Extracción de colágeno de piel, huesos y músculos de la basura

pez chaqueta de cuero (Odonus niger) y su caracterización

RESUMEN

En este estudio, se extrajo con éxito colágeno de desechos marinos, es decir, piel de pez
lenguado, que está disponible en la zona costera de Mangalore, India. El proceso de
extracción se optimizó utilizando una variable a la vez (OVAT) y la metodología de
superficie de respuesta(RSM) con Box-Behnken Design (BBD) fue lograr el máximo
rendimiento y se caracterizó el colágeno extraído. Se determinó que las condiciones
óptimas para obtener el mayor rendimiento de colágeno eran una concentración de ácido
acético de 0,54 M, una concentración de NaCl de 1,90 M, una relación disolvente/sólido
de 8,97 ml/g y un tiempo de 32,32 h. El rendimiento máximo de colágeno de 19,27 ±
0,05 mg/g de piel de pescado se logró en las condiciones óptimas. El análisis de
varianza y gráficos de contorno exhibieron una interacción significativa de todas las
variables seleccionadas sobre el proceso de extracción de colágeno. El análisis SDS-
PAGE (dodecilsulfato de sodio - electroforesis en gel de poliacrilamida) sugirió que el
colágeno extraído contenía tres cadenas α, es decir, (α1) 2, α2 (MW 118, 116 kDa) y una
cadena β (MW 200 kDa) que era similar al colágeno Tipo I de piel de becerro
disponible comercialmente. El análisis FT-IR (espectroscopia infrarroja por
transformada de Fourier) confirmó la existencia de disposiciones helicoidales de
colágeno. La observación SEM (microscopía electrónica de barrido) reveló que el
colágeno extraído estaba en forma de fibrillas con enlaces irregulares.
1. Introducción
El colágeno es una proteína estructural fibrosa y es un componente importante de la
matriz extracelular de los organismos vivos (Maroušek et al., 2015). Desempeña un
papel vital en el mantenimiento de la integridad de la estructura biológica, funciones de
varios tejidos (Gelse et al., 2003; Schmidt et al., 2016) y constituye alrededor del 25-
30% de las proteínas animales totales. Tiene una amplia gama de aplicaciones en
muchas industrias, como la industria del cuero, la cosmética, la farmacéutica (películas
delgadas de colágeno para la cicatrización de heridas) y la industria alimentaria (Jeong
et al., 2013; Silva et al., 2014). Exhibe propiedades significativas como alta resistencia a
la tracción, baja antigenicidad y buena biocompatibilidad (Subhan et al., 2017). El
colágeno induce la coagulación de las plaquetas sanguíneas, afecta la diferenciación
celular y contribuye a la cicatrización de heridas (Leitinger y Hohenester, 2007; Liu et
al., 2017).
Hasta el momento se han identificado veintinueve tipos de colágeno (Silvipriya et al.,
2015), sin embargo, la forma más abundante de colágeno es el colágeno tipo I, que tiene
una estructura de triple hélice que contiene tres cadenas α (α1-α1-α2) de
aproximadamente 1000 residuos de aminoácidos. Cada cadena α se compone de una
secuencia repetida de triples (Gly-X-Y)n, donde X e Y suelen ser prolina (Pro) e
hidroxiprolina (Hyp) (Addad et al., 2011; Yang et al., 2014). El colágeno tipo I se
encuentra en varias partes de los organismos vivos, como tejidos, piel, huesos, dermis,
tendones, ligamentos y córnea (Krishnamoorthi et al., 2017). En lo que respecta a las
fuentes de colágeno, los colágenos de mamíferos, como el bovino y el porcino, son las
principales fuentes de colágeno para aplicaciones industriales. Dado que estos
colágenos están asociados con muchos problemas, como un brote de encefalopatía
espongiforme bovina (BSE), fiebre aftosa (FMD) y restricciones basadas en la religión
(Duan et al., 2009; Zhao y Chi, 2009; Jeevithan et al. , 2014; Liang et al., 2014), la
identificación de una nueva fuente es muy esencial. Las especies marinas se pueden
utilizar como una fuente alternativa y segura para la extracción de colágeno. Se han
identificado diferentes tipos de especies marinas como la anguila, la sepia, el pez pipa
de algas, el calamar, el bagre y el pez globo ocelado como fuente potencial de colágeno
(Khan et al., 2009; Kołodziejska et al., 1999; Nagai et al., 2002; Shanmugam, 2012;
Veeruraj et al., 2013; Zhang et al., 2009).
