apariencia

Tabla 2. Digestión de gelatina por pepsina

Observaciones
Tubo Aspecto
(grado de licuefacción en cruces)

Tabla 3. Digestión de caseína por tripsina

Posición Diámetro de halo (mm) Observaciones

Tabla 4. Digestión de almidón y fibra por amilasa

Tubo Color/apariencia Observaciones
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REFERENCIAS

Bender, D. & Mayes, P. (2015). ​Nutrición, digestión y absorción.​ En V. W: Rodwell, D.A.

Bender, K. M. Botham, P. J. Kenelly, & P. A. Weil (Eds.) Harper. Bioquímica ilustrada
(30ª ed.) (pp. 537-545). México: McGraw-Hill Interamericana Editores, S. A. de C. V.
Cardellá, R. & Hernández, R. (2007). Bioquímica Humana. Cuba: Editorial Ciencias Médicas.
Easote, J.E. (1955). The amino acid composition of mammalian collagen and gelatin.
Biochem J, 61(4 ​ ), 589-600.
Harvey, R. & Ferrier, D. (2011). ​Bioquímica (5ª ed). Florida, U.S.A.: Lippincott, Williams &
Wilkins.
Latorre, L. (2008). ​Análisis estructural y modificación funcional de la glucoamilasa de
Saccharomyces cerevisiae var. D ​ iastaticus (​ Tesis de Doctorado) Valencia, España:
Servei de Publicacions.
Luna, C. (2015). Aplicación de lipasas microbianas para la producción de biocombustibles
similares al biodiesel que integran la glicerina en forma de monoglicérido. (Tesis de
Doctorado). Córdoba, España: Servicio de Publicaciones de la Universidad de
Córdoba.
Martin, D., Mayes, P., Rodwell, V., & Granner, D. (1986). ​Harper. Bioquímica ilustrada (​ 10ª
ed.). México: El Manual Moderno, S.A. de C.V.
Plummer, D. T. (1981). Introducción a la bioquímica práctica.
Quesada-Mora, S. (2007). ​Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica
(p.148). San José, Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia. ISBN
978-9968-31-616-3
Silva, L. (2007). ​Estudio de la digestibilidad de carbohidratos y capacidad antioxidante de
leguminosas de mayor consumo en México. (Tesis de Maestría) Morelos, México:
Instituto Politécnico Nacional.

CUESTIONARIO

1. De las enzimas listadas abajo, esquematice en una tabla los siguientes aspectos:
a) El pH (o rango de pH) óptimo para su funcionamiento
b) Temperatura óptima para su funcionamiento.
c) Indique cuáles son los sustratos específicos sobre las que trabajan.
d) En qué parte del cuerpo (órgano y tipo de células) se sintetizan.
e) Forma de secreción (zimógeno o enzima activa)
f) Órgano o sitio fisiológico realizan su acción.

Enzimas: amilasa, lipasa, pepsina, renina, tripsina, quimiotripsina, elastasa,

carboxipeptidasa, ribonucleasa, desoxirribonucleasa, colesterilesterhidrolasa,
fosfolipasa A​2​, sales biliares, aminopeptidasas, dipeptidasas, sucrasa, maltasa, lactasa,
trehalasa, fosfatasa, isomaltasa, polinucleotidasa, nucleosidasas.
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2 ¿Cuáles son los componentes de la pancreatina?

3 Explique cuál es la reacción que se produce con el ensayo de Benedict y los azúcares
reductores.

4 Indique la importancia de la lipasa lingual en los bebés.

5 ¿Por qué es tan importante el calor en la digestión de los lípidos en el estómago?

6. ¿Cuál es la función de la fibra dietética en el proceso de digestión?

7. En una tabla indique cuales son los principales componentes aminoacídicos (en %) de la
gelatina y la caseína.
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REFERENCIAS

PS/GG 2018
PS2020 corregido y editado