Produccin in vitro de embriones bovinos,

bajo un sistema de incubacin alternativo

Dr. Gerardo Rogelio Cansino Arroyo,

Dr. Roberto Flores Bello,
M.C. Julio Armando Aguilar Cabrales,
M.C. Mara Magdalena Garca Rodrguez
Estudiante Mara Elena lvarez Mndez

Resumen

Para producir embriones in Vitro en un sistema de incubacin alternativo se desarroll: un

sistema de incubacin cerrado (SIC) que emple un desecador y una estufa de cultivo. El
ambiente de CO2, fue generado por combustin; otro sistema de incubacin abierto (SIA) que
utiliz una olla de vapor con vlvulas y un tanque de aire. La atmsfera se abasteci por
inyeccin del aire (5% CO2). La temperatura y humedad fue aportada por la estufa. Se
compararon con el sistema convencional (SIT). Las variables se analizaron por ANOVA, sus
diferencias mediante una prueba Chi. Los oocitos madurados en SIA correspondi a 74.68%
(317 de 420). El 69.87% correspondi al SIC (280 de 409), con diferencias (P<0.05). De 416
oocitos del SIT, 319 maduraron (74.93%).Los oocitos fertilizados en SIA correspondi a 34.94%
(108 de 317). El 31.12% correspondi al SIC (88 de 280). De 319 oocitos del SIT, 129 se
fertilizaron (42.28%); con diferencias (P<0.005). Destacan 115 embriones de 129 fertilizados
(91.14%) del SIT. El 89.16% en SIC (76 embriones de 88 fertilizados). El SIA con 89.95% (95
embriones de 108). Sin diferencias estadsticas (P>0.005). Se demostr la posibilidad de
producir embriones bajo un sistema no convencional.

Palabras clave: embriones, in vitro, sistema alternativo.

Introduccin

La reproduccin del ganado bovino se rige por procesos biolgicos reproductivos con los que se
obtiene una cra por vaca al ao. Una forma de aumentar las cras por hembra, consiste en
aplicar tecnologas como la produccin de embriones in Vitro (PEIV), con la cual se obtienen
ms descendientes por hembra en menor tiempo a partir de embriones producidos en

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008 7

laboratorio. La PEIV se realiza en condiciones controladas con el uso de equipo especializado
como la campana de flujo laminar, la incubadora de flujo continuo de CO2, el equipo de
criopreservacin y microscopia.

En el estado de Tabasco se requiere impulsar esas tecnologas para manipular y mejorar el

proceso reproductivo, no obstante la ventaja de la PEIV se ve obstaculizada, debido a que la
produccin de embriones se realiza con el uso de equipo especializado como la campana de
flujo laminar, la incubadora de flujo continuo de CO2, lo que hace que la PEIV se limite a unos
cuantos los laboratorios de reproduccin animal asistida. Asimismo, la escasa disponibilidad de
recursos financieros para la adquisicin de la incubadora y los gastos que implican el consumo
contino del CO2, son los principales factores limitantes para su implementacin.

Diversos esfuerzos se han realizado para poner al alcance de productores la PEIV en ms

laboratorios, dentro de los cuales destacan el uso compartido de incubadoras, el uso de
pequeas jarras como incubadoras o bien el uso de mini-incubadoras (Avery y Greve, 1992),
as como, el uso de bolsas hermticas (Vajta y col., 1997). Estos intentos se basan en el
principio de mantener la temperatura (38.5-39 C), humedad (100%) y atmsfera (5% de CO2)
para el cultivo in Vitro de embriones y reducir el consumo de CO2. Para el desarrollo de
biotecnologas reproductivas, se hace necesario implementar sistemas alternativos diseados
para la PEIV que puedan estar al alcance de un mayor nmero de laboratorios de reproduccin
animal.

Objetivo

Desarrollar dos sistemas de incubacin, uno de ambiente cerrado y otro abierto que
proporcione las condiciones de temperatura, humedad y atmsfera necesarias y compararlos
con la incubacin convencional para la maduracin, fertilizacin de oocitos y su desarrollo en la
produccin de embriones in Vitro.

