UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTOBAL DE

HUAMANGA- FCA - EP MEDICINA VETERINARIA

CURSO DE BIOTECNOLOGÍA
VETERINARIA – MV 540

PRODUCCION in vitro
DE EMBRIONES Bovinos
DR. ARTURO RODRÍGUEZ ZAMORA.
DOCTOR EN CIENCIAS VETERINARIAS – UNIV. SANTIAGO DE
COMPOSTELA-ESPAÑA
DOCENTE UNIV. NAC. DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA
https://www.youtube.com/watch?v=X3eDRYVD
MkE
PRODUCCIÓN In vitro DE
EMBRIONES
 VENTAJAS
 • Disminución del estrés de manejo.
 • No hay interacción sobre la ovulación.
 • Utiliza varios sementales sobre una misma vaca.
 • Evita la transmisión de enfermedades.
 • Realización durante largos períodos fisiológicos.
 • Propicio para la investigación.
 • Insustituible en la Conservación de Recursos Genéticos.
 INCONVENIENTES
 • Bajos resultados en la congelación.
 • Equipo Humano con alta formación.
 • Síndrome del Ternero Gigante.
 “IN VITRO”
La fecundación in vitro (FIV o IVF por sus siglas
en inglés) es una técnica por la cual la fecundación
de los ovocitos por los espermatozoides se realiza
fuera del cuerpo de la madre. La FIV es el principal
tratamiento para la iinfertilidad cuando otros
métodos de reproducción asistida no han tenido
éxito. El proceso implica el control hormonal del
proceso ovulatorio, extrayendo los ovocitos de los
ovarios maternos, para permitir que sean
fecundados por los espermatozoides en un medio
líquido. El ovocito fecundado (el cigoto) se
transfiere entonces al útero de la paciente con la
intención de iniciar un embarazo
El término in vitro es un término en latín que
significa en cristal. Se utiliza porque en los primeros
experimentos biológicos en los que se realizaban
cultivos de tejidos fuera de los organismos vivos de
los cuales procedían, se realizaban en
contenedores de cristal, tales como tubos de
ensayo, probetas, placas de “cristal”....
Inicialmente la FIV se desarrolló para superar situaciones de infertilidad debidos a
problemas en las trompas de Falopio, pero posteriormente se observó que la técnica
tenía éxito también en otros casos de infertilidad. La introducción de la inyección
intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) soluciona en gran medida los
problemas de infertilidad masculina.
Para que un tratamiento de FIV tenga éxito, es necesario disponer de ovocitos sanos,
espermatozoides que puedan fecundar y un útero que pueda mantener un embarazo
Recolección de los
ovocitos
1. A partir de ovarios del matadero
 En caso de accidente
 Muy importante su uso en investigación
 Útil para poner a punto un Laboratorio.
2. A partir de donantes vivos
= Ovum Pick Up=recuperación de ovocitos
2.1.- PUNCIÓN LAPAROSCÓPICA:
 Requiere cirugía
 Repetibilidad limitada (bienestar animal y adhesiones
2.2.- PUNCIÓN ECOGRÁFICA:
 Repetible y poco invasivo
 Fácil para vacas gestantes y con problemas
 Posible también en terneras.
PUNCION ECOGRAFICA=OPU

1) Vacas cíclicas: semen caro

 problemas: oviductos bloqueados, quistes
ováricos, fallo en la SOV, fallo en la fecundación
 post parto: durante el anestro, 80 días pos parto
 gestantes: durante el primer trimestre
2) Novillas : desde el primer mes
Producción de embriones in vitro,
aspiración laparoscópica en
prepúberes
Aspiración en animales
prepúberes
 Aspiración ultrasonográfica:
 Aguja de 14g.
 20-22 ml/min de presión de aspiración.
 Medio: PBS + BSA, surfactante.
 Tratamiento de superovulación:
 750 a 1.000 ui de eCG.
 Neutra eCG + GnRH.
 A intervalos de 2 a 4 semanas.
 Intervalo de SOV a la obtención de 48 a 72h
Punción en
hembras
prepúberes
Punción en hembras
prepúberes
SELECCIÓN
OVOCITOS
 MADURACION IN VITRO (MIV)

El desarrollo embrionario está

fuertemente influenciado por los
sucesos que ocurren durante la
maduración

El éxito o fracaso en la maduración del

Oocito es un paso altamente limitante
en los procedimientos de producción
de embriones in vitro (PIV) y de las
técnicas de reproducción asistida(ART)
en animales y en humanos.
MIV
 La maduración nuclear y citoplasmática ocurre in
vivo durante el crecimiento folicular y la ovulación.
 va de la mano con la maduración folicular, inducidos por
cambios característicos en los niveles plasmáticos de las
gonadotropinas.
 cambios en la membrana del ovocito y el sistema señales
intercelulares (Thiboult, 1977; 1988; Moor, 1990).
 Modulación de la sensibilidad del ovocito a los inhibidores de
la maduración como son el AMPc y purinas (Sirard y First,
1988; Downs, 1993).
Maduración nuclear y
citoplasmática
Maduración nuclear:
reinicio de meiosis

