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PURIFICACION DE PROTEINAS

La siguiente tabla indica los pesos moleculares y el valor del punto isoelctrico de varias
protenas a las que se hace referencia en los problesmas de esta seccin.

Tabla 1. Propiedades fisicoqumicas de algunas protenas.
Nombre de la protena pI P.M. (kd)
Ovoalbmina 4.5 45
Seroalbmina (humana) 4.9 69
Ureasa (Canavalis enziformes) 5 483
-lactoalbmina (cabra) 5.2 37
g-Globulina 6.6 120
Hemoglobina (Humana) 6.8 65
Mioglobina (corazn de equino) 7 17
Quimitripsingeno (Bovino) 9.6 23
Citocromo c (corazn de
Bovino)
10.65 13
Lisozima 11 nd
Virus del Mosaico del tabaco nd 40,590
Catalasa (rbano) nd 222
Aldolasa nd 149
Miosina (Bacalao) nd 525
Fibringeno (humano) nd 340

1.- La siguiente lista de reactivos incluye muchos compuestos que se emplean normalmente
para investigar la estructura y propiedades de las protenas:
CNBr Azul de Coomasie 6N.HCl @ 90C
|-mercaptoetanol Ninhidrina Tripsina
Fenilisotiocianato Quimotripsina dodecil sulfato (SDS)
Acril/Bisacrilamida Iodoacetamida o cido perfrmico
Elija de esta lista los reactivos que empleara en los siguientes casos y diga cmo empleara
cada uno de ellos para dicho propsito.
a) Se desea determinar el peso molecular de las subunidades de una protena mediante un
tcnica electrofortica.
b) Se desea cortar una protena en fragmentos pequeos para poder estudiarla.
c) Se desea degradar una polipptido de la protena en sus componentes aminoacdicos para
luego analizar la proporcin que la cadena estudiada contiene de cada uno de ellos.
d) Se desea obtener la secuencia de aminocidos de uno de los pptidos obtenidos a partir
de la digestin de una protena.
SOLUCION
a) Para Separar las protenas por medio de electroforesis es necesario usar un
soporte que permita que las molculas separadas no se mezclen nuevamente y
puedan identificarse mediante alguna tcnina de revelado, como puede ser la
tincin con azul ce Coomasie. Para ello se emplean soportes como la Agarosa y
la Acrilamida/bis acrilamida. En el caso de las protenas, el soporte ms
conveniente es este ltimo. La malla del gel permite que las molculas al
avanzar, empujadas en el campo elctrico, gracias a su carga elctrica, sean
"frenadas" en funcin de su tamao y forma. De modo que la electroforesis en
gel permite separar molculas mediante una combinacin de su carga y de su
masa.
Ahora, debido a que queremos separar las subunidades, debemos debilitar las
interacciones covalentes y no covalentes que las mantienen unidas, tales como
los punetes de disulfuro, las interacciones hidrofbicas, los puentes de
hidrgenos, las interaciones inicas y las llamadas fuerzas de Van der Walls.
Para ello basta con agragar un detergente, que reemplaza las interacciones
hidrofbicas protena-protena, por interacciones detergente-protena, al hacer
esto, expone al solvente gran parte del interior de la protena y esto permite que
se formen puentes de hidrgeno con el agua y que se solvaten los grupos
cargados. Para romper los puentes de disulfuro que pudiesen existir, es necesario
reducir estos enlaces para formar dos sulfhidrilos. Los compuestos tales como el
2-mercaptoetanol (2ME), el 2,3-dimercaptopropanol (BAL), el dithioeritritol
(DTE), el dithitreitol (DTT), y el Tris (2-carboxietil) fosfito (TCEP), son
reductores que pueden emplearse bajo diferentes condiciones, siendo el primero
el ms dbil (se emplea en caliente) y el ltimo el ms fuerte. En estas
condiciones, la carga negativa del SDS hace casi uniforme la relacin carga/masa
de las protenas, de modo que la separacin depende casi enteramente del tamao
y la forma.
En resumen, necesitamos Acrfialmida/biscarilamida, Azul de Coomasie, 2-
mercaptoetanol y SDS.
b) Para partir una cadena polipeptdica en fragmentos pueden emplearse mtodos
qumicos o mtodos enzimticos, que pueden romper enlaces peptdicos en los
que participan aminocidos especficos. Entre los primeros est el Bromuo de
ciangeno (CNBr) y entre los segundos se encuentras las endoproteinasas como
la quimotrispsina.
c) Si desaemos digerir una cadena hasta aminocidos para luego determinar la
composicin de la misma, podemos emplear HCL 6N @ 90 oC, lo que a lo largo
de varias horas (24-72h) resultar en una ruptura completa de los enlaces
peptdicos que forman el pptido. Los aminocidos pueden analizarse
separandolos mediante cromatografa de fase reversa (HPLC), cromatografa de
intercambio inico cromatografa de capa fina. Los picos de aminocidos
pueden detectarse mecdiante su reaccin con el reactivo de ninhidrina. Para
evitar que los grupos SH se oxiden a disulfuros, y dificulten la digestin, se
emplea cido perfrmico para oxidarlos a cido cisteico o iodoacetamina, para
formar el derivado S-alqulico correspondiente.
d) Finalmente, si lo que se desea es determinar la secuencia de aminocidos de la
protena, debe emplearse un mtodo que permita digerir uno a uno los
aminciods. Esto puede hacerse mediante la degradacin de EDMAN, que
emplea el fenilisotiocianato y determina las feniltiohidantoinas de los
aminocidos en el extremo aminoterminal, como l pptido digerido es ahora un
aminocido ms corto, al repetirse el proceso se determina el segundo
aminocido y as sucesivamente.

