UD3 : TÉCNICAS BASADAS EN

REACCIONES ANTÍGENO-
ANTICUERPO PRIMARIAS

RA 2. Aplica técnicas inmunológicas basadas en

reacciones antígeno-anticuerpo primarias,
diferenciando sus fundamentos.
 CONTENIDOS e
RA CE CALIFICACIÓN
INSTRUMENTOS
a) Se han clasificado los inmunoensayos atendiendo a 15% Prueba (80%)
su metodología y a los marcadores utilizados. Actividad (20%)

b) Se han detallado las técnicas inmunológicas 15%

Prueba (80%)
basadas en las reacciones antígeno-anticuerpo
Actividad (20%)
primarias.
c) Se han diferenciado las etapas de la ejecución del 15% Prueba (80%)
inmunoensayo. Actividad (20%)
d) Se han detallado los componentes del equipo y su 15% Prueba (80%)
2. Aplica
técnicas funcionamiento. Actividad (20%)
inmunológicas e) Se ha calibrado el equipo y se han procesado los 5%
basadas en Prueba (100%)
controles antes de empezar el ensayo.
reacciones
antígeno- f) Se ha verificado la correcta colocación y la retirada 5%
anticuerpo de las muestras.
primarias,
g) Se han realizado las técnicas de inmunoensayo 15%
diferenciando
sus según los protocolos establecidos.
fundamentos.
h) Se ha realizado el control, manejo y mantenimiento 5% Prácticas 6 y 7
de los equipos modulares automatizados. (ELISA y/o WB)
i) Se ha representado la curva de calibración para la 5%
cuantificación del analito.
j) Se han aplicado las normas de calidad, prevención 5%
de riesgos laborales y protección ambiental en todo el
proceso.
 ÍNDICE:
1. LAS TÉCNICAS PRIMARIAS CE a
2. ENZIMOINMUNOENSAYOS
3. FLUOROINMUNOENSAYOS
4. RADIOINMUNOENSAYOS
5. INMUNOENSAYOS CE b, c, d, e
QUIMIOLUMINISCENTES
6. INMUNOCROMATOGRAFÍA
7. TÉCNICA WESTERN BLOT
 1. LAS TÉCNICAS PRIMARIAS
Las reacciones antígeno-anticuerpo primarias no producen
manifestaciones visibles que permitan evidenciar resultados positivos,
lo cual hace necesario el uso de sistemas adicionales de revelado como
son los MARCADORES.

1.1. LOS MARCADORES

 Las moléculas que actúan como marcador en reacciones antígeno-anticuerpo
primarias se deben poder unir al antígeno o al anticuerpo complementario al
que se desea determinar, sin alterar su capacidad de unirse al anticuerpo o
al antígeno de la muestra.
 Los marcadores deben detectarse y medirse con facilidad.
 Según las características de la molécula marcadora acoplada se aplican
distintos tipos de técnicas, entre las que destacan: enzimoinmunoensayos,
fluoroinmunoensayos y radioinmunoensayos, etc.
 En los ENZIMOINMUNOENSAYOS, el marcador es una enzima. Para
detectarla y medirla se adiciona un sustrato sensible a ella; la reacción que se
producirá tendrá generalmente efectos colorimétricos detectables y
medibles.
 Los FLUOROINMUNOENSAYOS , en este caso, el marcador consiste en
moléculas de un fluorocromo que convierten la luz absorbida de alta energía en
luz de menor energía la cual se emite con un color característico.
“Cada fluorocromo tiene un espectro de emisión y excitación característico que
se puede medir".
 INMUNOCROMATOGRAFÍA: el marcador son nanopartículas coloreadas de
metales pesados.
 En los RADIOINMUNOENSAYOS, el marcador es un isótopo radiactivo. Para
determinar un antígeno se incorpora, además del anticuerpo, una cantidad
determinada del mismo antígeno marcado con un isótopo radiactivo, la
radioactividad se medirá con contador de centelleo.
Estas técnicas son peligrosas y obligan a disponer de instalaciones adecuadas para
su uso por lo que se usan muy poco en la actualidad.
 1.2. CLASIFICACIÓN DE LOS INMUNOENSAYOS
Además de la clasificación en función del tipo de marcador, para agrupar los
inmunoensayos se aplican otros criterios, como si se establece o no competencia en la
formación de inmunocomplejos o si es necesario retirar o no las moléculas que no han
formado inmunocomplejos (homogéneo y heterogéneo).