Meta

Producir embriones bovinos in Vitro en un sistema de incubacin alternativo que proporcione

atmsfera necesaria (temperatura, humedad) para la maduracin, fertilizacin de oocitos y su
desarrollo embrionario temprano.

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008 8

Materiales y mtodos

Para cumplir con el objetivo, se desarrollaron dos formas alternativas de incubacin y se

compararon con el sistema tradicional. Se procedi a seleccionar ovarios de hembras
sacrificadas en el rastro. Se transportaron al laboratorio, a 25C, en solucin salina fisiolgica
(SSF) adicionada con 0.1% Penicilina-Estreptomicina. Los oocitos se obtuvieron por aspiracin
con jeringa. El lquido folicular se deposit en tubos cnicos y se dej sedimentar (20 min), se
retir el sobrenadante, se lav por tres veces, el botn resultante se coloc en una caja de Petri
y bajo el microscopio estereoscpico zoom de aumento continuo de 1 a 4.5 (Nikon, Japn), se
evaluaron los oocitos. Se recuperaron los oocitos que mostraron una capa de clulas foliculares
compacta, se transfirieron a una gota de 60 l de medio de maduracin (TCM-199). Se lavaron
los oocitos en medio de maduracin. Se valoraron por sus caractersticas del cumulus, corona
radiada, ovoplasma (CCO). Se separaron los oocitos por calidad 1 y 2. Los de calidad 2 se
eliminaron.

Los oocitos para su maduracin se distribuyeron uniforme y aleatoriamente en alguno de los

tres sistemas. En el primer sistema convencional (SIT) se colocaron en una caja de cultivo de 4
pozos (10 a 20 oocitos) y 500 l del medio. Se emple el medio de cultivo de Tejidos (TCM-199)
suplementado con 10% de suero fetal bovino. (Durnford y col., 1994) 0.1U de LH, 0.1U de FSH
(Izadyar y col., 1998). EL pH se ajust a 7.4. En el sistema de incubacin cerrado (SIC), los
oocitos fueron mantenidos dentro de un desecador en el que previamente se coloc agua para
producir mxima humedad y una vela encendida para la saturacin de CO2. El desecador y su
contenido se colocaron en la estufa de cultivo. Para el sistema de incubacin abierto (SIA), los
oocitos fueron mantenidos dentro de la olla provista de una vlvula de paso por la cual se
inyect el volumen de aire con el 5% de CO2. Para producir la atmsfera de humedad se coloc
agua en un recipiente dentro de la olla. La olla y su contenido se depositaron dentro de la
estufa. Ambos sistemas mantuvieron condiciones ambientales de 39 C, 5% de CO2 y mxima
humedad por 24 h (Watson y col., 2000).

Despus de 24 h, los oocitos se transfirieron a una microgota de TCM-199 en una caja de Petri.
Se lavaron empleando una pipeta Pasteur, al mismo tiempo se retiraron las clulas foliculares.
Posteriormente se transfirieron a cajas de cultivo de 4 pozos, que contienen 500 l de medio de
fertilizacin (con pH de 7.6 a 7.8). Para la fecundacin de los oocitos se incubaron a 39C, 5%
de CO2 y mxima humedad bajo los sistemas de ambiente cerrado y abierto. Para la FIV, el

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008 9

semen se deposit en un tubo cnico con dos gradientes de Percoll (90 y 45%), se centrifug a
500 rpm por 5 minutos (Merton y col., 2000), se resuspendi en 200 l de medio Esperm (con
pH de 7.4). Una vez que se colocan los oocitos en el medio de fertilizacin, se procedi a
adicionar 0.5 x 106 espermatozoides (Ward y col., 2002), 20 l de PHE (penicilamina,
hipotaurina y epinefrina) (Brackett y Zuelke, 1993) y 20 l de heparina por cada pozo. Se
incubaron oocitos y espermatozoides por 24 h (Rivera y col., 2001).

