I.

METODOLOGÍA

 Métodos de extracción del colágeno presente en escamas de pescado:

En los últimos años se ha despertado un gran interés en el uso del colágeno y con ello
los métodos de extracción (Salvatore et al., 2020). La extracción de colágeno de las
escamas de los peces, trae consigo una complejidad, tanto por las diferencias en
conformación estructural de las especies piscícolas, como por la composición química
(Chuaychan et al., 2017).

Sin embargo, el proceso combina 5 etapas, en las cuales se involucra tres etapas
previas a la extracción, que consisten en la separación y lavado de la escama, reducción
de tamaño y remoción de componentes no proteicos. Posteriormente, se realiza la
extracción del colágeno por solubilización, en donde existe una amplia gama de
métodos siendo estos la extracción enzimática, ácida, salina y por ultrasonido,
procesos que comparten el común denominador de la temperatura, ya que se debe
mantener un control de esta variable, la cual se recomienda mantener entre 4 a 10° C,
para evitar la desnaturalización del colágeno (Pal et al., 2015).

Entre algunos de estos métodos está el uso de sal de fenol que permite la extracción
mediante la utilización hidróxido de sodio (NaOH), agua desionizada, sulfato de
manganeso (MnSO4), acido hipocloroso (HClO) y fenoxido de sodio (C6H5O-Na+),
permitiendo cuantificar proteínas, los autores lo consideran uno de los métodos más
novedosos y económico a la hora de extracción de colágeno (Rodríguez Aranda, Arceo
Zepeda, Ramírez Barragán, Delgado Fornue, & Andrade Ortega, 2016).

En la mayoría de los estudios se encuentra el método de extracción de colágeno en

acido soluble, que se considera uno de los más utilizados, por ser económico y
accesible, ya que solo se requiere de ácido etílico, que permite separar la grasa. Otros
autores aparte de utilizar acido soluble adicionan enzimas como la pepsina, delvolase y
renina (Llerena Daza & Rodríguez Torres, 2017).

 Paso a paso del método de extracción de colágeno en ácido soluble:

1. Extracción de colágeno ácido soluble

El proceso completo desde el material crudo hasta el colágeno, comprende varias

etapas a saber: Extracción de proteínas de tejido conectivo, desengrasado,
descalcificación y extracción de colágeno. Las cuales se aplicaron a cada matriz según el
requerimiento, como se describe a continuación.

2. Hidrolisis de las proteínas del tejido conectivo

Este proceso se realizó a las tres matrices y se requiere para eliminar las proteínas
distintas al colágeno presentes en la muestra y que pueden convertirse en
contaminantes del colágeno al final del proceso (Serrano, 2011). Se realiza con
hidróxido de sodio (NaOH), el cual es un agente irritante y al entrar en contacto con las
proteínas de los tejidos vivos produce su rompimiento por efectos de hidrólisis (Liu et
 al., 2015). Luego de la hidrólisis los aminoácidos y péptidos más pequeños se liberan al
medio acuoso, pero al ser una base fuerte podría así mismo hidrolizar la molécula de
colágeno a pesar de ser una molécula fibrosa y resistente, por esta razón no se
recomienda usar altas temperaturas o altas concentraciones de NaOH (Serrano, 2011;
Pal et al, 2015). Se usó un reactor de vidrio con camisa de circulación de agua para
regular la temperatura y un sistema con agitación constante de 450 rpm y en
proporción muestra/solución de 1:10 (w/v) para cada región anatómica estudiada,
durante 12 horas continúas. Posteriormente las matrices se lavaron con agua destilada
hasta obtener pH neutro en el agua de lavado (Pal et al, 2015).

3. Eliminación del extracto etéreo

Se realizó solo a las pieles debido a su alto contenido de grasa, para reducir el
contenido de grasa en el colágeno final. Para ello se utilizó una solución de n-Butanol al
10% (v / v) en proporción muestra/solución de 1:10 (w / v) durante 12 h con agitación
suave (Zeng et al., 2009). La piel desgrasada se lavó con agua destilada y se almacenó a
-20°C hasta la siguiente etapa.

4. Descalcificación

Se realizó en las espinas y escamas por su alto contenido de calcio que afectaría
significativamente la pureza del colágeno. Se utilizó con una solución de ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 M con hidróxido de sodio (NaOH) a un pH de 8 en
proporción muestra/solución de 1:10 (w / v) durante 48 h con una agitación suave. Las
espinas y escamas descalcificadas se lavaron con agua destilada (Muyonga et al., 2004).

5. Obtención de colágeno

En esta etapa se busca liberar, solubilizar y recuperar en medio ácido el colágeno

presente en cada una de las matrices. Para ello se aplicó una solución de ácido acético
(CH3-COOH), en un reactor de vidrio con camisa de circulación de agua para regular la
temperatura, en un sistema con agitación constante de 450 rpm y en proporción
muestra/solución de 1:10 (w / v) para cada matriz estudiada durante 12 horas para
las espinas y escamas, 5 horas para la piel. Posteriormente a la solución ácida se le
adicionó una solución de 12% en NaCl, para precipitar el colágeno por la acción que
esta sal tiene sobre la fuerza iónica, posteriormente se filtró en embudo de polisulfona,
para su análisis posterior (Liu et al., 2013; Liu et al., 2015; Liu et al., 2014; Yu et al.,
2014).

II. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

1. Obtención de las escamas de pescado Cynoscion analis “cachema”, Sarda chiliensis

“bonito” y Cilus gilberti “corvina”
 Se consiguió escamas de tamaño mediano (0,5 a 1 cm de diámetro). se lavaron y se les
retiró las escamas con ayuda de un cuchillo dentado. Las escamas extraídas se lavaron
con abundante agua y se dejaron secar a temperatura ambiente. Posteriormente, se
pesó 500 gramos de escamas de cada espécimen y se colocaron en bolsas de papel
marcadas, para luego ser esterilizadas en estufa (vapor seco) a 80 °C por 30 minutos.

2. Obtención del colágeno

 Las escamas esterilizadas se hidrataron y se pulverizaron por método

mecánico. Este procedimiento consistió en colocar las escamas (Fig. 1) en una
olla.

Figura 1. Escamas de pescado Cynoscion analis “cachema”.

 Luego se le adicionó 1 litro de agua, para asi después llevarlo a fuego medio
moviendo constantemente. Se dejó hervir por un lapso de 30 minutos, pasado
este tiempo se retiró del fuego y se dejó enfriar.
 Figura 2. Mezcla de escamas de pescado con 1 litro de agua.

 Posteriormente se vertió en una licuadora, donde se pulverizó por 5 minutos,

obteniendo una solución homogénea (Figura 3).

Figura 3. Solución homogénea de escamas de pescado después de ser trituradas en la

licuadora.

 Después se filtró haciéndolo pasar por un tamiz, la mezcla obtenida se dejó

reposar durante toda la noche a 4 °C.
 Figura 4. Colágeno líquido a temperatura ambiente obtenido de escamas de Cilus
gilberti “corvina”.

 El procedimiento descrito se resume en la Figura 5.

Figura 5. Flujograma del proceso de obtención de colágeno.

3. Caracterización de colágeno obtenido

Se determinó el rendimiento de la extracción mediante comparación del peso del

producto final seco y la materia prima inicial seca.

4. Análisis bioquímico

Para realizar el cálculo de proteína total se aplicó de acuerdo a los métodos químicos
oficiales de la A.O.A.C. (2019), el método Kjeldahl (factor 6,25).

II. RESULTADOS:

La cantidad de colágeno de cada tratamiento es directamente proporcional a la cantidad de

proteína se obtuvo colágeno natural que fue extraído de las escamas de pescado Cynoscion
analis “cachema”, Sarda chiliensis “bonito” y Cilus gilberti “corvina”.

El colágeno líquido se solidificó a 4 °C en los tres tratamientos mostraron características

similares como se puede apreciar en la Figura 6. Estos resultados coinciden con las
investigaciones de Nagai et al. (2002) y Serrano (2011), quienes obtuvieron colágeno de
aletas, espinas y restos de especies marinas con métodos químicos y físicos. Asimismo,
 Ikoma et al., en el 2003, obtuvieron colágeno a partir de piel y escamas de Oreochromis
niloticus, ellos reportaron que la piel tiene un contenido de aminoácidos superior
(hidroxiprolina y prolina) que las escamas de dicha especie, los cuales están directamente
relacionados con el contenido de colágeno.

Figura 4. Colágeno de escamas de pescado solidificado a 4 °C.

El cálculo de proteína total muestra que los tres tratamientos están sobre 63%. Los resultados
obtenidos para el cálculo del total de proteínas se muestran en la Tabla 2.

El análisis del producto obtenido (colágeno), se realizó en base a pruebas fisicoquímicas, censo-
riales y de cuantificación de proteína total. El análisis de proteínas se realizó mediante el
método Kjeldahl (A.O.A.C., 2019), que es uno de los más utilizados para la determinación del
contenido proteico en grano, harinas, carnes, y en general, en materiales biológicos. Así lo
demuestra, Ramos (2018) en su trabajo sobre obtención y caracterización de colágeno a partir
de las escamas de pescados rojo y pardo.

Basado en los resultados de proteína por el método Kjeldahl, en la Tabla 2 se muestra que la
cantidad de proteínas es similar entre las especies de “cachema” y “bonito”, estos resultados
son similares a los publicados por Ramos (2018) que obtuvo colágeno de escamas de Lutjanus
campechanus (rojo) y Labrus bergylta (pardo), calculando por método de Kjeldahl el contenido
total de proteínas, fue de 60 % en las especies mencionadas. Esto probablemente se deba a
que la composición y la concentración de colágeno presente en las escamas de pescado, esté
relacionada directamente con la especie del cual provienen las escamas, la cantidad de
colágeno obtenido pueda variar de acuerdo al método de extracción. Aunque la mayoría de
estudios demuestran que la obtención de colágeno se hace con diversos métodos químicos,
descritos en los trabajos de investigadores como Serrano, 2011; Gómez et al., 2011; Wang et
al., 2013 y Ramos, 2018.

En el presente estudio se muestra que se obtuvo colágeno utilizando métodos físicos como
calor y temperatura; de este modo, se sometió a 100 °C y 500 g de escamas adicionándole 1
litro de agua, se obtuvo colágeno natural que se solidificó homogéneamente a 4 °C.

T1 T2 T3
Proteína (g/100g de
muestra original) 65% 63% 67%
(Factor 6,25)
Evaluación sensorial
0 0 0
de sabor
Evaluación sensorial
0 0 0
de textura
Evaluación sensorial
1 1 1
de aroma
Tabla 2. Resultados del contenido de proteína total (método de Kjeldahl) y evaluación sensorial
promedio del colágeno obtenido en los tres tratamientos

En el T3, se obtuvo el contenido más alto de proteína total (67%), esto probablemente a su alto
valor proteico, pues, se sabe que las escamas de pescado están compuestas por proteínas (81%
colágeno) y sales de calcio, además, la composición de estas estructuras se va constituyendo
más rígida según el tamaño de la especie ósea (Krishnan, et al., 2012).