1.2.1.- No competitivos y competitivos

Según se establezca o no competencia entre moléculas para la formación de
inmunocomplejos, se distingue entre inmunoensayos no competitivos y competitivos.
 NO COMPETITIVOS: Para DETERMINAR EN LA MUESTRA PROBLEMA LA
CANTIDAD DE UN ANTÍGENO, se enfrenta a un anticuerpo marcado. En estas
técnicas el anticuerpo marcado que se utiliza para determinar un analito(antígeno),
de forma que el anticuerpo no unido sobrante debe ser eliminado. Cuanto mayor
sea la cantidad de antígeno presente, más anticuerpos marcados se unirán a él.
La cantidad de anticuerpo marcado que ha formado inmunocomplejos es
directamente proporcional a la concentración de antígeno presente en la muestra
problema.
Se puede aplicar el mismo principio para DETERMINAR UN ANTICUERPO EN LA
MUESTRA añadiendo en este caso el antígeno marcado.
El mismo fundamento se aplica para valorar un anticuerpo en una muestra, pero
trabajando con antígenos marcados.
 COMPETITIVOS. En estas técnicas, el analito problema sin marcar (
determinar el antígeno generalmente en una muestra) se mide por su
capacidad para competir con un antígeno igual pero marcado utilizado como
reactivo que se añade sobre la muestra, ya que este emite señal al formar el
ICC. El analito o antígeno (sin marcar) y el antígeno marcado compiten por un
anticuerpo específico que se encuentra en cantidades limitantes. Después se
mide la cantidad de antígeno marcado que no se ha conjugado, que será
inversamente proporcional a cantidad de antígeno presente en la muestra
(cuanto más antígeno marcado se una menos antígeno habrá en la muestra para
formar inmunocomplejo).

ANALITO: es todo lo que se mide en una prueba de

laboratorio, puede ser en Ag o el Ac
En los inmunoensayos competitivos, si quiere valorarse la presencia de un antígeno en una
muestra, se le añade el anticuerpo correspondiente y una cantidad conocida del mismo antígeno
,al que se quiere determinar, marcado denominado patrón, de manera que ambos antígenos,
marcado patrón– y no marcado ,presente en la muestra, compiten en su interacción con el
anticuerpo. Después de dejar que ocurra la reacción, se valora la cantidad de patrón que ha
quedado libre.
El mismo procedimiento se realiza para valorar un anticuerpo usando, en ese caso,
como patrón el mismo anticuerpo marcado.
1.2.2.- Homogéneos y heterogéneos
Según la técnica que se use, el resultado se puede medir de dos formas: bien
directamente (inmunoensayos homogéneos), o bien retirando del medio las
moléculas que no se han conjugado (inmunoensayos heterogéneos).

 HOMOGÉNEOS: el analito (Ac) se puede determinar sin ninguna separación física

previa entre componentes libres o sobrantes e inmunocomplejos; no requieren la
separación de los complejos no unidos de los complejos unidos y de ahí que sean más
rápidos y más fáciles de llevar a cabo que los inmunoensayos heterogéneos. Se
realiza sin necesidad de una fase sólida.

Se utilizan principalmente para

determinar sustancias de bajo
peso molecular y de
concentración relativamente
elevada, como pueden ser drogas.
 HETEROGÉNEOS. Para poder determinar el analito, los componentes libres y los
inmunocomplejos formados deben separarse físicamente. La separación entre los
inmunocomplejos formados y el resto de componentes libres se suele realizar a través
de la unión de uno de los reactivos a una fase sólida y realizando lavados para
eliminar las moléculas no conjugadas o libres.
Estas técnicas permiten determinar sustancias de alto peso molecular.