Transcurrida la fertilizacin, los oocitos se lavaron en gotas de 500 l de medio SOF (fluido
sinttico de oviducto) (Tavares y col., 2002) y se colocaron en 500 l de medio de desarrollo en
cajas de 4 pozos, suplementados con 20 % de suero bovino (Nedambale y col., 2002),
adicionado con aminocidos, 0.1 % de P/E (Thompson et al., 1998). Las condiciones de cultivo
a las que fueron sometidos los embriones por 48 h en los sistemas fueron de 38.5 C, 5% de
CO2, 95% de aire y humedad a saturacin. Una vez transcurridos los 2 das se utiliz un
microscopio invertido 75x (Nikon, Japn) para evaluar el desarrollo por el nmero de divisiones
que alcanzaron los embriones.

Las variables obtenidas se analizaron por un anlisis de varianza (Steel y Torrie, 1992), sus
diferencias mediante una prueba de Chi. En todos los casos se utiliz el paquete estadstico
SAS (1996).

Resultados

El cuadro1, muestra los folculos aspirados y los oocitos recuperados. Se observa en el SIT el
menor nmero de ovarios (79), seguido por los SIA y SIC (81 y 82 ovarios). La menor cantidad
de oocitos recuperados, correspondi al SIT (771 folculos y 502 oocitos), seguidos por los SIA
y SIC. Se muestra un promedio de recuperacin para los tres sistemas de 63,14%, asimismo,
un valor mayor de 65.11% y uno menor de 62.07% para el SIT y el SIA.

La calidad de los oocitos para los tres sistemas de PEIV se muestra en el cuadro 2, del total de
oocitos recuperados para el SIT (504), 420 pertenecieron al grupo de oocitos de buena calidad,
lo que correspondi al 83.33%. El 16.67% restante perteneci a los oocitos de calidad dos. El
porcentaje general de calidad uno, fue de 82,07%. La menor proporcin fue de 80.04% para los
oocitos del SIC. El 82.87% correspondi al SIA. De la misma forma la proporcin promedio de
calidad dos, fue de 16.74%; con una mxima de 16.83% para el SIC y un 16.73% para el SIA.

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

10
Cuadro 1: Folculos aspirados y oocitos recuperados en los tres sistemas
de produccin de embriones

Sistema de Folculos Ooccitos Porcentaje de

Ovarios
incubacin aspirados recuperados recuperacin
SIT 79 771 502 65,11
SIA 81 812 504 62,07
SIC 82 821 511 62,24
Total 242 2404 1517 63,14

Cuadro 2: Calidad de los oocitos recuperados en los tres sistemas de produccin de

embriones

Sistema de Oocitos Oocitos % Oocitos Oocitos % Oocitos

incubacin Recuperados Calidad 1 Calidad 1 Calidad 2 Calidad 2
SIT 504 420 83,33 84 16,67
SIA 502 416 82,87 84 16,73
SIC 511 409 80,04 86 16,83
Total 1517 1245 82,07 85 16,74

El cuadro 3, concentra la informacin de los oocitos madurados para los tres sistemas de PEIV.
Del total de oocitos calidad uno (416) que fueron sometidos a maduracin en el SIT, 319
lograron su maduracin, lo que represent el 74.93%. La menor proporcin de madurados
(69.87%) correspondi a los oocitos del SIC (280 de 409). Los oocitos madurados en el SIA
(317 de 420) se situaron en una posicin intermedia con 75.48%.

Cuadro 3: Oocitos madurados en los tres sistemas de produccin de embriones

Sistema de incubacin Oocitos calidad 1 Oocitos madurados % de madurados

SIT 416 319 74,93

SIA 420 317 74,68
SIC 409 280 69,87 b
Total 1245 916 73,16

a,b,c, literales distintas en la misma columna representan diferencias estadsticas (P<0.05)

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

11
Destacan los oocitos fertilizados del SIT (129 fertilizados de 319 madurados) con el 42.48% de.
La menor proporcin correspondi a los fertilizados en el SIC con el 31.12% (Ver cuadro 4). La
valoracin de la fertilizacin se realiz a las 24 h de cultivo en sus primeros estadios de divisin
o cleavage. La proporcin general de oocitos fertilizados (35.31%) del presente estudio fue
menor al 75.7, 73.6 y al 56.1% reportados por Kinis (1990), Monaghan y cols. (1993) y por
Wang (1992) respectivamente.

