Introducción

La inseminación artificial con semen congelado es una técnica

reproductiva muy utilizada, aunque muy poco empleada en llamas y
alpacas, debido a los errores en la metodología de recolección y las
características seminales de alta viscosidad por la presencia de un plasma
seminal mucoide producto de las glándulas bulbo-uretrales, baja motilidad
y baja concentración espermática. Diversos métodos han sido utilizados
para la recolección de semen en camélidos sudamericanos, tales como
fundas vaginales, electroeyaculación y vagina artificial con un maniquí
(21).

Además, la criopreservación de semen es un reto para el desarrollo de la

crianza de camélidos sudamericanos a causa de las características
propias del semen y el escaso conocimiento de dilutores, lo que
imposibilita el desarrollo de protocolos de criopreservación con resultados
óptimos de calidad espermática post-descongelamiento.

Debido a esto, se han realizado diversas investigaciones como el uso de

enzimas (fibrinolisina, hialuronidasa, colagenasa y tripsina) o métodos
mecánicos como la aspiración y expulsión del eyaculado a través de una
aguja o la centrifugación, con cierto éxito para simplificar la manipulación
y permitir la dilución, extensión, y congelación del semen. Además, se
reportaron el uso de diferentes dilutores entre los que se encuentran la
leche descremada, fosfato salino tamponado, glucosa-citrato, yema de
huevo-glucosa-citrato, tryladil y tris tamponado.

1. Características del semen

1
 Los eyaculados de los camélidos están caracterizados por un reducido
volumen y concentración de espermatozoides comparando con otros
animales de producción. Los parámetros a observar son el volumen, color,
motilidad, concentración espermática, vitalidad y morfología. Sin
embargo, el semen de las alpacas es muy viscoso lo que hace difícil su
manipulación para determinar los parámetros espermáticos tales como
concentración y movilidad espermática.

El color del semen de las alpacas ha sido descrito como blanco lechoso a
blanco cristalino, aunque podría depender de la concentración
espermática y la proporción de la secreción de las glándulas sexuales
accesorias. Mientras que, el promedio del volumen de cada eyaculado
varía entre 1 a 2ml y los porcentajes en el semen de alpaca consisten en
11.5% de espermatozoides y 88.5% de fluido seminal.

La concentración de espermatozoides varía desde aproximadamente

30,000 hasta 150 millones por mL en alpacas y el pH del semen de
camélidos se encuentra en el rango de 7.2 - 8.6. (1)

El movimiento de los espermatozoides en el semen no diluido es

oscilatorio y sólo del 5 al 10% de los espermatozoides tienen un movi
miento progresivo. La viabilidad de los espermatozoides presentes en el
semen de alpaca varía desde un 58% a 83%, mientras que los porcentajes
de espermatozoides con morfología normal están en un rango de 71% a
84%.(1)

El espermatozoide de alpaca presenta una longitud total de 47.29 micras,

mientras que el largo y el ancho promedio de la cabeza mide 6.12 y 3.68
micras respectivamente. (2)

2. Colección de semen

2
La colección de semen en camélidos sudamericanos presenta dificultades
como: la duración de la cópula, la posición de cópula, el lugar de depósito
del semen y el tipo de eyaculación, así como el aspecto del eyaculado. (2)

Entre los métodos de colección se reportó las fundas vaginales, la

electroeyaculación, la fistula uretral, vagina artificial y por último la
aspiración de semen del fondo vaginal. (3)

2.1. Fundas vaginales (4)

Fue el primer reporte de colección de semen, se usaba una
funda de látex colocada intravaginalmente antes de la cópula.
Se colecta semen pero con inconvenientes como la interferencia
con la cópula normal y el tiempo. Además causa daños en el
tracto genital de la hembra y deficiencias en el semen por lo que
ya no es usado actualmente.

2.2. Esponjas vaginales (5)

Se introducen trozos de esponja dentro de la vagina, lo cual
absorbe el semen, la desventaja de esta técnica es que el semen
obtenido está muy contaminado y diluido con fluidos del tracto
genital femenino, evitando su uso para inseminación artificial.

2.3. Fistula uretral

Se coloca una fístula quirúrgica en la uretra peniana y el semen
es colectado durante la cópula normal. Sin embargo, entre las
desventajas esta los cuidados post-operatorios y la discapacidad
del macho, aunque según Kubinek esto no ocurre. (6)

2.4. Electroeyaculación
Fue descrito por primera vez en 1966, para colección de semen
de alpacas, se usó una intensidad máxima de 40 voltios. Entre
las ventajas de esta técnica es que no se necesitan hembras en
celo, por lo que se puede realizar en cualquier época del año.
También se encuentran desventajas como la obtención de

3
 semen muy diluido, contaminado con la orina y con baja
concentración espermática, además en cuanto al animal, este
necesita de sedación profunda y no se puede evaluar el libido.
(7)

2.5. Aspiración vaginal post-cópula

Es una práctica fácil y no invasiva, sin embargo, las muestras de
semen obtenidas por este método son incompletas,
contaminadas y diluidas con secreciones del tracto femenino y
sangre.