La fase sólida consiste en un soporte

sólido, que puede ser la propia pared
del tubo o de la placa de
microtitulación. La unión de uno de
los reactivos del inmunoensayo
(antígeno o anticuerpo, según la
técnica) a esta fase sólida, posibilita
su inmovilización y la posterior
separación del resto de reactivos
mediante sucesivos lavados.
 1.3. REPRESENTACIÓN DE DATOS Y RESULTADOS

Como en otras técnicas analíticas, la valoración de los inmunocomplejos puede realizarse de tres
modos:

1. VALORACIÓN CUALITATIVA: consiste, simplemente, valorar si los complejos se han formado

o no.

2. VALORACIÓN SEMICUANTITATIVA: se refiere, sobre todo, a las valoraciones de títulos de

anticuerpos ,que recuérdese, es la última dilución del suero problema en la que se verifica la
formación de inmunocomplejos o la inversa de la máx dilución que da positivo. Los títulos se
expresan en forma de fracción representativa de la dilución de muestra problema en la que se
forman los complejos. Por ejemplo, un título 625 indica que, diluido el suero problema en la
proporción 1/625, siguen formándose inmunocomplejos.

3. VALORACIÓN CUANTITATIVA: deriva de la posibilidad de formar curvas de calibración

construidas a partir de concentraciones de analitos conocidas (patrones) a las que se les asignan
datos experimentales, por ejemplo, absorbancia a una determinada longitud de onda.
Construida la curva, se estimaría la absorbancia de la muestra problema y se extrapolarían los
resultados en la curva de calibración.
Normalmente, este tipo de valoraciones las estiman equipos automatizados. Es importante que
la calibración se realice lo más cuidadosamente posible, puesto que, de lo contrario, los
resultados estimados con estos métodos estarían muy desviados de los reales
VALORACIÓN CUANTITATIVA: Curva de calibración y su utilidad para calcular la concentración
de un analito en una muestra problema
 2. ENZIMOINMUNOENSAYOS
 Los enzimoinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan ENZIMAS como
marcadores.
 Existen diversas técnicas, que podemos agrupar en las dos categorías que
muestra la tabla. A continuación se estudiarán algunas de ellas.
 2.1. INMUNOENSAYOS ENZIMÁTICOS
MULTIPLICADOS (EMIT)
Ahora ya sabes qué es un inmunoensayo homogéneo. Recuerda que en este tipo de técnicas, el
analito y todos los demás componentes de la reacción están juntos hasta que finaliza la
determinación ya que no se realiza separación de las moléculas no ligadas.
El EMIT es un enzimoinmunoensayo homogéneo competitivo que se suele aplicar para
determinar HAPTENOS. Para ello se utilizan como reactivo el hapteno de la muestra que se
quiere determinar Y el hapteno conjugado con una enzima. Posteriormente se detecta a
través de una reacción enzimática usando un SUSTRATO que da lugar a un producto y a un
cambio en la absorbancia.

Un SUSTRATO es una molécula

sobre la cual actúa una enzima.
HAPTENO: Sustancia capaz de El sustrato se une al sitio activo
reaccionar específicamente con de la enzima, formando un
anticuerpos, se trata de un complejo enzima-sustrato. Por
antígeno , pero que carece de acción de la enzima, el sustrato
inmunogenicidad por sí mismo, se transforma en un producto
adquiriéndola por medio de la unión a
un transportador que suele ser la
albúbina sérica. Se trata de
moléculas pequeñas con un único
determinante antigénico
 La técnica se basa en que el hapteno de la muestra y el hapteno conjugado,
COMPITEN por el anticuerpo específico que se encuentra en una cantidad limitante,
de forma que éste siempre queda saturado por el hapteno.
La unión del conjugado (hapteno-enzima) con el anticuerpo impide la reacción del
enzima con su sustrato porque se dificulta la formación del complejo hapteno-enzima-
sustrato .
Cuanto más hapteno haya en la muestra problema, quedará más conjugado (hapteno-
enzima) libre que no habrá podido reaccionar con el anticuerpo porque la mayor parte
de anticuerpo ya habrá reaccionado con el hapteno de la muestra. En estas condiciones
predominará la reacción del conjugado hapteno-enzima con el sustrato, es decir habrá
más actividad enzimática y aumentará la absorbancia

