1

INTRODUCCION
Los resultados de la fecundación in vitro (IVF) en el bovino están influenciados
por una serie de factores tales como; el laboratorio mismo, la experiencia de los
técnicos, la preparación de los gametos, la preparación de los medios de cultivos
etc. Tal vez una de las tareas más difíciles para aquel que recién comienza a
trabajar en IVF es encontrar las bases de “las recetas”. Después que esto se
aprende “comienzan las modificaciones” y cada grupo de trabajo hace las que
más le acomodan, sin embargo las “bases no cambian”. Pero no hay duda que lo
mejor es realizar un entrenamiento “hands on” en un laboratorio.... y practicar,
practicar y practicar.
Con el objeto de guiar a aquellos estudiantes hemos escrito nuestras Notas de
Laboratorio, que han sido aprendidas de otros laboratorios en los que hemos
trabajado y entre los que podemos mencionar los laboratorios de los Drs. T.
Greve y P. Hyttel en Dinamarca, Dr. A. Hanada en Japón, Dr. O. Ginther, Dr. N.
First y Dr. J. Parrish en USA, Dr. R. Mapletoft en Canadá y Dr. C. Barros en
Chile. Para ellos y para todos los profesores que nos han enseñado no solo
“técnicas” sino una filosofía de trabajo vayan nuestros mas grandes
agradecimientos.
Estas notas están escritas en orden cronológico en la primera parte se comenta
en forma general la metodología y la técnica de la IVF en bovinos, en la segunda
parte se entrega la forma de realizarla y en la tercera parte las “recetas” de las
soluciones y medios de cultivo y como se preparan los stocks. En el anexo se
entrega el material e items de laboratorio necesarios, instrumentos y
compuestos.

2
Estas notas solo servirán de guía de laboratorio y no pretenden enseñar IVF
como tal. Hay que tener presente que pasan de moda y a medida que pasa el
tiempo se descubren otras más eficientes. Es recomendable entones “escribir”
sus propios protocolos y mantenerlos actualizados.

BREVE HISTORIA
Han pasado más de 100 años que Hermann Fol, un Zoologista suizo, observó por
primera vez un espermatozoides penetrando a un ovum de estrella de mar y la
formación de la primera célula del futuro embrión (42). Las primeras
investigaciones se hicieron en especies de invertebrados marinos. La razón de
esto, es que la fecundación ocurre afuera de la hembra (en agua de mar), al
contrario de los mamíferos. Desde 1950, las técnicas de IVF han sido
desarrolladas y perfeccionadas de tal forma que el cultivo, la fecundación y el
desarrollo embrionario temprano se lleva a efecto in vitro. Esto ha permitido
estudiar y entender en mejor forma las interacciones ovum-espermatozoide en
los animales mamíferos (21, 23).
La naturaleza de los mecanismos y la secuencia de los cambios que ocurren a
nivel molecular en la fecundación, también han sido investigados, especialmente
en algunas especies de laboratorio, pero relativamente poco se sabe en animales
domésticos de granja.
La primera cría nacida por IVF fue reportada en el conejo en 1959 (11) y en
1968 en la ratón de laboratorio (43). En 1977, se obtuvo la primera IVF en el
bovino, con semen capacitado en el oviducto o en el útero de la vaca o útero de
la coneja (28). Cuatro años más tarde se reportó la primera cría nacida a través
de transferencia, de un embrión de 4 células en el oviducto de una vaca . En
este caso, los ovocitos fueron madurados in vivo, y la fecundación se realizó in
vitro con semen capacitado con una solución con alta concentración iónica (5). El
primer ternero resultado de un ovocito madurado in vitro y fecundado in vitro
nació en 1986 después que el embrión fue cultivado en el oviducto de una oveja
por 5 días (9). Sin embargo, los primeros terneros nacidos de ovocitos
madurados in vitro (IVM), fecundados in vitro (IVF) y cultivados (desarrollo
temprano) in vitro (IVC) se reportó en 1987 (22).

3
TECNICA Y METODOLOGIA DE LA FECUNDACION IN VITRO EN
EL BOVINO
Para llevar a cabo la IVF en el bovino se necesita realizar varios pasos los que
comprenden: Recuperación de los complejos cumulus ovocitos (COC) de los
ovarios, ya sea de especímenes colectados en el matadero o recuperados de
hembras vivas.
Maduración y fecundación de los COC's ya sea con semen fresco o
congelado/descongelado y, por último, producción de cigotos los cuales son
cultivados por un período corto de tiempo (7-9 días) para su desarrollo. Los
embriones así producidos pueden ser transferidos inmediatamente a receptoras,
congelados o destinados a otros propósito.
Hay que distinguir que en la técnica de IVF desarrollada rutinariamente en los
laboratorios de investigación se usan ovarios (para la recuperación de ovocitos)
de hembras que han sido faenadas en el matadero, que no tienen prácticamente
ningún valor genético. Por supuesto, en programas reproductivos, estos
embriones producidos in Vitro provienen de hembras de alto valor genético..
Cada etapa nombrada anteriormente, precisa de mecanismos de los cuales aún
muchos de ellos no han sido completamente determinados. Por ejemplo, los
mecanismos intrínsecos de la maduración de los ovocitos, la capacitación
espermática y la reacción del acrosoma son alguno de estos eventos en los
cuales se necesita mayor investigación para que la técnica de IVF pueda ser
repetible y sin gran variación (en lo que se refiere a producción de embriones).

RECUPERACION DE LOS COMPLEJOS CUMULUS-OVOCITOS

(COCs)
Existen diferentes técnicas de recuperación de COCs según se trate de material
de matadero o de hembras vivas.
De material de matadero:
a. Aspiración del líquido folicular (folículos 2 < 6 mm)
b. Desmenuzamiento del ovario (folículos < 2 mm)
De hembras vivas:
a. Aspiración con aguja y ultrasonografía
b. Aspiración con aguja y endoscopía

4
c. Laparatomía (usada solo en casos muy especiales)
De material de matadero
Los ovarios, colectados de hembras faenadas son transportados en termos que
contienen suero salino (35o±2 C). La aspiración de los ovocitos, se realiza
aproximadamente dentro de 4 a 6 h después de faenado los animales. A menudo
la aspiración de los ovocitos se hace utilizando una jeringa de 10 ml y una aguja
de 18 g x 11/2 pulgadas. Todos los folículos que no presentan indicios de atresia
folicular, entre 2 y 6 mm de diámetro, son aspirados (29, 32). También se puede
utilizar una pequeña maquinita de aspiración. La recuperación es moderada y la
"calidad" (capacidad de los ovocitos de completar la meiosis) es "buena" si se
compara con la técnica de desmenuzamiento (con una hoja de afeitar, se corta la
superficie del ovario) en la cual la recuperación es alta, pero la calidad de los
ovocitos es baja. Esto se debe más que nada a que se recuperan ovocitos de
folículos muy pequeños no antrales que no han alcanzado el tamaño adecuado
para ser madurados in vitro (38). Tal vez en el futuro con nuevos medios de
cultivo y con mayores conocimientos acerca de las necesidades de estos ovocitos
estos podrán ser madurados en cultivos in vitro.
De hembras vivas
Las técnicas de recuperación in vivo se han desarrollado ultimamente y no
obstante la "calidad" de los COCs recuperados de folículos de tamaño mediano y
grande (>5 mm)
es muy buena, el número que se recupera es bastante menor que con las
técnicas mencionadas anteriormente.