2.6. Vagina artificial

La técnica fue desarrollada por Sumar y Leyva en 1981,
construyeron un maniquí en posición de cópula con una vagina
artificial adaptada de ovinos y vacunos. Con la ayuda de una
frazadilla eléctrica que la cubre permite mejorar la técnica de
colección y mantenimiento de temperatura. Es el método más
usado para inseminación artificial en alpacas y llamas ya que el
semen es confiable, de buena calidad y se puede usar para
inseminación artificial. (8)

2.7. Hembra receptiva

Lo bueno de esta técnica es que el semen colectado es
fisiológicamente normal, sin embargo, se requiere un
entrenamiento de los animales y del operador.

Se ha demostrado que el método utilizado para la colección de semen en

alpacas ha influido sobre la calidad espermática del mismo. Estudios
demuestran que la colección de semen con vagina artificial con el apoyo
de una hembra receptiva permite obtener mejores características de
volumen, motilidad, concentración y porcentaje de espermatozoides
vivos.
Incluso, se reportó diferencias físicas del semen colectado por aspiración
vaginal y vagina artificial, en el cual las variables como volumen, motilidad

4
 y el número de espermatozoides vivos fueron superiores en el semen
colectado por aspiración vaginal, en tanto que la concentración
espermática fue superior en el semen obtenido con vagina artificial.
Asimismo, el 90% de los eyaculados colectados con vagina artificial
presentaron alta viscosidad en comparación con el 10% de los eyaculados
recuperados por aspiración vaginal.

3. Criopreservación de semen

A pesar que hay un considerable interés en la aplicación de la

inseminación artificial (IA) en camélidos, la criopreservación de semen de
estas especies no está muy desarrollada.

La criopreservación tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad

y funcionalidad celular a temperaturas bajas. La criobiología se refiere a
entender los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas
celulares ya que el tiempo biológico es una consecuencia de
determinadas reacciones bioquímicas y el frío prolonga el tiempo
biológico puesto que enlentece estas reacciones.

El proceso de congelación del semen necesita estabilizar la integridad de

las células espermáticas para que no sean destruidas durante el
transcurso de la congelación, es así que se evaluaron diversos dilutores
para ser usados en la criopreservación de espermatozoides,
encontrándose que el mejor dilutor para este fin es el tris (hidroximetil
amino metano) (9)(10)

3.1. Crioprotectores

5
En la criopreservación de cualquier material biológico se deben brindar
condiciones adecuadas para su supervivencia, y es allí donde los agentes
crioprotectores cumplen una importante función. Los crioprotectores
permeables son sustancias de bajo peso molecular que pueden pasar a
través de la membrana celular, remplazando el volumen de agua
intracelular evitando los daños producidos por la formación de cristales de
hielo y, a su vez, manteniendo el volumen celular impidiendo el colapso
de la célula por excesiva deshidratación.

Dentro de los crioprotectores, el glicerol (GL) ha sido extensamente usado

en la criopreservación de varios tipos de células, incluyendo el esperma
mamífero (11). Por otro lado, el Dimetil Sulfóxido (DMSO) es un agente
crioprotector prometedor para las células, pues su bajo peso molecular le
permite atravesar la membrana celular de manera rápida (12); en tanto
que el etilenglicol (EG) es un crioprotector que ha sido utilizado
universalmente en la congelación de tejido ovárico y de embriones de
muchas especies (13), y con el semen de toro ejerce un menor efecto
inhibitorio en la motilidad que el GL o el DMSO (14).
El siguiente cuadro es sobre un estudio en Perú que tenía como objetivo
evaluar el efecto de tres crioprotectores: Dimetil Sulfóxido (DMSO),
Etilenglicol (EG) y Glicerol (GL) sobre la criopreservación de
espermatozoides epididimarios de alpaca. (15)

6
En el cuadro 1 se observa que los espermatozoides congelados con
DMSO fueron los que obtienen mejor motilidad posdescongelación (31.1
± 8.5%) seguidos de aquellos congelados con glicerol (23.9 ± 8.3%),
habiendo diferencias significativas entre estos dos grupos con el grupo de
etilenglicol. La integridad funcional inicial de la membrana espermática fue
de 53.9 ± 8.5%, mientras que los resultados luego de la descongelación
siguieron el mismo patrón que la motilidad (cuadro 2).