El lenguado (Aseraggodes umbratilis), una especie marina de peces planos de la familia
Soleidae, está abundantemente disponible en la región costera de Karnataka, costa
suroeste de India (12°58′50.5″N, 74°48′12.2″E) (Nair y Gopalakrishnan, 2013). Las
industrias de procesamiento de pescado en la región costera generan una gran cantidad
de piel de lenguado como desechos marinos. La utilización ecológica de estos desechos
para la extracción de colágeno podría ser la mejor opción para una mayor rentabilidad y
una gestión eficiente de los desechos (Kittiphattanabawon et al., 2005). Generalmente,
la piel de pescado contiene una gran cantidad de colágeno que se puede extraer y
utilizar (Liu et al., 2007; Subhan et al., 2015). Aunque se dispone de un gran número de
estudios sobre la extracción de colágeno de fuentes marinas, la optimización y el estudio
del efecto de los parámetros elegidos sobre la extracción de colágeno de la piel del
lenguado (Aseraggodes umbratilis) aún no se ha informado.
El estudio actual es un intento de optimizar las variables del proceso para obtener el
mayor rendimiento de colágeno por gramo de piel de lenguado. Se optimizaron varios
factores como la concentración de ácido acético (M), la concentración de NaCl (M), la
relación solvente/sólido (ml/g) y el tiempo (h) para lograr el máximo rendimiento de
colágeno de la piel del lenguado. Los resultados obtenidos se validaron mediante la
metodología de superficie de respuesta (RSM) basada en el método de diseño de Box-
Behnken (BBD) y un modelo cuadrático correlacionando los parámetros. El efecto de
interacción entre las variables se estudió mediante gráficos de contorno.
2. Materiales y métodos
Los desechos de piel de lenguado se recogieron en el mercado de pescado de Surathkal,
Mangalore, Karnataka, India (12°58′50,5″N, 74°48′12,2″E). El hidróxido de sodio
(NaOH), el cloruro de sodio (NaCl) y el butanol (99 %) se adquirieron de Loba Chemie
y el ácido acético se adquirió de Merck India Ltd. Acrilamida, bis-acrilamida, Tris-HCl,
SDS (dodecilsulfato de sodio) , persulfato de amonio, TEMED
(tetraacetiletilendiamina), glicerol, β-mercaptoetanol, azul de bromofenol y Coomassie
R-250 se adquirieron de Hi media. El colágeno tipo I de piel de ternera y el marcador de
proteína teñido previamente se adquirieron de sigma-aldrich.
2.1. Pretratamiento
La piel de lenguado se trató con NaOH 0,3 M en una proporción de 1/10 (p/v) para
eliminar las proteínas no colagenosas. La mezcla se agitó continuamente durante 4 h y
la solución de NaOH se cambió cada 60 min. Después de 4 h de tratamiento, la solución
se eliminó con gasa. Luego se lavaron las pieles tratadas con agua destilada hasta
alcanzar un pH neutro y luego se desengrasó la piel durante 30 h manteniéndola en un
solvente de butanol al 20% a razón de 1 g en 10 ml y cada 10 h se procedió a la
disolución de butanol. cambió. Las pieles desgrasadas se lavaron con agua destilada
hasta pH neutro.
2.2. Procedimiento de extracción
Después del proceso de pretratamiento, la muestra se transfirió a matraces que
contenían diferentes concentraciones de ácido acético. Las muestras tratadas con ácido
acético se filtraron a través de una gasa de cuatro capas. Tomando el volumen final del
filtrado como 7 ml, se adicionó tris-HCl 0.05 M y cantidad adecuada de NaCl para
obtener diferentes concentraciones (0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 M) de NaCl en la solución y
se ajustó el pH. utilizando NaOH 5 M hasta que el filtrado alcanzó un pH ligeramente
básico. El filtrado así obtenido se centrifugó a 130 × g durante 40 min. Se descartó el
sobrenadante y se recogió el sedimento y se disolvió en 5 ml de solución de ácido
acético y se dializó frente a 1 l de ácido acético 0,1 M durante 24 h. Las muestras se
dializaron adicionalmente en agua destilada durante otras 24 h. Todos estos pasos se
realizaron a 10 °C.