Se emplea comúnmente para

la determinación de drogas y
de ciertas proteínas en el
suero y en la orina, por lo que
el analito es por lo general un
antígeno.
La reacción inmunológica tiene lugar en un medio líquido (ensayos homogéneos) y se
basa en una reacción de enlace competitivo entre el antígeno de la muestra y el mismo
antígeno marcado con una enzima:
 Cuando el antígeno marcado (con la enzima) forma un inmunocomplejo (Ag-Ac)
con el Ac, la enzima que lleva unida se inactiva (impedimento estérico) debido al
cambio de configuración y da poco color.
 Cuando el antígeno marcado no se combina, la enzima se mantiene activa y
reacciona con su sustrato, generando un producto coloreado (mucho color).

Si el hapteno de la muestra
se une al Ac, queda libre el
hapteno conjugado y se
une al sustrato. En estas
condiciones existe más
actividad enzimática y
mayor absorbancia .
2.2. ENSAYO DE INMUNOADSORCIÓN LIGADO A
ENZIMAS (ELISA) «más utilizado»
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) utilizan enzimas como marcadores de anticuerpos o de antígenos. Estas técnicas han
tenido como consecuencia la aparición de numerosos métodos capaces de reemplazar a los
métodos que utilizaban otros marcadores, como los fluorocromos o los isótopos radiactivos.
«LA MAYOR PARTE DE INMUNOENSAYOS REALIZADOS SON HETEROGÉNEOS»

Este tipo de técnicas constan de tres pasos

principales:
• Reacción entre el antígeno y el anticuerpo
específico. Uno de los dos componentes de la
reacción está marcado con un enzima, por tanto
también lo estará el inmunocomplejo formado.
• Revelado, es decir la adición de un sustrato
específico del enzima (cromógeno) que generará
un producto coloreado.
• Lectura por espectrofotometría del producto
final coloreado y cálculo de la concentración del
analito a partir de los datos obtenidos.
 CARACTERÍSTICAS GENERALES
Uno de los componentes de la reacción (antígeno o anticuerpo) está
marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (técnica
heterogénea). De esta forma, la reacción antígeno- anticuerpo queda
inmovilizada en el soporte y puede ser fácilmente revelada mediante la
adición de un sustrato específico que tras la actuación de la enzima
produce un color observable a simple vista o cuantificable mediante el
uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
 EL SOPORTE
El soporte debe ser inmunoadsorbente. Uno de los más habituales son
las microplacas de poliestireno.

Placas de ELISA y
esquema de una placa de
ELISA.
 LAS ENZIMAS
Las enzimas más utilizadas para marcar antígenos o anticuerpos en las reacciones de
ELISA son la fosfatasa alcalina, la peroxidasa y la β-galactosidasa.
- Dos propiedades de las enzimas que es necesario tener en cuenta son:
 EL IMPEDIMENTO ESTÉRICO. La enzima se debe unir a un antígeno o a un
anticuerpo, y tras esta conjugación ambas moléculas deben mantener su actividad:
el antígeno o el anticuerpo tienen que ser capaces de formar inmunocomplejos, y
la enzima de unirse a su sustrato. Si alguna de las moléculas es muy grande o dos
puntos de unión están muy próximos, se produce un impedimento estérico que
hace imposible alguna de las reacciones.
Debido a su tamaño, la β-galactosidasa, causa con frecuencia impedimento estérico.
 LA RELACIÓN DE CONJUGACIÓN. Cuantas más moléculas de enzimas se puedan
conjugar con cada molécula de anticuerpo, mayor será la intensidad de la señal.