2.- En una electroforesis desnaturalizante (segn Laemmli) se obtuvieron las movilidades
relativas siguientes:

Ovoalbmina, 0.39; |-lactoalbmina, 0.46; Mioglobina, 0.66; Lisozima, 0.58.

De acuerdo con los datos de la tabla 1 calcule el peso molecular de la lisozima.
SOLUCION
En la electroforesis desnaturalizante, el logaritmo del peso molecular observa
una relacin aproximadamente lineal (negativa) con la mobilidad relativa.
Haciendouna grfica semilogartmica del peso de los marcadores vs. su
mobilidad relativa, se puede interpolar el valor del peso molecular de la lisozima,
que segn se ve en la figra siguiente es de 26 KDa.







3.-Un investigador estaba tratando de purificar la acetilcolinesterasa de cerebro de rata por
medio de diversas tcnicas. l report sus datos en la siguiente tabla pero omiti calcular
algunos valores tiles.
Paso de purificacin Actividad
total
(mol/min)
Proteina
total (g)
Homogenizado de tejido fresco. 556.7 33,340.0
Precipitacin con (NH
4
)
2
SO
4
556.7 1,070.0
DEAE-celulosa 289.5 124.0
concentracin y dalisis 278.4 115.0
sephadex-G200 233.8 56.0
Cellex-P (intercambio 139.2 55.4
catinico)
DEAE-celulosa 89.1 11.3
DEAE-sephadex 66.8 11.1
cromatografa de afinidad 46.8 4.8

a) Complete la tabla agregando las columnas de actividad especfica y el rendimiento
obtenido luego de cada paso de la purificacin.
b) Analice los resultados de la tabla y, tomando en cuenta aquellos pasos que no
contribuyeron a la purificacin, sugiera mejoras al procedimiento.
c) explique el razonamiento que apoya sus propuestas.