5
Con o sin tratamientos de superestimulación
a. Impúberes
b. Púberes -. No preñadas
-. Preñadas
Los COCs pueden ser recuperados de hembras impúberes o púberes (6, 19) en
cualquier estadio del ciclo estral, con o sin tratamientos hormonales
(superestimulación, 40). En este sentido es importante señalar que la posibilidad
de recuperar embriones de hembras impúberes y de vacas preñadas sin producir
un efecto adverso en la preñez, abre un nuevo campo tanto para la investigación
como para la industria de la transferencia de embriones. Pocos años atrás nadie
hubiera imaginado obtener crías de vacas gestantes, sin embargo, la
recuperación de ovocitos in vivo y la producción de embriones in vitro de vacas
gestantes superestimuladas, al menos en el primer tercio de la preñez, ya ha
sido indicada (33). Es conocido el hecho que las terneritas a partir de las 2
semanas de edad ya presentan ondas foliculares. Por lo tanto, a esta edad
teoricamente, ya podrían dar origen a una cría si esos ovocitos fueran
recuperados, madurados (in vitro o in vivo), inseminados y cultivados in vitro
hasta blastocistos y posteriormente transferidos a una hembra receptora (41).

CLASIFICACION Y EVALUACION DE LOS COC

La mayoría de los laboratorios siguen la clasificación de Liebfried y First (30).
Estos autores, hacen una descripción de los COC y los categorizan de acuerdo a
la morfología de las células del cumulus oophorus y a las características del
ovoplasma (Tabla 1).

6
TABLA 1. ESQUEMA DE CLASIFICACION PARA EVALUAR LAS
ESTRUCTURAS DE LOS OVOCITOS DE BOVINOS

7
De acuerdo a nuestra experiencia es bastante difícil seguir una regla fija en lo
que se refiere a la clasificación morfológica bajo un microscopio estereoscópico,
ya que por un lado, hay una gran variabilidad estre los COCs y, por otro, la
cantidad de COCs que un técnico debe manipular hace casi imposible
categorizarlos adecuadamente. Se ha indicado que un cumulus expandido es una
buena indicación de que el ovocito ha alcanzado su maduración. Esto es posible
observarlo bajo el microscopio estereoscópico. Sin embargo, también se ha
reportado que algunos COCs recuperados de vacas superestimuladas
hormonalmente que presentaban las células del cumulus expandida no habían
completado la meiosis (13, 25, 26) y COCs que presentaban las células del
cumulus compactas después de cultivados in vitro por 24 h, habían resumido la
meiosis (observación personal). Estos dos ejemplos indican claramente que una
clasificación de los COCs basada solamente en la parte morfológica es
insuficiente.
Para los COCs de equinos y camélidos Sud Americanos, la clasificación del
ovoplasma que se aplica a los ovocitos bovinos, no debería ser usada puesto que
el ovoplasma de los ovocitos en estas especies es bastante oscuro,
presentándose en forma homogénea o heterogénea granular. Un ovocito equino
"bueno" (para IVF) muestra un ovoplasma condensado homogéneo, condensado
o heterogéneo el cual es muy difícil de evaluar debido al cumulus oophorus que
lo rodea (14, 15). En cuanto a los COCs de llamas (Lama glama) y alpacas
(Lama pacos) el ovoplasma es también oscuro y muchas veces presenta
vacuolas de apariencia obscura de diferentes tamaños, cuya función es
desconocida (16).

MADURACION IN VITRO (IVM)

La maduración del ovocito in vitro que incluye la maduración nuclear y
citoplasmática fue reportada en 1965 en diferentes especies (9, 20). Como es
sabido, la meiosis permanece detenida en los ovocitos que se encuentran en los
folículos hasta que estos son expuestos a gonadotrofinas que permiten la
continuación de la meiosis. La meiosis in vivo es detenida por sustancias
foliculares que aún no están bien definidas. Sin embargo, los COC que son
removidos desde los folículos, comienzan la meiosis espontáneamente (Tabla 2).

8
En el proceso de maduración in vivo de los ovocitos, intervienen la hormona
folículo estimulante (FSH) que interviene en el crecimiento folicular, la hormona
luteinizante (LH) que induce la maduración final y la ovulación del ovocito
seleccionado (12, 38, 44). Varios autores han indicado que para que el proceso
de maduración se lleve a cabo debe existir un balance hormonal en el folículo
(particularmente de los esteroides (25). En un sistema in vitro, este balance
natural es imitado agregando las hormonas folículo estimulante (FSH), LH y
estradiol 17ß al medio de maduración (TCM-199). En algunos laboratorios la
adición directa de estas hormonas ha sido substituida agregando suero de vacas
en estro (ECS). Este suero es suficiente para producir maduración (nuclear y
citoplasmática), expansión de las células del cumulus y futuro desarrollo del
cigoto.
Generalmente, los COC son madurados en placas petri, en gotas (10 COC/ 50 uL
de medio) de medio de maduración cubiertas con 10 mL de aceite mineral. Estas
placas son colocadas en una estufa de cultivo en una atmósfera que contiene 5%
CO2, 39o C y 95% humedad, por 24 h.