 EL SUSTRATO
Se usan sustratos cromogénicos (cromógenos), que son compuestos incoloros
inicialmente y se colorean de forma evidente después de la reacción enzimática. Para
cuantificar la reacción se mide la variación de densidad óptica que se produce.
Uno de los cromógenos más utilizado en las técnicas de ELISA es la
ortofenilendiamina.
Placas de ELISA reveladas con ortofenilendiamina.
 Hay que tener en cuenta que este primer paso
de tapizado muchas veces se ahorra ya que las
casa comerciales tienen los kits preparados ya
con las placas recubiertas de Ag o Ac.

 Operaciones básicas de las técnicas ELISA

Hay una serie de pasos comunes a las distintas técnicas ELISA:
1. El tapizado. Es la adsorción de los antígenos o anticuerpos, en el soporte (micoplacas de
poliestireno). El método más común consiste en diluirlos en tampón carbonato a pH 9,6,
colocar la dilución sobre el soporte e incubar durante 3h a 37 °C o 16 h a 4 °C.
2. El bloqueo o postapizado, se realiza porque los inmunoensayos en fase sólida, como el
ELISA, implican la inmovilización de ciertas proteínas a la superficie de la fase sólida
(sensibilización) para evitar que algunas moléculas de las soluciones
de inmunorreactivo también puedan unirse inespecíficamente a puntos no ocupados de
la fase sólida influyendo en la especificidad y en la sensibilidad de los resultados. Se
hace mediante la adición de una proteína como BSA (albúmina sérica bovina).

La unión inespecífica del inmunorreactivo a la fase sólida se puede traducir en un aumento del ruido de
fondo (background) si está el proceso automatizado o incluso en un falso positivo.
3. La conjugación. Es la unión de los antígenos o anticuerpos con la enzima (peroxidasa y
fosfatasa alcalina) que actúa como marcador.
4. Las incubaciones y los lavados. En distintas fases se adicionan anticuerpos y/o
antígenos para que, si su molécula complementaria está fijada al soporte, se formen
inmunocomplejos que a su vez queden fijados. Los anticuerpos y/o antígenos sobrantes se
eliminan mediante lavados. Como solución de lavado se suele usar solución salina o PBS
«tampón fosfato salino» con Tween 20.
La solución de lavado debe ser un tampón fisiológico que no
interfiera con la actividad inmunológica ni enzimática, y debe
contener detergente para ayudar en la eliminación de la
proteína no unida.
El volumen de solución de lavado dispensado en cada pocillo ha VER:
https://www.youtube.com/watch?v=
de ser el necesario para cubrir totalmente la superficie h-CPhUmR9pI
recubierta con antígeno o anticuerpo.
Los pocillos deben ser lavados entre tres y cinco veces.
El mejor método para la eliminación de la solución de lavado
es la decantación manual.

Para todas las técnicas de ELISA, la etapa final para visualizar la reacción antígeno-
anticuerpo, es la adición de un sustrato cromogénico que en presencia del enzima dará
lugar a un producto soluble coloreado que se valora con un espectrofotómetro o con
un lector de microplacas de ELISA.
Lector de placas.
 TIPOS DE ELISA

a) ELISA DIRECTO: es la forma más básica de realizar la técnica. Consiste en recoger una
muestra a estudiar y ponerla en un pocillo (un recipiente pequeño) , a continuación, en otro
pocillo una muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y finalmente en otro
pocillo otra muestra en la que se sabe que no hay germen. Se aplica el anticuerpo marcado con
la enzima en los tres pocillos y se compara la muestra a estudiar con las otras dos para poder
interpretar el resultado.
Este tipo de técnica ELISA no se suele utilizar como método de rutina en el diagnóstico clínico
porque precisa de la sensibilización de las microplacas con la muestra problema, por ejemplo el
suero de un paciente y además es un proceso que necesita de largos períodos de incubación y
de concentraciones elevadas de analito en la muestra.
b) ELISA INDIRECTO “para detectar Ac en una solución problema, ya que las microplacas
están sensibilizadas con el Ag”

La técnica se puede realizar sobre una microplaca sensibilizada con el antígeno contra el que va
dirigido el anticuerpo (analito) que se quiere determinar en el suero. Este antígeno también se
denomina antígeno de captura.
Para poder detectar la presencia del anticuerpo (analito), se utiliza una anti-Ig humana, es
decir un anticuerpo dirigido contra las inmunoglobulinas humanas obtenido en un
animal inmunizado. Este segundo anticuerpo también se denomina anticuerpo secundario y se
emplea conjugado a un enzima.
De esa forma, la señal que emite el enzima es mucho más potente y la prueba es más sensible.