2.3. Estudio experimental
2.3.1. Método de una variable a la vez (OVAT)
Se determinó un rango inicial de condiciones de proceso para la extracción de colágeno
de la piel de lenguado utilizando un diseño de factor único. Para realizar el diseño de un
factor, se varió una variable independiente a la vez (OVAT) y las variables restantes se
mantuvieron constantes. Las variables utilizadas para el método OVAT fueron ácido
acético (0,2–1,0 M), NaCl (0,5–2,5 M), relación disolvente/sólido (8–16 ml/g), tiempo
(12–60 h). En los estudios de relación solvente/sólido, se utilizaron diferentes
volúmenes (ml) de la concentración óptima de ácido acético obtenida previamente por
gramo de piel de pescado. Se realizaron un total de 20 experimentos de un solo factor
por triplicado para determinar el efecto de las variables seleccionadas en la extracción
de colágeno.

2.3.2. Metodología de superficie de respuesta

RSM es una herramienta estadística utilizada para construir un modelo empírico y
encontrar el mejor conjunto de variables para la respuesta deseada. Incluye diseño
factorial de tres niveles, diseño compuesto central (CCD), diseño Box Behnken (BBD)
y diseño D-óptimo. Entre todos estos diseños, el diseño experimental de Box-Behnken
(BBD) tiene una excelente previsibilidad. En este trabajo se empleó el Diseño Box
Behnken (BBD) variando cuatro variables en tres niveles (−1,0, +1). (0) se consideró
como el punto central, (−1) como nivel bajo (por debajo del punto central) y (+1) como
nivel alto (por encima del punto central). Las variables independientes y su diferente
elección de niveles se muestran en la Tabla 1. El rango de estas variables se aseguró a
partir de los resultados de los experimentos iniciales. Para evaluar el efecto de las
variables independientes sobre la extracción de colágeno, se realizaron 29 experimentos
por triplicado y se diseñaron las variables independientes A (Ácido acético), B (NaCl),
C (solvente/sólido), D (Tiempo). Se expresó el modelo de una ecuación cuadrática
completa para predecir el punto óptimo de acuerdo con la siguiente ecuación:

donde, Y representa las variables de respuesta, β0 es una constante, βi, βii y βij son los
coeficientes lineal, cuadrático y de producto cruzado, respectivamente. Xi y Xj son los
niveles de las variables independientes. La eficiencia del modelo y la significación
estadística se analizaron mediante la prueba F y la prueba R. El efecto de la variable
individual se analizó realizando un análisis detallado de la varianza (ANOVA) en el
nivel codificado de las variables. El RSM y el diseño de experimentos se realizaron
utilizando Design-Expert, (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN).
2.4. Estimación de proteínas
Con base en el método de Lowry modificado, la producción de colágeno se cuantificó
utilizando un espectrofotómetro UV-VIS (espectroscopía ultravioleta-visible, Hitachi) a
650 nm (Kiew y Don, 2013).
2.5. Análisis electroforético
El gel de apilamiento al 4 % se preparó utilizando 30:0,8 % de acrilamida: bis
acrilamida, Tris-HCl (pH 6,8), SDS al 20 %, persulfato de amonio al 10 % y TEMED.
Se preparó un gel de separación al 8 % utilizando 30:0,8 % de acrilamida:
bisacrilamida, Tris-HCl (pH 8,8), SDS al 20 %, persulfato de amonio al 10 % y
TEMED. Se utilizaron glicina al 25 %, SDS al 20 %, mercaptoetanol β al 5 % y azul de
bromofenol al 0,1 % para la preparación del tinte de carga de muestra 3 ×. Después de
completar la electroforesis, el gel se visualizó utilizando la solución de tinción
Coomassie Brilliant Blue R-250. El gel SDS-PAGE se corrió con la ayuda del sistema
electroforético Mini-PROTEAN
2.6. Estudios de caracterización
2.6.1. FT-IR
Mediante FT-IR (espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier), se analizaron
los grupos funcionales y las interacciones entre los enlaces del colágeno extraído. La
muestra se preparó utilizando el método de gránulos de KBr (bromuro de potasio) y se
escaneó entre 650 y 4000 cm−1 de número de onda, utilizando el instrumento FT-IR
(Jasco FT-IR-4200, Japón).