9
Una vez madurados los COC, éstos son lavados (TALP-HEPES) y colocados en
gotas (10 COC / 50 µl de medio de fecundación). A este medio, conocido como
FERTTALP modificado, se le agrega heparina para la capacitación espermática,
penicilaminahypotaurina- epinefrina (PHE) y una concentración de
espermatozoides conocida de acuerdo al reproductor que se esta utilizando. Los
COC se mantienen en co-cultivo con los espermatozoides por 6 a 18 h.
La técnica más usada actualmente para producir la capacitación espermática de
espermatozoides de toro, es la incubación de éstos con bajas concentraciones de
heparina (entre 2-5 ug/mL; 35, 36). Para lo cual, el semen es lavado
previamente para eliminar el líquido seminal o diluyente y obtener un pellet
solamente con espermatozoides en su gran mayoría viables. Hay diferentes
técnicas de lavado de semen. Quizás una de las más populares y simples es la
separación de los espermatozoides con el método de "swim-up" y su lavado
posterior por centrifugación. Esta técnica permite que los espermatozoides más
móviles “naden hacia arriba”. Otras técnicas usadas rutinariamente en los
laboratorios de IVF son la separación y lavado de semen a través de una
gradiente de densidad discontinua de PERCOLL (solución de 2 mL 90% y 2 mL
45%), o de una columna de lana de vidrio o simplemente el lavado por
centrifugación repetida.
La concentración de espermatozoides más frecuente utilizada fluctúa entre 1-
2x106 espermatozoides/mL, dependiendo por cierto de la “calidad fecundante”

10
de los espermatozoides del toro. Existen variaciones en cuanto a la capacitación
espermática in vitro, entre los toros y en el mismo toro en diferentes eyaculados.
Por lo tanto, previo a usar un toro, se hace necesario examinar su capacidad
fecundante in vitro. Un diseño experimental de trabajo útil es el que se indica a
continuación (Tabla 3). En este ejemplo se utilizan 2 toros, con 2
concentraciones de espermatozoides y 3 concentraciones de heparina. (50
ovocitos por grupo es suficiente, 2 a 3 replicas).

DESARROLLO IN VITRO (IVC)

Una vez concluido el co-cultivado (ovocitos-espermatozoides), los ovocitos son
lavados (TALP-HEPES) y posteriormente cambiados al medio de desarrollo que
consiste en un medio químicamente definido o un medio de cultivo celular, ya
sea usando células de la granulosa, o células epiteliales del oviducto. Así en esta
forma se pasa el bloqueo celular que ocurre en los cigotos bovinos entre las 8 a
16 células.
En el caso de co-cultivo, los cigotos son co-cultivados en TCM 199
adicionado con 10% de suero fetal más células del oviducto (15 - 20 cigotos /
100 µl de medio). Las placas son mantenidas por 7 a 9 días en una estufa de

11
cultivo con 5% CO2, 39o C y 95% humedad, para la producción de blastocistos
(17, Tabla 4).

No existe una clasificación para evaluar embriones producidos in vitro, como la

existente para embriones in vivo. Sin embargo, la experiencia indica que estos
blastocistos son probablemente más sensibles.

12
13
14
USOS PRACTICOS DE LA IVF

Hasta ahora el uso mayor que ha tenido la IVF es en investigación, no solo para
estudiar los mecanismos básicos que ocurren en la reproducción animal, sino
para tener una fuente de producción de embriones que pueden ser utilizados en
otro tipo de investigación tales como criopreservación, o en ingeniería genética
para la inyección de genes, clonaje, sexaje, etc (2, 3, 10).
Algo interesante que se ha sido indicado, es el hecho, que aquellos embriones
producidos por IVM/IVF/IVC que alcanzan un desarrollo más rápido al día 7-8,
son machos y aquellos que presentan un estado de desarrollo menor son
hembras (1, 8). Sin embargo, en estudios in vivo la relación macho hembra es
practicamente 50:50. El estudio de este fenómeno es de gran interés científico.
También la IVF tiene una gran aplicación en la obtención de embriones de razas
criollas, de animales en extinción, de especies de zoológico (18, 31). Muchas de
las técnicas aplicadas en especies de laboratorio sirven de modelo para la
aplicación en la especie humana.

15
Seguramente usando IVM/IVF se podrá correlacionar la capacidad de
fecundación de un eyaculado in vitro con la capacidad que tiene in vivo, antes de
ser usado en programas reproductivos con un alto costo (37).
Los embriones producidos a través de IVM/IVF/IVC son de gran valor para
estudiar la transmisión de enfermedades a través de los gametos (4). Esto se
debe al costo menor que representa producir embriones con esta tecnología que
usando la superovulación ya la recuperación desde hembras donantes Animales
con problemas clínicos de infertilidad, tienen la posibilidad de entrar en un
programa de IVF. Por ejemplo, en vacas con problemas crónicos del útero u
oviductos, sus ovocitos pueden ser colectados usando ultrasonografía y una
aguja a través de la vagina. Estos animales pueden ser colectados
repetidamente durante sus ciclos estrales sin ningún tratamiento o utilizando
algún tratamiento de superestimulación. Laparascopía es otra alternativa sobre
todo en mamíferos pequeños donde la ultrasonografía es un problema. Los
ovocitos colectados de estos animales pueden ser inseminados con semen
proveniente de diferentes toros en un corto período de tiempo y los embriones
producidos pueden ser transferidos inmediatamente o congelados para ser
usados en futuras transferencias. Tal vez en este momento el costo de la técnica
la hace poco práctica, pero en el futuro posiblemente será usada rutinariamente
como es hoy día la transferencia de embriones producidos in vivo.
Otra forma de fecundación es la fecundación en el oviducto de ovocitos
madurados in vitro (GIFT) o madurados in vivo (27,34). Esta técnica es usada en
humanos y también se ha realizado con éxito en la yegua, donde la IVF no ha
sido tan bien desarrollada aún (14). En este caso se puede usar la misma
donante como receptora de sus propios ovocitos u otra hembra como receptora.
La alternativa de recuperar ovocitos de terneritas impúberes o de vacas
preñadas, como ya ha sido comentado anteriormente, abre un nuevo campo en
la reproducción animal (6).
Tal vez hoy día esta biotecnología se ve como algo utópico de llevarla a
cabo en programas reproductivos a nivel de finca, especialmente en los países
Latino Americanos, sin embargo la alternativa de realizarla en casos especiales
de infertilidad o en hembras de alto valor existe, de hecho ya existen centros
comerciales ofreciendo esta tecnología al ganadero (24). Uno de estos
programas es en la producción de mellizos con embriones producidos a bajo

16
costo de ovocitos recuperados del matadero. Estos programas han sido usados
en Irlanda. La recuperación de ovocitos de razas bovinas criollas, también se ha
intentado en Italia y Japón. En un futuro cercano la IVF complementará las otras
biotecnologías tales como la transferencia de embriones, la congelación, el
sexage etc. La potencialidad que presenta es biotecnología es realmente
incalculable.