En otro trabajo se investigó la influencia de la criopreservación sobre la

motilidad, viabilidad y fertilidad de espermatozoides de llama en Argentina
donde se seleccionaron a 10 machos adultos (5 a 8 años de edad). Este
trabajo tenía como objetivo obtener gestaciones por medio de la
inseminación artificial con semen congelado en hembras nacidas y
adaptadas a la región de la Puna argentina. (16)
Se obtuvo que el proceso de congelación/descongelación redujo
significativamente los porcentajes de viabilidad y motilidad espermática
comparados con el semen fresco y por lo tanto el número de
espermatozoides viables y motiles contenidos en una pajuela. La tasa de
supervivencia espermática posdescongelación fue estimada
subjetivamente en un 20-25%, por lo tanto, el número de espermatozoides
motiles por dosis de inseminación artificial varió de 4 a 7 millones. Tres
hembras (3/38) inseminadas con semen congelado resultaron preñadas.

7
La motilidad espermática fue reducida de 54,3% en semen fresco a 20,4%
en semen descongelado. Por lo tanto, podría establecerse que son
requeridos más espermatozoides por dosis de inseminación para
asegurar una óptima fertilidad si el semen ha sido congelado

3.2. Dilutores de semen

La dilución del semen tiene razones técnicas como reducir el número de

espermatozoides a la dosis requerida, obteniendo más dosis por
eyaculado y razones biológicas, como aportantes de nutrientes, un
ambiente isotónico, amortiguadores para cambios de pH, los protege del
shock de frío e impide su contaminación bacteriana.

Todos los dilutores tienen como componentes principales la proteína para

protección (yema de huevo y/o leche calentada), agentes crioprotectores
(ACPs), además de sustancias para mantener la osmolaridad (sales NaCl,
KCI), controlar el pH (bicarbonato, TRIS, HEPES, citrato), azúcares como
fuente de energía (fructuosa) y antibióticos para controlar el crecimiento
bacteriano (penicilina, estreptomicina). (3)

 Leche calentada.- las proteínas de la leche proveen propiedades a

los espermatozoides durante la congelación, además funciona
como amortiguador contra cambios de pH. La caseína es la
proteína mayoritaria en la leche y tiene propiedades antioxidantes,
mientras que la lactenina es tóxica para los espermatozoides, es
por esto que se calienta a temperaturas mayores de 90°C para
inactivarla (3).

 Yema de huevo.- se usa sola, con citrato de sodio o junto con la

leche calentada. Sirve para proteger al espermatozoide del daño
durante el enfriamiento y descongelamiento y mejorar la fertilidad
espermática. La protección se debe a las proteínas de baja
densidad (LDL). Las LDL tienen triglicéridos en el centro y una
envoltura de proteínas y fosfolípidos, durante la congelación-

8
 descongelación, las LDL liberan los fosfolípidos los cuales pasan a
formar una cubierta en la superficie de las membranas
espermáticas. (3)
La yema también contiene proteínas de alta densidad (HDL) que
son antagonistas al efecto protector de las LDL, y las HDL solas
disminuyen la motilidad espermática en comparación con la yema
entera.

 Agentes crioprotectores.- Mencionados anteriormente, cumplen la

importante función de reemplazar el volumen de agua intracelular,
evitando el daño por la formación de cristales de hielo.

 Controladores de pH.- Los principales son Tris, Tes, Test,

glutamato. Son elementos buffer que mantienen la osmolaridad y
la alcalinidad del semen. Se usan mezclando los demás
componentes y en un estudio se determinó que los dilutores a base
de Tris y de Tes no afectaban los porcentajes de integridad de la
membrana y acrosomal durante el proceso de
congelamiento/descongelamiento. (17)

 Sustratos de energía.- Los principales para dilutores son fructuosa,

sorbitol y glicerilfosforilcolina, que están presentes en el plasma
seminal. La fructuosa es el azúcar principal y proporciona hidratos
de carbono que son usados como fuente de energía de
espermatozoides móviles. También se ha reportado el uso de
glucosa, manosa, maltosa o lactosa para esta función.

9
 3.3. Métodos de criopreservación

Existen diferentes métodos para llegar a la congelación y subsiguiente

viabilidad de las células criopreservadas. Estas se clasifican en
congelación lenta/descongelación rápida, congelación
lenta/descongelación lenta y congelación ultrarápida y vitrificación (2).

 Congelación lenta: se adiciona el crioprotector por pasos y el

descenso de temperatura se realiza lentamente con un
congelador programable.
 Congelación ultrarápida: implica la rápida deshidratación celular,
usando altas concentraciones de crioprotector, como el DMSO y
sacarosa, seguido de inmersión en nitrógeno líquido (3).
 Descongelación lenta: se usa un congelador programable
 Descongelación rápida: esta se realiza a temperatura ambiente o
en baño de agua a 30°C o más para evitar recristalización (2).
 Vitrificación: congelación rápida en una mezcla de altas
concentraciones de creioprotectores, que a bajas temperaturas
aumentan su viscosidad, para no formar hielo.