2.6.2. SEM
Se utilizó SEM (Microscopio electrónico de barrido) para analizar la estructura del
colágeno extraído. La muestra se recubrió con oro usando un recubridor automático de
iones finos (JEOL JFC-1600) y la estructura se observó con un microscopio electrónico
de barrido (JEOL JSM-638OLA) usando 20 kV como voltaje de aceleración.
3. Resultados y discusión
El efecto del ácido acético, NaCl, la relación sólido/disolvente y el tiempo en la
extracción de colágeno se estudió mediante el método de una variable a la vez (OVAT).
3.1. Efecto del ácido acético en la extracción de colágeno
El efecto del ácido acético (0,2-1,0 M) sobre la extracción de colágeno se determinó
manteniendo constantes otras tres variables (NaCl-1,0 M, relación disolvente/sólido-12
ml/g, Tiempo-24 h). Cuando se aumentó la concentración de ácido acético, el
rendimiento de colágeno aumentó gradualmente y se observó un máximo de 15,968
mg/g de piel de pescado a 0,6 M de ácido acético. Más allá de 0,6 M, se encuentra que
el rendimiento de colágeno se reduce gradualmente (Wang et al., 2008) de 0,8 M a 1,0
M y la Fig. 1 ilustra lo mismo. A medida que la concentración de ácido acético aumenta
más allá de 0,6 M, la estructura del colágeno se desnaturaliza, como lo indican los
diferentes niveles de producción de colágeno (Fig. 1a).
3.2. Efecto del NaCl en la extracción de colágeno
El proceso de extracción se llevó a cabo por el método de salinización utilizando varias
concentraciones de NaCl que van desde 0,5 a 2,5 M. Mientras se optimiza la
concentración de NaCl, otras variables como ácido acético (0,6 M), relación
solvente/sólido (12 ml/g), tiempo (24 h) se mantuvieron constantes. El mayor
rendimiento de colágeno, 17,679 mg/g de piel de pescado, se observó a una
concentración de 2,0 M de NaCl y más allá de 2,0 M, el rendimiento de colágeno
disminuyó como se muestra en la Fig. 1b. La reducción en el rendimiento de colágeno
podría deberse a la interacción hidrofóbica-hidrofóbica mejorada entre las cadenas de
proteínas como resultado del aumento de la fuerza iónica. Por lo tanto, la variación en la
fuerza iónica habría disminuido la liberación de colágeno de los tejidos de la piel, como
afirman Veeruraj et al. (2013).
3.3. Efecto de la relación solvente/sólido en la extracción de colágeno
La relación solvente/sólido se optimizó realizando un proceso de extracción de colágeno
dentro del rango de 8–16 ml/g de piel de pescado. Se obtuvo un rendimiento máximo de
colágeno de 18,358 mg/g de piel de pescado con una relación disolvente/sólido de 10
ml/g de piel de pescado (Kaewdang et al., 2014; Zhang et al., 2009). La Fig. 1c muestra
un mayor rendimiento de colágeno con un volumen de disolvente de hasta 10 ml y más
allá de este valor óptimo, el rendimiento de colágeno disminuyó gradualmente debido al
aumento en la fuerza del ácido acético que conduce a la desnaturalización del colágeno.

3.4. Efecto del tiempo en la extracción de colágeno

La optimización del tiempo para el proceso de extracción se realizó extendiendo el
tiempo de contacto entre el solvente óptimo y la piel de pescado (Sólido) por 12–60 h,
manteniendo constantes las demás variables (Wang et al., 2008). El rendimiento más
alto de 19,18 mg/g de piel de pescado se observó después de 36 h, más allá de lo cual se
observó una disminución gradual en el rendimiento de colágeno debido a la lenta
degradación por el solvente de ácido acético (Fig. 1d).