ORGANIZACIÓN MANIPULACION DE LOS OVARIOS Y COLECCION DE

LOS COC
A. En el matadero, junte los ovarios en un termo con suero salino a 37º C . En el
laboratorio, retire los ovarios del termo y lávelos con agua corriente a 37º C una
vez y luego enjuáguelos 3 veces con suero salino a 37º C.
B. Mantenga los ovarios durante todo el tiempo con suero salino tibio.
C. Aspire los COC desde los folículos ováricos y coloque el fluido folicular en un
tubo de centrifuga de 50 mL, manteniéndolo durante todo el tiempo a 37º C.
D. Deje decantar por 10 min y luego aspire el sobrenadante y examine bajo el
estereoscopio en una placa Petri (Falcon 1029) ojalá cuadriculada.

LAVADO Y SELECCION DE LOS COC

A. Prepare 3 placas Petri (Falcon 1008) con TALP-HEPES solución de trabajo y
manténgales a temperatura de laboratorio o sobre una platina temperada. Cuide
de que no se evapore el medio.
B. Junte todos los COC en una placa con TALP-HEPES y selecciónelos de acuerdo
a la clasificación indicada en el texto.
C. Lave los COC 3 veces en TALP-HEPES

PREPARACION DE LAS GOTAS DE MADURACION (IVM)

A. Haga gotas de 50 µL de medio de maduración (TCM-199 Earle´s salts+ suero
fetal + piruvato + FSH, LH, Estradiol 17B) en una placa Petri (60 x 10 Falcon
1007).
B. Cubra con 10 mL de aceite mineral, previamente equilibrado (para tal efecto
mantenga el aceite en el incubador diariamente con la tapa suelta).

17
C. Coloque las placas de maduración en el incubador al menos por 2 horas antes
de colocar los COC para que se equilibre (temperatura y atmósfera de gases).
D. Coloque los COC previamente lavados (TALP-HEPES solución de trabajo) y
seleccionados (ovoplasma y cumulus) en número de 10 por gota y vuelva la
placa al incubador tan pronto le sea posible.
E. Cultive los COC por 22-24 horas en estas condiciones. No abra la puerta del
incubador si no es estrictamente necesario.
F. Después de este tiempo junte todos los COC en una placa con TALP-HEPES y
desnúdelos de su granulosa, ya sea pasándolos varias veces por una pipeta
Pasteur previamente preparada (lumen angosto) o colocándolos en un tubo
eppindorff de 1mL y agitándolos en el Vortex por 3 minutos.
G. Recupere los ovocitos y lávelos 3 veces con TALP-HEPES antes de colocarlos
en las gotas de fecundación, para eliminar residuos de glucosa que afectan el
efecto de la heparina.

ALTERNATIVA
A. Lave los COC y selecciónelos.
B. Coloque 60 a 200 COC en una placa Petri de 35 mm conteniendo 2.5 mL de
Medio de maduración.
C. Cubra el medio con aceite mineral y cultívelos por 22-24 horas También
puede usar una placa Nunclon (176740) o similar en este caso puede obviar el
aceite.

PREPARACION DE GOTAS DE FECUNDACION (IVF)

A. Haga gotas de 44 uL de medio de fecundación (FERT TALP) en una placa Petri
(60 x 10 Falcon 1007).
B. Cubra con 10 mL de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto
mantenga el aceite en el incubador durante todo el tiempo con la tapa suelta).
C. Coloque las placas en el incubador al menos por 2 horas antes de colocar los
COC para que se equilibre (temperatura y atmósfera gases).
D. Coloque los ovocitos previamente lavados y desnudos sin su cumulus (TALP-
HEPES solución de trabajo) y en número de 10 por gota y vuelva la placa al
incubador tan pronto le sea posible.

18
E. Coloque dentro de la gota 2 µL de (Penicilamina/ Hipotaurina/ Epinefrina,
PHE), 2 µL de Heparina (en la concentración adecuada, generalmente 2 a 5
ug/mL) y finalmente 2 µL de la solución con los espermatozoides previamente
preparados (en la concentración adecuada, generalmente 1x106
espermatozoides/mL).
F. Co-cultive los ovocitos/espermatozoides por 8 a 18 horas en estas
condiciones. No abra la puerta del incubador si no es estrictamente necesario.
H. Recupere los ovocitos y colóquelos en TALP-HEPES luego elimine los
espermatozoides adheridos a la zona pelucida, ya sea pasándolos varias veces
por una pipeta Pasteur previamente preparada (lumen angosto) o colocándolos
en un tubo eppindorff de 1mL con un mínimo de TALP-HEPES y agitándolos en el
Vortex por 1-3 segundos.
I. Lave los cigotos 3 veces con TALP-HEPES antes de colocarlos en las gotas de
cultivo.

ALTERNATIVA
A. Después de lavado los ovocitos transfiéralos con un mínimo de TALP-HEPES
(20 µL o menos) a un pocillo (Nunclon 176740) previamente preparado con 425
µL de medio de fecundación (FERT-TALP).
B. Agregue 20 µL de PHE y 20 µL de la suspensión espermática a cada pocillo y
mezcle suavemente con la pipeta.
C. Incube por 8 a 18 hr. Aproximadamente a 39º C, 5% CO2 en una atmósfera
con alta humedad.

PREPARACION DE GOTAS DE DESARROLLO (IVC)

A. Haga gotas de 100 µL en una placa Petri (60 x 10 Falcon 1007) usando Medio
de Desarrollo Condicionado y TCM-199 Earle´s salts con 10% suero fetal en una
proporción de 1:1.
B. Mantenga el TCM en el incubador al menos 2 horas antes de preparar el
cultivo para que se equilibre (temperatura y mezcla de gas).
C. Cubra con 10 mL de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto
mantenga el aceite en el incubador diariamente con la tapa suelta).

19
D. Agregue 0,8 a 1 µL de la suspención BOEC por gota. Transfiera los cigotos
(15-20 por gota).
Vuelva la placa rápidamente al incubador. No abra la puerta del incubador si no
es estrictamente necesario.
D. Determine el desarrollo embrionario cuando le sea necesario y agregue cada
48 h el medio TCM:Medio condicionado previamente preparado y guardado en
incubador durante el tiempo que dure el cultivo.