VER: https://www.youtube.com/watch?v=RRbuz3VQ100
Como ya sabes, el ELISA indirecto permite detectar anticuerpos ya que las microplacas
están sensibilizadas con los correspondientes antígenos. Entonces, ¿cómo se pueden
determinar antígenos? Comprenderás que en estos casos las microplacas se deben
sensibilizar con los anticuerpos específicos, este es el diseño del ELISA sándwich, una
técnica utilizada para detectar antígenos en una solución problema.

c) ELISA TIPO SÁNDWICH “detectar Ag en una solución problema” en este caso en los
pocillos primero se añade un anticuerpo y después la muestra, para que los antígenos
queden ya retenidos en el fondo del pozo. Después se añade el anticuerpo secundario con la
enzima. Es la forma más eficaz de realizar la prueba.

VER:
https://www.youtube.com/
watch?v=FmVV4e8evc8
 3. FLUOROINMUNOENSAYOS
Los fluoroinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan como marcadores
sustancias capaces de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía
radiante. La modalidad más usada es la inmunofluorescencia.

3.1. TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA

En esta técnica, la visualización del complejo antígeno-anticuerpo no es inmediata,
sino que se lleva a cabo por intervención de sustancias fluorescentes acopladas a
un anticuerpo o a un antígeno, que recibe el nombre genérico de conjugado
fluorescente.

Hay dos modalidades:

 La inmunofluorescencia directa (IFD). Se añade la solución de
anticuerpo fluoresceinado sobre el antígeno, el cual ha sido
previamente fijado sobre un portaobjetos o placa, se incuba y se lava y
se leen los resultados.
 La inmunofluorescencia indirecta (IFI). El anticuerpo o suero problema se
aplica sobre el antígeno fijado, se lava y luego se añade un anti-anticuerpo
fluoresceinado (secundario) contra las inmunoglobulinas del primero, se
lava y se leen los resultados.
Esquema de la reacción de inmunofluorescencia: (a) directa; (b) indirecta.
 4. RADIOINMUNOENSAYOS (RAI)
Los radioinmunoensayos (RIA) son inmunoensayos que utilizan isótopos radiactivos como
marcadores, la molécula marcada se denomina trazador. Se trata de técnicas que presentan
inconvenientes como por ejemplo la propia manipulación de marcadores radiactivos y los
problemas de eliminación de residuos radioactivos.
Por tanto, progresivamente van siendo desplazadas por técnicas que utilizan otros
marcadores, pero aún son técnicas importantes en endocrinología (hormonas) para determinar
hormonas que se encuentran en bajas concentraciones
El principio general de estas
técnicas es la inhibición
competitiva de la unión de un
antígeno radiactivo (trazador) a
su anticuerpo específico por
parte del antígeno no marcado.
La cantidad de trazador libre se
determina mediante recuento en
un contador de centelleo líquido
o en un contador gamma que mide
el tipo de radiación emitida.
Los isótopos radioactivos más
utilizados son los del yodo: 125I
y

131I.

Los radioinmunoensayos se pueden realizar en fase líquida o en fase sólida:

• RIA EN FASE LÍQUIDA: se usa para determinar Ag en la muestra.

• RIA EN FASE SÓLIDA: se usa para determinar Ac en la muestra.
 5. INMUNOENSAYOS
QUIMIOLUMINISCENTES
Los inmunoensayos quimioluminiscentes utilizan sustratos quimioluminiscentes que
emiten luz cuando se da la reacción enzimática.
La emisión quimioluminiscente se mide mediante un espectrofotómetro de quimioluminiscencia
molecular o luminómetro. Esta técnica es más sensible que las reacciones colorimétricas.