SOLUCION
a) En este problema se nos pide completar la tabla de purificacin aadiendo las
columnas de actividad especfica, las veces de purificacin y el rendimiento
obtenido en cada paso. Aqu, hay que ver que significan las dos columnas que
nos dan y que informacin se nos pide.
Primero, la columna de "actividad total" expresa cuanta de la enzima que se
desea purificar est presente en cada paso; la segunda columna expresa cuantas
protenas de entre el total de ellas, la que nos interesa incluida, estn siendo
recobradas con cada paso de purificacin.
Es evidente que deseamos obtener lo ms posible de la acetilcolinesterasa, al
tiempo que recobremos tan pocas de las otras protenas como sea posible. As, la
actividad especfica es el cociente entre la actividad total y la cantidad total de
protena presente en esa preparacin. Este valor ser mayor si se recupera ms
acetilcolinesterasa y menos de otras protenas. Para la acetilcolinesterasa 100%
pura, este valor alcanzar un nmero constante, ya que al no haber contaminantes
ya no ser posible eliminar protena sin que desaparezca la actividad
correspondiente a la enzima perdida. El valor se obtiene smplemente dividiendo
el valor de la celda en la columna 1 por el valor de la columna 2 correspondiente
a la misma fila (vease la tabla ms abajo).
Luego, para calcular las veces de purificacin, bastar considerar que entre ms
pura est la protena, mayor su actividad especfica, de manera que si dividimos
la actividad especfica recuperada en cada paso por la que encontramos en la
preparacin original, sabremos cuantas veces se ha enriquecido nuestra
preparacin en colinesterasa, con respecto a otras protenas. Es decir dividimos el
valor de cada celda en la columna 3 de la tabla inferior, por el valor de la primera
celda en esa misma columna, evidentemente el valor de la primera fila ser igual
a la unidad, porque ah la enzima conserva la pureza correspondiente al extracto
original, puesto que no ha sido tratada.
Finalmente, la ltima columna corresponde al rendimiento, es decir cuanto del
componente que se intenta purificar se est recobrando en cada paso, aqu basta
referirnos a la actividad total recuperada de la columna 1, ya que este es el valor
que cuantifica componente deseado. As, expresando el valor de cada una de
estas celdas como porcentaje del valor presente en el extracto crudo (es decir la
fila 1 de esta columna), se genera la columna 5.
Paso de purificacin
Actividad total
(mol/min)
Protena
total (g)
Actividad
especfica
mol/(min mg)
Veces de
purificacin
Rendimiento
(%)
Homogenizado de tejido fresco. 556.7 33340 1.67 1 100
Precipitacin con (NH4)2SO4 556.7 1070 52.03 31.16 100
DEAE-celulosa 289.5 124 233.47 139.82 52
concentracin y dalisis 278.4 115 242.09 144.98 50.01
sephadex-G200 233.8 56 417.5 250.04 42
Cellex-P (intercambio catinico) 139.2 55.4 251.26 150.48 25
DEAE-celulosa 89.1 11.3 788.5 472.22 16.01
DEAE-sephadex 66.8 11.1 601.8 360.41 12
cromatografa de afinidad 46.8 4.8 975 583.91 8.41
b y c) Al analizar la tabla se observa que hay varios pasos en los que se obtiene
un rendimiento razonable con respecto al paso anterior y adems hay una
ganancia en la veces de purificacin. En particular, La precipitacin con sulfato
de amonio mejora la pureza 31 veces y nos d un rendimiento del 100%, la
DEAE celulosa permite incrementar la pureza, aunque se pierde bastante
actividad. La concentracin y dilisis es un paso que no aade nada, pero
tampoco se pierde la protena y que es necesario para poder aplicar la muestra a
la siguiente columna. El paso de filtracin en gel por sephadex G200 mejora la
pureza y mantiene un buen rendimiento. El paso de intercambio catinico
siguiente, es malo, porque se pierde bastante actividad y se recupera con menos
pureza de la que se tena. La siguiente cromatografa repite el paso de DEAE-
cellulosa, que a pesar de todo representa una mejora con respeto a la protena
obtenida del paso de filtracin, sin embargo, otro paso de ms intercambio
aninico (DEAE-suphadex, mismo grupo qumico, diferente soporte inerte) no
mejora ms la pureza, sino que incluso hay cierta perdida de pureza y de
actividad. Finalmente, el paso de cromatografa de afinidad si es bueno, ya que se
recupera una protena 900 veces ms pura que la original y el rendimento pasa
tan slo de 12 a 8.4 %, es decir casi 60% de lo aplicado a este ltimo paso. En
resumen, sera conveniente eliminar los pasos de Cellex-P y DEAE-sephadex
(letra magenta, fondo amarillo), con lo cual, en teora, sera posible obtener una
protena de pureza semejante, con menos trabajo y con una mejora en el
rendimiento final.
4.- A que pH sera ms eficaz una electroforesis nativa (sin desnaturalizantes) de las
siguientes mezclas de protenas: a) Seroalbmina y Hemoglobina; b) mioglobina y
quimotripsingeno; c) ovoalbmina, seroalbmina y ureasa (ver tabla 1).