ALTERNATIVA
PREPARACION DE LAS GOTAS DE DESARROLLO USANDO MEDIO SOFT
A. Haga gotas de 100 uL de medio de SOFT en una placa Petri (60 x 10 Falcon
1007).
B. Cubra con 10 mL de aceite mineral, previamente equilibrado (Para tal efecto
mantenga el aceite en el incubador durante todo el tiempo con la tapa suelta).
C. Coloque las placas en el incubador al menos por 2 horas antes los cigotos
para que se equilibre (temperatura y mezcla de gas). Cultive bajo una atmósfera
de 5% O2, 5% CO2, 90% N2 y humedad. Si usa una atmósfera solo con 5%
CO2 añada 50 uM de Cisteína (Bmercaptenoletilenamina, Sigma) y renueve el
medio cada 3 días.
D. Agregue a las 48 h 10% de suero fetal.

20
21
MADURACION DE LOS COC (IVM)
MEDIO DE MADURACION
TCM-199 Earle´s salts Disuelva en 1 Lt de DD-agua y agregue 2.2 gr de
Bicarbonato de Sodio.
Filtre con filtros 0.22 um y guarde en botellas de vidrio.

22
PREPARACION DE LOS ESPERMATOZOIDES
Se pueden usar diferentes fuentes de semen para la IVF (fresco, congelado
epididimal). Sin embargo, comúnmente se usa semen congelado. Debido a la
variación entre los toros y los eyaculados del mismo toro debe tenerse cuidado al
preparar los espermatozoa para IVF. Existen variados procedimientos para la
preparación del semen, sin embargo el mas común es el método de SWIM-UP o
la GRADIENTE DE PERCOLL.
SWIM-UP
A. Prepare 4 tubos de 1.8 mL de capacidad con 1 mL de SPERM-TALP. Colóquelo
dentro del incubador (5% CO2, 39oC, alta humedad atmosférica) con la tapa
suelta por 1 hr.
B. Descongele 2-4 pajuelas (35o C 30 seg.) y júntelas en un tubo. Observe una
muestra (aprox. 10 µL).
C. Deposite cuidadosamente en el fondo de cada tubo con SPERM-TALP 250 µL
de semen (1 pajuela).
D. Mantenga los tubos a 39º C por 1 hora, para permitir a los espermatozoides
nadar hacia arriba (swim up).
E. Retire cuidadosamente 800 µL aproximadamente del sobrenadante de cada
tubo y júntelos en un tubo de 15 mL. Descarte los 200 µL del fondo del tubo
F. Centrifugue a 1000 rpm/10 min G. Descarte el sobrenadante y deje
aproximadamente 400 µL del fondo H. Re-suspenda el pellet si es necesario
agregando 4 mL SPERM-TALP y centrifugüelos nuevamente. Deje 200 µL del
fondo.

23
I. Determine la motilidad y la concentración y ajuste la concentración a 25X106
para obtener una concentración final por mL de 1x106 epermatozoides/mL.
J. Agregue de esta suspensión 2 µL a las gotas de fecundación previamente
preparadas.

24
Disuelva: el compuesto en la cantidad de DD-agua deseada (50 o 100 mL) y
mezcle bien.
Filtre: con filtros 0,22um o esterilice en autoclave.
Mantenga: las soluciones refrigeradas indefinidamente y bien tapadas, para
evitar evaporación.

PERCOLL SOLUCION STOCK 90%. No use albúmina.

A. Coloque en un frasco estéril 45 mL de Percoll y agregue 5 mL de SPERM-TALP

10X. No intente filtrarla
B Mantenga la solución refrigerada y bien tapada. Saque la cantidad necesaria el
día de su uso y vuélvala a guardar inmediatamente.
PERCOLL SOLUCION DE TRABAJO
El día de su uso suplemente con:
SOLUCION DE PERCOLL 90%
Prepare al mismo tiempo las soluciones de 90% Percoll y SPERM-TALP 1X.
A. Coloque en un tubo estéril la cantidad de SOLUCION DE PERCOLL 90% (stock)
deseada (ejemplo 5, 10, 20, 50mL) y entonces agregue los compuestos (stocks)
de acuerdo a lo que desee preparar.

25
SOLUCION 1X DE SPERM TALP
A. Coloque en un tubo estéril la cantidad de DD-agua deseada (4,5 –20 mL, etc).
B. Agregue la Solución SPERM-TALP 10X (stock).
C. Agregue las soluciones stocks que se indican en la cantidad de DD-agua que
desee preparar (ejemplo: 5 a 50 mL).

PERCOLL 45%
A. Prepare una solución 1:1 de la solución de PERCOLL de 90% y de SPERM TALP
1X modificada. Agregando, por ejemplo, para la preparación de un tubo, 2 mL de
PERCOLL 90% y 2 mL de la solución de SPERM-TALP 1X. Mezcle bien y mantenga
tapada.
COLUMNA DE PERCOLL
Una buena practica es agregar aproximadamente 3 uL de colorante de alimentos
a las soluciones de Percoll. Esto permite visualizar las columnas después de ser
preparadas.
A. Coloque 2 mL de PERCOLL 90% en el fondo de un tubo cónico de centrifuga
(Falcon 2095).
Agregue cuidadosamente 2 mL de PERCOLL 45% sobre la superficie del PERCOLL
90%.
Asegúrese que las soluciones estén a temperatura ambiente antes de colocar el
semen.
B. Descongele 2-3 pajuelas de semen y mézclelas y colóquelas sobre la
superficie de la columna de PERCOLL previamente preparada
C. Centrifugue la muestra a 700 x g (aprox. 2100 rpm) entre 15 a 30 minutos.
E. Descarte el sobrenadante inmediatamente después que la centrifuga se haya
detenido (las dos capas superiores) dejando solamente el pellet formado por los

26
espermatozoides. Sea extremadamente cuidadoso cuando remueva las
soluciones de PERCOLL. Note que el pellet formado no debe estar firmemente
formado.
E. Diluya el pellet si es necesario agregando SPERM-TALP 1X y determine la
motilidad y la concentración. Ajuste a 25 x 106 en el caso de usar una
concentración final de 1x10 6 espermatozoides/mL).
F. Agregue de esta suspensión 2 uL a las gotas de fecundación previamente
preparadas.

MEDIOS QUIMICAMENTE DEFINIDOS PARA EL CULTIVO DE CIGOTOS

MEDIO FLUIDO OVIDUCTAL SINTETICO STOCK (SOF; Tervit y col., 1972)

27
PREPARACION DE LAS CELULAS EPITELIALES DEL OVIDUCTO DEL
BOVINO
(BOEC)
LAVADO DE LOS BOEC
TCM-199 Earle´s salts
Agregue 1% suero fetal
Filtre con filtros 0.22 um y guarde en botellas de vidrio en incubador para su
equilibrio (al menos por 2 horas).
CULTIVO DE LOS BOEC
TCM-199 Earle´s salts
Agregue 10 % suero fetal
Mezcle 1:1 con Medio Condicionado
Filtre con filtros 0.22 um y guarde y mantenga en botellas de vidrio en incubador
para su equilibrio.