3.4. Proceso de criopreservación

El proceso involucra 3 fases: de enfriamiento, de congelamiento y de

descongelamiento (Santiani, 2003).

 Fase de enfriamiento.- Se da en dos partes: primero, el semen

diluido es enfriado hasta 5°C en un tiempo de 0.5 a 3 horas, esto
para reducir la motilidad espermática, la segunda parte es que se
mantiene el semen a 5°C por 0.5 a 1.5 horas para lograr
estabilización celular.

 Periodo de transición.- entre enfriamiento y congelamiento. Se

adicionan los crioprotectores al semen, lo cual permite una mayor
estabilización de los espermatozoides en la solución. El diluyente

10
 es dividido en 2 fracciones para evitar el daño de la agregación
abrupta.

 Fase de congelamiento.- empieza cuando la temperatura llega a

5°C (2). Los espermatozoides son expuestos a un estrés de tipo
osmótico y térmico. Al llegar a -10°C se da la formación de hielo del
agua extracelular provoca que la fracción líquida se vuelva
hipertónica por la diferencia de presiones. El agua intracelular sale
para mantener la osmolaridad en la solución. Este periodo de
cristalización también es llamado ‘’rango crítico de temperatura’’ (2)
En muchos laboratorios se suspende las pajuelas en vapores de
nitrógeno líquido antes de sumergirlas dentro del nitrógeno líquido.
Esto permite reducir la temperatura dentro de las pajuelas a -150°C
en 15 minutos (2) esto da una buena tasa de supervivencia.

 Fase de descongelamiento.- se realiza al sumergir las pajillas en

agua baño maria entre 37-50°C por segundos hasta 5 minutos.
Mayormente se opta por el descongelamiento rápido para que los
espermatozoides no vuelvan a pasar por el ‘’rango crítico de
temperatura’’ y evitar la recristalización.

11
4. Discusión

La criopreservación de semen de camélidos ha dado resultados muy

variables. La viabilidad de los espermatozoides disminuye entre un 40 a
50% durante el proceso de criopreservación (18) e incluso los mejores
protocolos de criopreservación no garantizan una alta supervivencia de
los espermatozoides (19).

Se ve una menor fertilidad del semen congelado con respecto al semen

fresco, esto se debe a que la proporción de células espermáticas con
motilidad progresiva es reducida por todo el proceso de enfriamiento,
congelación y descongelación. La criopreservación selecciona los
espermatozoides viables y destruye al resto, llevando a una menor pero
fértil población.

Incluir un mayor número de espermatozoides en la dosis de semen

congelado, aumentará el número de espermatozoides que sobrevivirán
en el tracto reproductivo de la hembra para producir una alta tasa de
concepción. Además, el mejoramiento de los diluyentes y procedimientos
de congelación posiblemente disminuirá el daño espermático, de manera
tal que una mayor proporción de espermatozoides mantenga por más
tiempo su capacidad fertilizante después de la descongelación.

Para la conservación del semen refrigerado en llamas, se evaluó la acción

de BSA+glucosa, desde una motilidad inicial de 57.6 %, descendió a 43.0
% a las 24 horas, hasta este porcentaje es aceptable para realizar la
inseminación artificial, por lo que se recomienda su uso, a partir de las 24
horas la motilidad va descendiendo progresivamente (20).

12
5. Conclusiones

-La importancia de criopreservar espermatozoides de las especies

animales es muy reconocida en la actualidad y puede favorecer el
comercio internacional de razas o líneas genéticas, la formación de
bancos de germoplasma, reserva genética, conservación de especies
amenazadas o en peligro de extinción, etc.

-Los intentos de criopreservar semen de camélidos sudamericanos hasta

la fecha han dado resultados insatisfactorios, esto debido a características
propias del semen, la técnica de colección y uso de dilutores.

- El semen congelado parece ofrecer distintas posibilidades para el

avance tecnológico en la explotación de los camélidos sudamericanos,
como ha ocurrido con otras especies domésticas

- El efecto de la criopreservación sobre la motilidad y viabilidad de los

espermatozoides es un factor que debe ser considerado en protocolos de
tecnologías de reproducción asistida.

- La fertilidad del semen es el factor más importante a tener en cuenta al

implementar nuevas técnicas o procedimientos en programas de IA.
Además, factores ambientales y fisiológicos, como estación del año, edad
de los animales, raza, nivel nutricional, pueden también alterar las
características seminales, como se ha observado en otras especies.

13
6. Bibliografía
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15