MPF: Factor Promotor de Maduracion. Cinasa y cdks controladores de

transición del ciclo celular.
MAP: Mitogen-Activated Protein Kinases, o proteína quinasas
activadas por mitógenos
La maduración del núcleo se caracteriza por estados alternados de
desarrollo y de arresto de la meiosis
Medios de maduración
Características:
Medios definidos
 Factores de crecimiento
(EGF),
 cisteamina, estradiol,
FSH, LH,etc.
Medios no definidos
 FCS(5-10%)
 Fluidofolicular,etc.
 Esterilidad, incluyendo antibióticos
 Distintos fuera y dentro:
 •PBS+BSAoTCM199+HEPES
 •Tampónbicarbonato
 •pH:neutro
 •Osm:
 •Dejarles2hantesdeponerlos
oocitosamadurar
 enelincubador
paraqueseequilibrenabiertos
Sistemas de MIV

 Abiertos o cerrados
 Microgotas o volumen500µl
 Hasta100 oocitos/grupo
 Aceite mineral o no
 Platina calefactora con placas de cultivo
Condiciones MIV

 Temperatura 37-39ºC
 Gases 20% CO2
 Humedad 100%
 Tiempo: Variable según la especie
17h (ratona), 24h (vaca, oveja), 27h (cabra),
36-42 (yegua), 44h (cerda), 16h (coneja).
 Se continúan empleando sistemas desarrollados hace
20 años en muchos casos (MIV espontánea-no
fisiológica)
 Sin embargo, estos sistemas no son suficientemente
efectivos (competencia in vitro < que in vivo)
 Bloqueo de la meiosis y de la fecundación,
 % de formación de blastocistos bajo (alcanza sólo 40%)
 Problemas en la implantación cuando los embriones se
transfieren a hembras receptoras.
 Cambios epigenéticos lo que puede afectar a la
descendencia incluso durante su vida adulta.
Maduración bifásica. Sustancias en los medios
de maduración oocitaria que previenen el reinicio espontáneo de
la meiosis

Simulated physiological oocyte maturation (SPOM)

R. Gilchrist
 No sólo las condiciones de la MIV influyen en el
éxito o fracaso…
 CALIDAD INTRÍNSECA DEL OOCITO:
 •Prepúberes
 •Viejas
 •NEB
 •Alteraciones metabólicas
 •Grado de atresia
 •Etc..
VALORACION DE LA
MADURACION
 •Expansión cúmulo y presencia de CP
 •Tinciones
 •Maduración nuclear: presencia MII
 •Maduración citoplasmática: reorganización
organelas
 •Expresión génica y wester blott: RNAm y
proteinas
 •% Cleavaje
 •% Blastocisto
 •Tasas de preñez
Fecundación (FIV)

 Descongelar el semen.
 Capacitación - heparina.
 Selección espermática:
 Swim-up.
 Gradiente de densidad de Percoll.
 0,5-1 X 106 spz/mL.
 Co-cultivo durante 24 h en 5% CO2 en aire
 FECUNDACIÓN

Una vez en el laboratorio, los ovocitos extraídos se limpian, eliminando las

células que los rodean y preparándolos para la fecundación. Al mismo tiempo,
el semen se prepara para la fecundación, eliminando las células inactivas y el
fluido seminal. El esperma y el ovocito se incuban juntos en el medio de cultivo
durante unas 18 horas. Para entonces la fecundación debería haber ocurrido y
el ovocito fecundado debería mostrar dos pronúcleos
 CULTIVO DE EMBRIONES

Cultivo de embriones [editar]Una vez el óvulo ha sido fecundado y se ha

obtenido un cigoto, éste es cultivado para promover su división celular y
crecimiento para dar lugar a un embrión. Este cultivo dura entre 2 y 5 días, y es
muy importante que se lleve a cabo en las condiciones óptimas para el
embrión, ya que de ello dependerá su calidad y la tasa de implantación del
mismo cuando sea transferido a un útero
CULTIVO IN VITRO (CIV)
 Desarrollo de embriones cultivados in vitro
Cultivo in vitro de embriones a
los 7-8 días
Congelación y vitrificación
de embriones producidos in vitro
Viabilidad post descongelación de
embriones PIV vitrificados
 TRANSFERENCIA DE EMBRIONES

Normalmente, para mejorar las posibilidades de implantación y embarazo, se

transfieren varios embriones simultáneamente. Los embriones que se
consideran "mejores" se transfieren al útero a través de un catéter de plástico
muy fino, que se introduce a través de la vagina y el cérvix y se controla
mediante su visualización por ultrasonidos.
Comparación entre ambos tipos
de producción de embriones
bovinos