La quimioluminiscencia se podría definir como la

producción química de luz visible. Los marcadores
quimioluminiscentes emiten luz como resultado de una
reacción química en la que uno de los productos
intermedios se excita y vuelve al estado fundamental
emitiendo luz.
En la actualidad los más utilizados para esta técnica son,
por ejemplo, el luminol y los ésteres de acridina que se
conjugan con el Antígeno o Anticuerpo.
 6. Inmuno-cromatografías
Es una prueba de un solo paso o test rápido. Es un tipo de inmunoensayo en que se usan como
marcador «nanopartículas coloreadas» normalmente estos son metales pesados. De tal manera
que por ejemplo, el Ac marcado con nanopartículas de oro generará bandas de color rosa, o el
marcado con nanopartículas de selenio coloidal, generará partículas de color azul.

La inmunocromatografía se basa en hacer migrar una muestra a través de una membrana de

nitrocelulosa dispuesta en forma de tira. En la tira de nitrocelulosa hay cinco zonas:

1ªZona de siembra de la muestra

2.ªZona del conjugado (Ac marcado)
3ªZona de detección: está formada por un reactivo para detectar la reacción Ag-Ac marcado. En
esta zona se va a observar una banda o línea si en la muestra está
presente el Ag buscado.
4ªZona de control
5ªRegión absorbente
Procedimiento para detectar Ag:

1.Colocar la muestra con el antígeno que se va a analizar en la zona de siembra de la tira de

nitrocelulosa.

2.Dejar que la muestra fluya por capilaridad:

Llega a la zona del conjugado, en la cual se encuentra inmovilizado el conjugado (anticuerpo
específico marcado). Si en la muestra hay antígenos se formarán inmunocomplejos.
Los inmunocomplejos formados siguen migrando por la tira de nitrocelulosa hasta la zona de
detección, en la cual se hallan fijados anticuerpos específicos contra otro epitopo del antígeno en
estudio. Los inmunocomplejos quedan fijados a los anticuerpos, formando una banda coloreada,
rosa o azul dependiendo del conjugado.
La muestra sigue fluyendo por capilaridad hasta la zona de control. El exceso de conjugado será
capturado por un Ac anticonjugado y se formará una banda coloreada.

3.Realizar la lectura:
• Si en la zona de detección se forma una banda coloreada (rosa o azul, dependiendo del
conjugado) es porque los antígenos en estudio están presentes en la muestra.
• Si en la zona de control se forma una banda coloreada es porque el exceso de conjugado ha
llegado hasta ella. Este control indica que la prueba se ha realizado correctamente.
VER: https://www.youtube.com/watch?v=98H_FduFZHY
7. TÉCNICA DE WESTERN BLOT
Método de detección de proteínas separadas por electroforesis mediante su unión
a anticuerpos específicos. La particularidad de esta técnica es que se basa en la
transferencia de las proteínas separadas, desde el soporte de la electroforesis a
una membrana, generalmente de nitrocelulosa.
Consta de tres fases:

 1.Separación de las proteínas (por tamaño), generalmente mediante una

electroforesis
 2.Transferencia de las proteínas separadas a un soporte sólido, en que tiene
lugar la inmunorreacción.
 3.Reconocimiento de las proteínas mediante una técnica inmunoenzimática.

El Western blot se puede utilizar para detectar anticuerpos anti-VIH en muestras de suero
humano.
VER:
https://www.youtube.com/watch?v=VgAuZ6dBOfs
Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso
molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis
existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para
poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión
antígeno-anticuerpo por actividad enzimática o fluorescencia, entre otros métodos

Resultado del Western blot: una membrana con las proteínas separadas en la electroforesis unidas,
de las que sólo se disciernen aquellas contra las se ha añadido un anticuerpo
La fuente de electroforesis durante el proceso de transferencia.
Esquema de la técnica western blot.