El cuadro 4, muestra los embriones en cleavage (289 de 325) valorados a las 24 h de cultivo.
Destacan 115 embriones de 129 oocitos fertilizados (91.14%) del SIT, comparado contra el
89.16% del SIC (76 embriones de 88 oocitos fertilizados). El SIA se ubic en una posicin
intermedia con 89.95% (95 embriones de 108 oocitos).

Cuadro 4: Oocitos fertilizados y embriones en desarrollo de los tres sistemas de produccin de

embriones

Sistema de Oocitos % de embriones en % de

incubacin fertilizados fertilizados desarrollados desarrollados

SIT 129 42,48 115 91,14

b
SIA 108 34,94 95 89,95 a
SIC 88 31,12 C 76 89,16 a
Total 325 36,18 289 90,09

a,b,c, literales distintas en la misma columna representan diferencias estadsticas (P< 0.005)

Discusin

La recuperacin de oocitos general (63,14%), se ubic por debajo de los valores obtenidos en
otros laboratorios, por ejemplo el porcentaje de 88.45 reportado por Pavlok y col. (1992). Pero
tambin, la recuperacin de oocitos de este trabajo fue mejor que el 43% obtenido por Katska
(1984). Los resultados de recuperacin de oocitos de este trabajo se ubican en el rango de 30 a
60% reportado como ptimo para diferentes laboratorios a nivel internacional por Gordon
(1994). La proporcin general de oocitos de buena calidad (82.07%) lograda en este trabajo fue
hasta 10 puntos mejor que 70.3%, reportadas por Xu y col., (1992) y aproximadamente igual al
80.0% de autores como Sato y col., (1990). Otros resultados de 29.7 y 31.3% reportados por

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

12
Iwasaki y col., (1987) y Lonergan (2007), fueron superados por los resultados obtenidos en este
trabajo. La proporcin general de oocitos madurados (73.54%) obtenida en este trabajo fue
ligeramente menor al 79.7, 75.3 y al 75.8% reportados por Monaghan y col. (1993), Vergos
(1990) y por Carolan y col. (1994). El resultado de cleavage general del presente trabajo
(90.09%) comparado con lo reportado de 57.1 y 44.4% por otros autores como Vergos (1990) y
por Wang (1990), se ubica por arriba.

Conclusin

Se demostr la posibilidad de producir embriones bajo un sistema no convencional.

Literatura Citada

Avery B., Greve T. 1992. Impact of incubator type on the yield of in vitro produced
bovine blastocysts. Acta Vet Scand; 33:341-348.

Brackett B.G., Zuelke K.A. 1993. Analysis of factors involved in the in vitro production of
bovine embryos Theriogenology:39:43-64.

Carolan, C., Monaghan, P., Gallagher, M, nad Gordon, I. 1994. Effect of recovery
method on yield of bovine oocytes per ovary and their developmental competence after
maturation, fertilization and culture in vitro. Theriogenology;41(5):1061-8.

Durnford R, Stubbings RB, Ainsworth L. 1994. Evaluation of culture systems containing
bovine oviduct epithelial cells or granulosa cells to mature and maintain the
developmental competence of bovine oocytes in vitro. Theriogenology.1;42:261-72.

Gordon J. 1994. Laboratory Production of Cattle Embryos. Cambridge University Press,
Cambridge.

Iwasaki, S., Kono, T., Nakahara, T., Shioya, Y., Fukushima M., and Hanada, A. 1987.
New Methods for the Recovery of Oocytes from Bovine Ovarian Tissue in Relation to in
vitro Maturation and Fertilization. Japan J Anim Reprod: 33,4:188-192.

Izadyar F., Colembrander B., Bevers M.M. 1997. Stimulatory effect of growth hormone
on in vitro maturation of bovine oocytes is exerted through the cyclic adenosin 3,5-
monophosphate signalin pathway Biol Reprod,:57:1484-1489.