A. Separe los oviductos del resto del tracto reproductivo y colóquelos en bolsitas
plásticas sobre hielo y manténgalos en termos para el transporte al laboratorio.

28
B. Disecte los oviductos y retire la grasa y tejido sobrante.
C. Corte transversalmente ambos extremos y con un cubreobjeto presione la
superficie exterior del oviducto hacia el extremo del infundibulum.
D. Coloque la “masa de lombrises” (“worms”=BOEC) en un tubo de centrifuga de
15 mL.
E. Lave las BOEC en 10 mL de TCM-199 más 1% suero fetal (también se puede
usar TALPHEPES solución de trabajo) por 5 veces dejando decantar 5 min cada
vez y descartando el sobrenadante.
F. Finalmente deje 200 uL de pellet (BOEC) y transfiéralos a una placa de cultivo
(Falcon 25 cm2) conteniendo 10 mL de medio de cultivo (TCM-10% suero fetal)
previamente preparado.
G. Cultive por 24 o 48 hr a 39º C, 5% CO2 en aire y alta humedad.
H. Pasado este período de tiempo coloque el resto del medio y los “racimos” de
BOEC en un tubo de centrifuga de 15 mL y deje decantar por 5 min.
I. Retire el sobrenadante (futuro medio condicionado) y centrifugelo a 3000 rpm
por 10 min.
Para remover el debri celular.
J. Al mismo tiempo resuspenda en TCM-10% suero fetal el pellet de BOEC y
dejelo decantar por 5 min. Repita esta operación una vez más descartando el
sobrenadante y dejando el pellet de BOEC en el fondo del tubo.
K. De este pellet (resuspendido en 1 mL de TCM-10% suero fetal) agregue 1 uL
a cada gota de fecundación. Nota las gotas de fecundación se preparan usando
50% de medio condicionado y 50% medio TCM-10 suero fetal (1:1) previamente
filtrado (0,22 um).

29
STOCKS
Antibióticos para todos los medios:
Sulfato de Gentamicina

30
50mg/ mL disolver en suero salino. Alicuote y guarde -70o C. Puede volver a
congelar y descongelar varias veces.
Penicilina/estreptomicina
Concentración final en el medio: 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/mL de
estreptomicina
Para la recuperación y lavado de los ovarios:
Suero salino
Disuelva 9 gr de NaCl en 1 Lt de DD-agua
Filtre y guarde en botellas esteríles
Solución de trabajo
Agregue 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina
Para el lavado de los COC:
TALP-HEPES
(ver más arriba)
Fosfato Buffer Salino –PBS solución stock
Disuelva en 700 mL de DD-agua todas las sales menos el ClCa y ClMg
Disuelva en 200 mL de DD-agua las sales de Ca y Mg
Agregue lentamente la solución que contiene las sales de Ca y Mg a los 700 mL
que contienen el resto de las sales Agite suavemente.
Enrase a 1000 mL.
Solución de trabajo
Agregue 100 UI/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina
Albúmina bovina (BSA fracción V) 1 mg/mL
Filtre y use en el día
Para el Medio de Maduración
Medio TCM
TCM 199 Earle's salts
Agregue 2,2 gr/lt de Bicarbonato de sodio. Prepárelo con DD-agua. Guarde
refrigerado en frascos de 100 mL o 500 mL de acuerdo a la necesidad de uso.
Foltropin (Vetrepharm) Diluya todo el frasco en 20 mL de TCM-199. Alicuote.
Guarde a -70o C. Descarte el sobrante después de usar.
Solución de trabajo
Agregue 20 uL en 10 mL de medio de maduración.
Estradiol 17 B

31
1 mg/mL disolver en etanol.
Guarde a -70o C. Esta solución puede re-usarse varias veces.
Piruvato de sodio
22 mg/10 mL disolver en suero salino.
Alicuote y guarde a -70o C. No vuelva a congelar el sobrante.
Para el Medio de Inseminación
Capacitación espermática
Heparina (100.000 Unidades)
181 unidades USP/mg (anhídrica) 0,25 mg/mL
Pese 5 mg y dilúyalos en 20 mL de suero salino. Solución A: 10 ug/mL
Tome 2 mL de la sol. A y agregue 2 mL de suero salino. Sol. B: 5 ug/mL
Tome 2 mL de la sol. B y agregue 2 mL de suero salino. Sol C: 2,5 ug/mL
Para preparar una sol. de 2 ug/mL de heparina diluya la solución A 5 veces (1
mL sol. A
mas 4 mL suero salino). Alicuotela y guarde a -70o C. 100
Penicilamina/Hipotaurina/Epinefrina – PHE
Penicilamina
2mM, Pesar 3 mg y disolver en 10 mL solución salina (NaCl 0,9%)
Alicuotar y congelar a –70º C. Prepare 50 mL
Hipotaurina
1 mM, Pesar 1,09 mg y disolver en 10 mL de solución salina (NaCl 0,9%)
Alicuotar y congelar a –70º C. Prepare 100 mL
Epinefrina (Adrenalina)
250 mM, Pesar 50 mg de Metabisulfato de Sodio y disolver en 50 mL de DD-agua
Agregar 127 uL de DL-lactato de Sodio (60%)
Acidificar a pH 4,0 con ácido clorhidríco
A 40 mL de esta solución agregue 1.83 mg epinefrina.
Debido a la cantidad pequeña de epinefrina mejor preparar mayor cantidad (a
200 mL de solución
agregar 9,15 mg de epinefrina)

32
Agregue las soluciones en la cantidad que requiera (ejemplo, para 1,4 o 10 mL)
Trabajar con poca luz ya que la epinefrina es sensible a la luz Alicuotar en
cantidades de 50 uL o de acuerdo a la necesidad y congelar a – 70º C Guardar
por más de 2 semanas Individualmente las soluciones de Penicilamina y la
Hipotaurina, como se indicó, se pueden guardar como stocks y volver a re-usar
cuando se prepare nuevamente PHE.
Para el Montaje
Mezcla de cera y vaselina
Relación 1:3. Para mezclar use calor. Guarde a temperatura ambiente. Cambie
esta relación de acuerdo a la temperatura del laboratorio, hasta encontrar la
relación que mas le acomode. Guárdela en jeringas de 5 mL
Para la Fijación
Acido acético:etanol
Relación 1:3. Prepare al momento de usar.
Para la Tinción
Tinción de orceina
1% peso/volumen 101
Disuelva la orceina (1 gr) en 40 mL de ácido acético
Hiérvala inmediatamente y revuélvala constantemente
Enfríela y agregue 55 mL de DD H2O
Guarde a 4o C
Para la Conservación
Acido acético:Glicerol : DDH2O
20 mL : 20 mL : 60 mL
Para eliminar las Células de Cumulus
Hialuronidasa
1 mg/mL disuelva en TALP-HEPES. Prepare al momento de usar.
Suero salino (0,9%)