3.5. Modelo RSM para el proceso de extracción de colágeno.
En la Tabla 2 se muestra un total de 29 ejecuciones y sus respuestas utilizando el
experimento BBD, donde el rendimiento de colágeno varió entre 11,31 y 19,28 mg/g de
piel de pescado. El modelo de regresión se obtuvo ajustando los datos observados
usando varios modelos matemáticos con valores F de 2.2 (lineal), 0.66 (2FI), 8.02
(cúbico) y 726.66 (cuadrático), donde el modelo cuadrático mostró el valor F más alto
entre los modelos estudiados. Mientras que los otros modelos mostraron valores de p
más altos de 0,0899 (lineal), 0,6789 (2FI), 0,0102 (cúbico), el modelo cuadrático mostró
un valor de p < 0,0001 y se consideró como el modelo significativo. Los resultados
indican que el modelo cuadrático es el modelo adecuado para la respuesta elegida y los
otros modelos mostraron una falta de ajuste significativa. El resultado de ANOVA del
modelo cuadrático para la producción de colágeno se proporciona en la Tabla 3. El
modelo cuadrático tiene un valor F de 350,83, lo que indica que el modelo fue
significativo con solo un 0,01 % de probabilidad de que pudiera ocurrir debido al ruido.
En el modelo cuadrático, los términos significativos del modelo son A, B, C, D, AC,
AD, BC, BD, CD, A2, B2, C2, D2. El valor F (falta de ajuste) de 5,84 implica que la
falta de ajuste no es significativa. Hay un 5,18 % de posibilidades de que un "valor F de
falta de ajuste" se deba al ruido. La ecuación en términos de factores codificados podría
usarse para hacer predicciones sobre la respuesta para niveles dados de cada factor.
3.5.1. Interacción de variables de proceso
La interacción entre variables independientes se estudió mediante gráficos de contorno
que se dibujaron entre dos variables (A y B, A y C, A y D, B y C, B y D, y C y D),
mientras que las otras variables se mantuvieron constantes. . Todas las variables
utilizadas en este estudio mostraron efecto tanto positivo como negativo en sus términos
cuadráticos. La Fig. 2a representa el rendimiento de colágeno en función de
solvente/sólido y ácido acético, mientras que el NaCl y el tiempo se mantuvieron
constantes. Los rendimientos de colágeno primero aumentaron gradualmente hasta un
punto óptimo de 19,19 mg/g (en disolvente/sólido - 10 ml/g y ácido acético - 0,6 M) y
luego disminuyeron a medida que aumentaban ambas variables. Se observó una
tendencia similar en los gráficos de superficie de respuesta (2b, 2c, 2d, 2e, 2f) dibujados
con las otras variables. El rendimiento óptimo de 19,19 mg/g se observó en el gráfico de
contorno en las siguientes condiciones; (1) NaCl - 2,0 M y ácido acético - 0,6 M (Figs.
2b), (2) tiempo - 24 h y ácido acético - 0,6 M (Figs. 2c), (3) disolvente/sólido - 10 ml/g
y NaCl − 2,0 M (Figs. 2d), (4) tiempo − 24 h & NaCl − 2,0 M (Figs. 2e), (5)
3.5.2. Estudios confirmatorios de condiciones óptimas
El estudio RSM se llevó a cabo para predecir la condición óptima de ácido acético,
NaCl, solvente/sólido y el tiempo para la mayor extracción de colágeno de la piel del
lenguado usando menos experimentos reales. Con base en el resultado confirmatorio
propuesto por el experto en diseño, se realizaron experimentos usando los siguientes
datos 0.54 M de ácido acético, 1.90 M de NaCl, 8.97 ml/g de solvente/sólido y 32.32 h
de tiempo. Se logró un rendimiento máximo de 19,27 ± 0,05 mg/g utilizando el valor de
respuesta óptimo, que está a la par con el rendimiento previsto de 19,24 mg/g
3.6. Comparación de rendimiento con otras fuentes marinas
Como se observa en la Tabla 4, el rendimiento de colágeno de la piel del lenguado fue
comparable al rendimiento de colágeno de otros peces marinos como la sepia, el atún de
aleta amarilla y Brama australis. En la tabla, se pudo observar que la piel del lenguado
dio el rendimiento más alto junto al pargo patudo, y la piel del lenguado exhibió un
rendimiento de colágeno similar al de la sepia pero en un período de tiempo
relativamente más corto (32 h). En la mayoría de los casos, se puede observar que para
la extracción de colágeno se utilizó ácido acético 0,5 M y NaCl 2,0 M (Cuadro 4). Se
encontró que las concentraciones óptimas de ácido acético y NaCl utilizadas en el
presente estudio estaban en línea con los hallazgos de la literatura para la extracción de
colágeno de otras fuentes.