Katska, L. 1984. Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from
slaughter cattle. Anim Reprod Sci, 7 (5), p.461-463.

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

13

Kinis, A., Vergos, E., Lonergan, P., Sharif, H., Gallagher, M. and Gordon, I. 1991. The
incidence of polyspermy and the developmental potential of bovine ova fertilized in vitro
after zona drilling. Theriogenology 35,226.

Lonergan, P. 2007. State-of-the-art embryo technologies in cattle. Soc Reprod Fertil:
Suppl.;64:315-25. Review.

Merton J.S., Oei C., Huisinhetveld U., Poelarends J., Mullaart E. 2000: Effect of semen
preparation on in vitro bovine embryo production Theriogenology, 53: 427.

Monaghan, P., Carrolan, C., Lonergan, P., Sharif, H., Wahid, H, and Gordon, I, 1993.
The effect maturation time on the subsequent in vitro development of bovine oocytes.
Theriogenology 39,270.

Nedambale T.L., Groen W., Yang X. 2002. Comparision between KSOM and SOFAACI
for in vitro-produced bovine embryos Theriogenology:57: 523.

Pavlok, A.; Lucas-Hahn, A.; Niemann, H. 1992. Fertilization and developmental
competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Mol.
Reprod. Dev.,:31: 63-67.

Rivera R.M., Hansen P.J. 2001. Development of culture bovine embryos after exposure
to high temperatures in the physiological range Reproduction:121: 107- 115.

Sato, E., Matsuo, M., and Miyamoto, H. 1990. Meiotic maturation of bovine oocytes in
vitro: improvement of meiotic competence by dibutyryl cyclic adenosine 3',5'-
monophosphate. J Anim Sci.;68(4):1182-7.

Steel, G.D.R. y Torrier, H.J., 1992. Bioestadstica Principios y procedimientos. Ed.
McGraw-Hill, Mxico, Pp. 460-461.

Tavares L.M.T., Magnuson V., Missen V.L.L., Lima A.S., Caetano H.V.A., Visintin J.A.
2002. Development of in vitro matured and fertilized bovine embryos cultured in CR2AA,
KSOMAA and SOFAA Theriogenology:57 (1): 528.

Thompson J.G., Allen N.W., McGowan L.T., Bell A.C.S., Lambert M.G., Tervit H.R. 1998.
Effect delayed supplementation of fetal calf serun to culture medium on bovine embryo
development in vitro and following transfer Theriogenology,:49:1239-1249.

Vajta, GH., Holm, P., Greve, T., Ccallensen H. 1997. The submarine incubation system,
a new tool for in vitro embryo culture. A technique report. Theriogenology, 48: 1379-
1385.

Vergos E, Kinis A, Lonerghan P, Sharif H, Gallagher M, Gordon I. 1991 The effect of
culture system on the in vitro development of bovine oocytes matured and fertilized in
vitro. Theriogenology 35,290.

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

14

Wang W, Niwa K. 1995. Synergetic effects of epidermal growth factor and gonadotropins
on the cytoplasmic maturation of pig oocytes in a serum-free medium. Zygote;3(4):345-
50.

Wang, W. L., Jiang, H. S., Lu K. H. and Gordon, I. 1990. Effect of condition medium and
glucose concentration on the in vitro development of early bovine embryos.
Theriogenology, 33 (1), 343-343.

Ward F., Enright B., Rizos D., Boland M., Lonergan P. 2002. Optimization of in vitro
bovine embryo production: effect of duration of maturation, length of gamete co-
incubation, sperm concentration and sire Theriogenology,:57:2105- 2117.

Watson A.J., De Sousa P., Caveney A., Barcroft L.C., Natale D., Urquhart J., Westhusin
M.E. 2000. Impact of bovine oocyte maturation on oocyte transcript levels, blastocyst
development, cell number and apoptosis. Biology Reproduction, 2000:62:355- 364.

Xu KP, Hill B, Betteridge KJ. 1992. Application of in vitro fertilisation techniques to obtain
calves from valuable cows after slaughter. Vet Rec. 7;130(10):204-6.

Semana de Divulgacin y Video Cientfico 2008

15