33
9 gr. de NaCl en 1000 mL de DD H2O. Guarde a temperatura ambiente o
refrigerada
MONTAJE, FIJACION Y TINCION DE OVOCITOS
MONTAJE Y FIJACION
A. Prepare los portaobjetos apropiadamente limpiándolos e identificándolos.
Coloque la mezcla de cera/parafina (anexo) en los extremos de los cubreobjetos.
B. Retire los COC de las gotas, colóquelos en un medio de cultivo limpio y
posteriormente tómelos con muy poco medio y deposítelos sobre el portaobjeto.
Retire el exceso de medio (hasta que los ovocitos formen una "sombra"). Las
células del cumulus que rodean al ovocito deben ser removidas antes de fijarlos.
C. Coloque el portaobjeto rápidamente sobre los ovocitos y presione suavemente
hasta que el medio haga contacto con el cubreobjeto. Cuidadosamente continúe
presionando cada extremo del cubreobjeto hasta obtener una buena presión
sobre los ovocitos teniendo cuidado de no reventarlos.
D. Ponga rápidamente una pequeña gota de goma de pegar anexo) en dos
extremos. Téngase presente que muchas gomas de pegar se destruyen con la
mezcla ácido acético:alcohol (anexo) o puede encogerse destruyendo los
ovocitos.
E. Coloque los portaobjetos en la mezcla de ácido acético:alcohol al menos por
24 horas.
TINCION
A. Retire el portaobjeto del fijador. Séquelo moderadamente con papel
absorbente cuidando de no presionar el cubreobjeto.
B. Coloque 3 a 4 gotas de una solución de orceina y ácido acético en uno de los
bordes del cubreobjeto. Haga esta operación bajo el estereoscopio, para impedir
la pérdida de ovocitos que no han quedado bien aprisionados. Si es necesario
use papel absorbente en el borde que sea necesario, para reorganizar a los
ovocitos.
C. Observe las muestras usando un microscopio de fase contrastada. Use un
aumento bajo (4x) y ubique la posición de los ovocitos. Esto impedirá la lectura
del mismo ovocito. Observe con aumento de 20 x o 40 x.
D. Si es necesario aclare la tinción agregando una solución de ácido
acético:glicerina:alcohol (anexo). Usando esta mezcla se puede guardar la

34
preparación por varios días. Solo de sellar los bordes del cubre con cutex
transparente de uñas.
ANEXO
LABORATORIO Y EQUIPO DE LABORATORIO

35
EQUIPOS
Microscopio trinocular
Sistema microfotográfico
Microscopio invertido
Micromanipulador
Refrigerador con freezer separado (al menos –70º C)
Incubadora
Kit de firita
Remplazo firita
Regulador doble para CO2
Interruptor automático
Cámara de flujo laminar
Indicador de presión
Luz UV
Esterilizador
Centrifuga Universal
Rotor

36
 Tubos de centrifuga
Balanza Analítica
Peachimetro (pH)
Osmometro
Destilador de vidrio
Desionizador
Purificador de agua
Bidón de almacenamiento
Catriges de repuesto

37
38
39
 BIBLIOGRAFÍA
1. AVERY, B. Impact of asynchronous ovulations on the expresion of sex-
dependant growth rate in bovine preimplantation embryos. J Reprod Fert
1989;87:627-631.
2. BARROS, C., VALDIVIA, M., YUNES, R., MELÉNDEZ, J. Acrosina en la
penetración espermática en mamíferos. Progresos en Biología Celular J Becerra
M Pérez-Figares, P Fernández-Llevrez Eds Universidad de Málaga.1993;pp113-
119
3. BENAU, D.A., STOREY, B.T. Relationship between two types of mouse sperm
surface sites that mediate binding of sperm to the zona pelucida. Biol Reprod
1988;39:235-244.
4. BIELANSKI, A., K. LOEWEN, M.R. DEL CAMPO, K. BETTERIDGE, M, SIRARD
AND S. WILLADSEN. 1993. Isolation of bovine herpesvirus-1 (BHV-1) and bovine
viral diarrhea virus (BVDV) in association with the in vitro production of bovine
embryos. Theriogenology 1993;40:531-538.
5. BRACKETT, B.G., BOUSQUET, D., BOICE, M.L., EVANS, J.F., DRESSEL, M.A.
Normal development following in vitro fertilization in the cow. Biol Reprod
1982;27:147-158.
6. BROGLIATTI, G.M., SWAN, C.D., ADAMS, G.P. Transvaginal ultrasound-guided
oocyte collection in 10 to 16 weeks of age calves. Theriogenology 1995;43:177
abst.
7. CALLESEN, H, GREVE, T. AND HYTTEL, P. Preovulatory endocrinology an
docyte maturation in superovulated cattle. Theriogenology 1986;25:7186.
8. CARVALHO, R.V., DEL CAMPO, M.R., PLANTE, Y., MAPLETOFT, R.J. Effects
of stage of development on sex ratio and survival after freezing of day 7 bovine
IVF embryos. Theriogenology 1995;43:183 abst.
9. CRITSER, E.S., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., EYESTONE, W.H., NORTHEY,
D.L., FIRST, N.L. Acquisition of developmental competence during maturation in
vitro. Theriogenology 1986;25:150 abst.
10. CROZET, N. Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow. Gam
Res 1984;10:241-251.
11. CHANG, M.C. Tha maturation of rabbit oocytes in culture and their
maturation, activation, fertilization and subsequent development in the fallopian
tubes. J Exp Zool 1955;128:379-406.