3.7. Determinación electroforética
La Fig. 3 muestra el resultado del análisis electroforético de colágeno de piel de pez
lenguado y colágeno de piel de ternera. El carril M representa el marcador de proteína
preteñido, mientras que el carril L1 consiste en colágeno de piel de ternera y el carril L2
consiste en colágeno de piel de pez lenguado. Se observaron cadenas α en el rango de
116–118 kDa y dímero β a 200 kDa al comparar las bandas de colágeno de piel de
ternera y colágeno de piel de lenguado con el marcador de proteína preteñido, que
fueron similares a los resultados informados por Zhang et al. (2009) (Liu et al., 2009). A
partir del análisis electroforético, el colágeno presente en la piel del lenguado se
identificó como colágeno tipo I (Nagai et al., 2001; Skierka y Sadowska, 2007; Mizuta
et al., 1994)
3.8. Análisis de espectroscopia FT-IR
El espectro FT-IR del colágeno extraído de la piel del pez lenguado se muestra en la
Fig. 4. Yan et al. (2008) observó una vibración de estiramiento de N-H libre a 3328
cm−1, pero en nuestra muestra, la vibración de estiramiento de N-H se desplaza a
3310,21 cm−1, lo que significa que el enlace de hidrógeno se desplazó hacia la
frecuencia más baja (Duan et al., 2009; Li et al., 2004). Generalmente, el rango de la
banda de amida I y la banda de amida II está entre 1625 y 1690 cm−1 y 1550–1600
cm−1 respectivamente. En esta muestra, la banda de amida I observada fue de alrededor
de 1650,77 cm-1 y la banda de amida II se desplazó a una frecuencia más baja de
1541,81 cm-1, lo que apoyó la disponibilidad del enlace de hidrógeno en el colágeno.
La banda de amida III también estuvo presente en nuestra muestra y se observó en el
número de onda de 1238,08 cm−1 (Muyonga et al., 2004; Purna Sai y Babu, 2001). La
vibración de estiramiento C-H, que generalmente ocurre entre 2854 y 1745 cm−1, se
observó a 2362,37 cm−1 (Abe y Krimm, 1972; Jackson et al., 1995).
3.9. Análisis SEM

El colágeno sintetizado se observó a simple vista y SEM para analizar su morfología. A

simple vista (Fig. 5a), el colágeno apareció como una esponja blanca suave con poros en
su superficie. La micrografía electrónica (Fig. 5b) mostró devanados aleatorios de
estructuras similares a bobinas que indican la naturaleza fibrosa del colágeno. A mayor
aumento, las fibrillas en espiral se encontraron como una lámina interconectada entre sí,
como se informa en la literatura (Sankar et al., 2008; Wang et al., 2014). El espacio
entre las láminas entrelazadas le da porosidad al colágeno del producto, lo que facilitará
la incorporación de cualquier químico de valor agregado como las drogas.
4. Conclusión
El rendimiento máximo de colágeno de 19,27 ± 0,05 mg/g de piel de pescado se logró
en las condiciones óptimas. Este estudio ha demostrado que se obtuvo un rendimiento
mejorado de colágeno cuando la concentración de ácido acético era de 0,54 M, la
concentración de NaCl de 1,90 M, la relación disolvente/sólido de 8,97 ml/gy el tiempo
de 32,32 h. Se implementó la metodología de superficie de respuesta con BBD y se
determinaron las condiciones óptimas (ácido acético, NaCl, relación solvente/sólido y
tiempo) para obtener el mayor rendimiento de colágeno (por gramo de piel de pescado).
Se encontró que cada una de las cuatro variables mostró un efecto significativo en la
extracción de colágeno de la piel del lenguado y se observó una relación positiva entre
todas estas variables. El modelo matemático obtenido tenía un valor R2 de 0,9972 y un
valor P de < 0,0001, lo que implicaba una buena concordancia entre los valores
predichos y los valores experimentales del rendimiento de colágeno de la piel del
lenguado y afirmaba una buena generalización del modelo matemático. . Se encontró
que el colágeno extraído de la piel del lenguado es colágeno tipo I, que consta de tres
cadenas α y una lámina β ((α1)2, α2, β). El análisis FT-IR indicó la presencia de
disposición helicoidal de colágeno. El análisis SEM de colágeno confirma la presencia y
organización de las fibrillas de colágeno.