Guía de trabajo: Poniendo en práctica la clonación parte II

(acompañamiento sincrónico)

Orientaciones
Objetivo
El estudiante estará en capacidad de obtener una proteína recombinante purificada.

Conocimientos previos para desarrollar la guía

Haber desarrollado la guía de clonación parte I.

Responsables
La actividad será realizada en los mismos grupos de trabajo de la guia I.
Descripción de la actividad
En esta segunda parte, deben tener en cuenta sus respuestas de la guía anterior para resolver
las preguntas consignadas en esta guía.

Los profesores estarán disponibles en la sesión remota de Bloque Neon para resolver cualquier
tipo inquietudes.

Entregable

Una infografía que abarca todo el proceso de clonación, desde la parte 1 que hicieron en
complementaria, hasta esta parte 2 que harán en el tiempo de teoría.

Nombre: Fabio Alejandro Torres Ramos Código: 202113194

Nombre: María Camila Torres Código: 202113187
Nombre: Santiago Martinez Código: 202112005
¡Continuemos!
Una vez ustedes deciden qué enzima(s) emplear, realizan el proceso de ligación para obtener
un vector recombinante. Ustedes continúan con el proceso de transformación de E. coli. Al
revisar nuevamente su vector (ver información en la guía 1), es claro que las bacterias
transformadas deben crecer en un medio que contenga:

__Kanamicina_ como marcador de selección.

Después de cultivar las bacterias transformadas se realiza una

extracción del ADN plasmídico. Posteriormente, ustedes determinan si el proceso de clonación
fue exitoso. Para esto hacen una digestión para realizar un mapeo de restricción con la enzima
XhoI, que les permite diferenciar entre un vector vacío y uno con inserto (ver mapas y
secuencias del taller I para entender y responder). A continuación, deben presentar los
resultados obtenidos tras realizar esta digestión y una posterior electroforesis. En la
electroforesis emplean un marcador de peso que se corre en el carril 1 como se evidencia en la
figura. Deben completar el carril 2, en donde deben dibujar las bandas esperadas después de
esta digestión para el gen N. En el carril 3 deben dibujar las bandas esperadas del plásmido
vacío después de esta digestión. En el carril 4 deben mostrar el vector de expresión
recombinante correcto digerido con esta enzima de restricción.
Como ustedes obtuvieron los resultados esperados, continúan con la expresión inducida de la
proteína SARS-N etiquetada con His. Ustedes toman una única colonia de células transformadas
con el plásmido de expresión recombinante y la inoculan (siembran) en un tubo con 3 ml de
medio de cultivo especificado. Para inducir la expresión de nuestro gen agregan al medio IPTG
que cumple con la función de Eliminar el represor del operón lac para inducir la expresión génica y
actuar como inductor para iniciar la transcripción de genes en el operón (Kroemer, s. f.)
Después de la inducción durante 5h a 25 ° C, se cosechan las células por centrifugación.

El sobrenadante se desecha y el sedimento celular es sonicado. Las

células lisadas se centrifugan y el sobrenadante se filtra.

Ustedes emplean una resina quelante Ni2 + como columna para purificar
el sobrenadante debido a que en su vector ustedes contaban con Kan Sequence.
Nuestra proteína target es: ________HisTag(His6)________________

Nuestro ligando es: _____________Níquel_(II)___________________

En el paso 1 sucede: En este primer paso sucede para

comenzar el ligamiento entre la proteína de interés y
el ligando
En el paso 2 eluye: En este segundo paso lo que ocurre
es que las proteínas que no son de interés están siendo
descartadas o eluidas
En el paso 3 eluye: En este último paso se eluye
finalmente la proteína de interés.

Finalmente, ustedes analizan las fracciones eluidas por SDS-PAGE y transfirieren a una
membrana de nitrocelulosa para realizar un Western Blot. Esto con el propósito de verificar la
expresión de su proteína viral. A continuación, se presentan los resultados. En la figura A se
presentan los resultados del SDS-PAGE en donde se corrieron las fracciones eluidas de la
cromatografía. Los carriles corresponden así: 1 (sin inducir) 2 (inducido) 3 (pellet) 4
(sobrenadante) 5 (flow-through) 6 (proteína N purificada). La figura B corresponde al análisis
por western blot de la proteína purificada.
 33KD

20KD

Según los resultados el peso de su proteína de interés es de aproximadamente: de entre 33 KD

y 43 KD

De acuerdo a los resultados observados en la figura A, qué puede concluir de su proceso de

clonación y posterior purificación de la proteína de interés. ¿Funciona?
R. Si funciono el proceso de clonación y posterior purificación. Ya que, en primera instancia en
el carril 6 se puede evidenciar que la proteína N (la cual era la de interés), se puede observar
que en esta primero se evidencia claramente esta proteína, pero a su vez es la única que se
puede observar en el carril denotando la congruencia que tiene esta con la imagen B la cual es
en donde se realizó el análisis por western blot de la proteína purificada por lo cual
demostrando su correcta clonación y posterior purificación. También cabe aclarar que en los
carriles 2, 3 y 6 son en los que se puede denotar la presencia de la proteína de interés en estos
carriles, por lo cual es en estos contextos que la transcripción del gel fue posible, y a su vez se
descartan el resto de proteínas encontradas que no nos importan para este caso.
¡Están listos para realizar su infografía!

Referencias

Kroemer, T. (s. f.). ¿Cómo funciona la inducción de IPTG? | GoldBio. Home | GoldBio.
https://www.goldbio.com/articles/article/unciona-induccion-IPTG