40
12. DE LOOS, F.A.M, VAN VLIET, C., VAN MAURIK, P., KRUIP, THAM.
Morphology of immature bovine oocytes. Gamete Res 1889;24:197-204.
13. DE LOOS, F.A.M., BEVERS, M.M., DIELEMAN, S.J., KRUIP, THAM. Follicular
and oocyte maturation in cows treated for superovulation. Theriogenology
1991;35:537-546.
14. DEL CAMPO, M.R., DONOSO, M.X., PARRISH, J.J., GINTHER, O.J. In vitro
fertilization of in vitro-matured equine oocytes. Equine Vet Sci 1990;10:18-22.
15. DEL CAMPO, M.R., DONOSO, M.X., PARRISH, J.J. In vitro maturation of
equine oocytes. Theriogenology 1992;37:200 abst.
16. DEL CAMPO, M.R., DONOSO, M.X., DEL CAMPO, C.H., ROJO, R., BARROS,
C., PARRISH, J.J., MAPLETOFT, R.J. In vitro maturation of llama (Lama glama)
oocytes. 12th Inter. Cong. Anim. Reprod. 1992; pp 324-326.
17. DEL CAMPO, M.R., DONOSO, M.X., PALAS, A.T., GARCÍA, A., MAPLETOFT,
R.J. The effect of days in co-culture on survival of deep frozen bovine IVF
blastocysts. Theriogenology 1993;39:208 abst.
18. DEL CAMPO, M.R., DEL CAMPO, C.H., ADAMS, G.P., MAPLETOFT, R.J. The
application of new reproductive tecnologies to South American camelids.
Theriogenology 1995;43:13-20.
19. DUBY, R.T., DOBRINSKY, J.R., ROBL, J.M., OVERSTROM, E.W., BAGUISI, A.,
ROCHE, J.F., BOLAND, M.P. In vivo and in vitro development of embryos from
superovulated beef heifers. Theriogenology 1992;37:204 abst.
20. EDWARDS, R.G. Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, rhesus
monkey and human ovarian oocytes. Nature (London) 1965;208:349-351.
21. FIRST, N.L., PARRISH, J.J. In vitro fertilization of ruminants. J Reprod Fert
1987;34:151-165.
22. FUKUDA, Y., ICHIKAWA, M., NAITO, K., TOYOTA, Y. Birth of normal calves
resulting from bovine oocytes matured, fertilized, and cultured with cumulus
cells in vitro up to the blastocyst stage. Biol Reprod 1990;42:114-119.
23. GREVE, T., MADISON, V. In vitro fertilization in cattle: a review. Reprod Nutr
Dev 1991;31:147-157.
24. HASLER, J.F. Commercial applications of in vitro fertilization in cattle. Food
Anim 1994;16:1062-1073.
25. HYTTEL, P., CALLESEN, H., GREVE, T., SCHMIDT, M. Oocyte maturation and
sperm transport in superovulated cattle. Theriogenology 1991;35:91-108.

41
26. HYTTEL, P., CALLESEN, H., GREVE, T. Ultrastructural features of preovulatory
oocyte maturation in superovulated cattle. J Reprod Fertil 1986;76:645-656.
27. HINRICHS, K. Embryo transfer in the mare: A status report. Anim Reprod Sci
1993;33:227-240.
28. IRITANI, A., NIWA, K. Capacitation of bull spermatozoa and fertilization in
vitro of cattle follicular oocytes matured in culture. J Reprod Fertil 1977;50:119-
121.
29. KRUIP, A.M., DIELEMAN, S.J. Macroscopic classification of bovine follicles and
its validation by micromorphological and steroid biochemical procedures. Reprod
Nutr Develop 1982;22:465-473.
30. LIEBFRIED, L., FIRST, N.L. Characterization of bovine follicular oocytes and
their ability to mature in vitro. J Anim Sci 1979;48:76-86.
31. LOSKUTOFF, N.M., BARTELS, P., MEINTJES, M., GODKE, R.A., SCHIEWE,
M.C. Assisted reproductive technology in nondomestic ungulates:A model
approach to preserving and managing genetic diversity. Theriogenology
1995;43:3-12.
32. MADISON, V., AVERY, B., GREVE, T. Selection of immature bovine oocytes
for developmental potential in vitro. Anim Reprod Sci 1992;27:1-11.
33. MEINTJES, M., BELLOW, M.S., BROUSSARD, J.R., PAUL, J.B. AND GODKE,
R.A. Transvaginal aspiration of bovine oocytes from hormone-treated pregnant
beef cattle for IVF. Theriogenology 1993;39:266 abst.
34. MCKINNON, A.O., CARNEVALE, E.M., SQUIRES, E.L., VOSS, J.L., SEIDEL,
G.E. Heterogeneous and xenogenous fertilization of equine oocytes. Proc 10th
Equine Nutrition and Physiology Symposium, San Antonio, TX, Society for
Theriogenology, Hastings, NE 1992;pp 197-201.
35. PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., CRITSER,
E.S., EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-
thawed semen. Theriogenology 1986;25:591-600.
36. PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., WINNER, M.A., FIRST, N.L.
Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol Reprod 1988;38:1171-1180.
37. PILIP, R., DEL CAMPO, M.R., MAPLETOFT, R.J. In vitro fertilizing
characteristics of bovine semen with multiple nuclear vacuoles. Theriogenology
1995;43:297 abst.

42
38. SATO, E., MATSUO, M., MIYAMOTO, H. Meiotic maturation of bovine oocytes
in vitro: Improvement of meiotic competence by dibutyryl cyclic adenosine 3', 5'-
monophosphate. J Anim Sci 1990;68:1182-1187.
39. SIRARD, M.A., FLORMAN, H.M., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., BARNES,
F.L., SIMS, M.L., FIRST, N.L. Timing of nuclear progression and protein syntesis
necessary for meiotic maturation of bovine oocytes. Biol Reprod 1989;40:1257-
1263.
40. STUBBINGS, R.B., LIPTRAP, R.M., BASRUR, P.K. The assessment of follicular
parameters for the selection of oocytes recovered from superovulated heifers.
Anim Reprod 1990; 23:181-195.
41. THONON, F., ECTORS, F.J., DELVAL, A., FONTES, R.S., TOUATI, K.,
BECKERS, J.F. In vitro maturation, fertilization and development rates of bovine
oocytes connected with the reproductive status of the donor. Theriogenology
1993;39:330 abst.
42. WASSARMAN, P.M. Fertilization in mammals. Scientific Am 1988;78-84.
43. WHITTINGHAM, D.G.Fertilization of mouse eggs in vitro. Nature
1968;220:592- 593.
44. XU, K.P., HOIER, R., GREVE, T. Dynamic changes of estradiol and
progesterone concentrations during in vitro oocyte maturation in cattle.
Theriogenology 1988;30:245-255.

43