SOLUCION
La respuesta a este problema se puede dar a partir de la siguiente consideracin:
En un campo electrofortico las molculas nativas de protena se moveran en
hacia el electrodo de cargo opuesta a la propia, de modo que se elegimos un pH
con intermedio entre el punto isoelctrico de ambas protenas, cada una se
mover hacia un polo diferente, aquella con un pI inferior al pH poseer carga
negativa y se mover hacia el nodo (polo positivo) y aquella con el pI superior
al pH tendr carga negativa y se mover al ctodo (polo negativo). De este modo,
al moverse en direcciones opuestas, la separacin ser ptima. En el tercer caso,
como se trata de 3 protenas, podemos elegir un pH igual al pI de la que tenga un
valor intermedio, entonces, una se mover hacia el ctodo, otra hacia el nodo y
la de pI intermedio no se mover.
a) Seroalbmina pI 4.5 y Hemoglobina pI 6.8, pH recomendado 5.65
b) Mioglobina pI 7 y Quimotripsingeno pI 9.6, pH recomendado 8.3
c) Ovoalbmina pI 4.5 , Seroalbmina pI 4.9 y Ureasa pI 5, pH recomendable
4.9. En relidad esta es un pregunta capciosa, ya que debido a la cercana entre los
puntos isoelctricos de la seroalbmina y la ureasa, esta seran muy difciles de
separar, pero el valor ptimo para el pH seguira siendo 4.9.

5.-Prediga la secuencia con la eluiran las siguientes protenas de una columna de filtracin
en gel con un rango de exclusin de 5,000 a 400,000 daltones: Mioglobina, catalasa,
citocromo c, miosina, quimotripsingeno y seroalbmina (ver tabla 1).


SOLUCION
En la cromatografa de exclusin molecular, las protenas son separadas en
funcin de su peso molecular. Las molculas de mayor tamao son excludas de
la resina y son eludas con poco volumen, pero las de menor peso molecular son
retenidas y se requiere de mayor volumen de eluyente para lavarlas. Por tanto el
orde de elucin, comenzando por la que eluyen primero sera: Miosina (525),
catalasa (222), seroalbmina (69), quimotripsingeno (23), Mioglobina (17), citocromo c
(13). El nmeor entre parntesis indica el peso molecular el miles de daltons.

6.- Calcule el peso molecular aproximado de la lisozima nativa a partir de los siguientes
volumenes de elucin obtenidos en la columna del problema anterior (vertabla 1):
Citocromo c, 118; |-lactoalbmina, 58; Hemoglobina, 24; Lisozima, 83 ml.
SOLUCION
Este problema se puede resolver de manera semejante al problema 2, ya que el
logaritmo del peso molecular vara linealmente (pero en forma negativa) con el
volumen de elucin. El resultado se muestra en la figura siguiente, en la que se
v que la Lisozima posee un peso molecular aproximado de 24 KDa en su forma
nativa.


7.- Con los datos de los problemas 2 y 7 Qu puede decir acerca de la estructura
cuaternaria de la lizozima? - Explique su respuesta.

SOLUCION
El problema 5 nos dice que la lisozima posee un peso molecular en forma nativa
de 24 KDa y en su forma desnaturalizada el peso molecular fue de 26 KDa. La
diferencia puede atribuirse a la impresicin de los mtodos y tambin al hecho
de que una protena desnaturalizada, al estar ms expuesta al solvente, tiene
una forma ms "abultada" y sufre mayor friccin con el gel y el solvente en su
movimiento electrofortico. De modo que podemos concluir que la lisozima es
una protena monomrica con un peso de 24-26 Kda, o sea que no posee
estructura cuaternaria.


1. Problemas sobre el comportamiento cintico de las enzimas
1-Orden de reaccin. La enzima Glicerol-3 fosfato deshidrogenasa se inactiva
irreversiblemente en presencia de ciclohehanediona con una cintica aparente de primer
orden. Sin embargo, cuando se vara la concentracin del agente inactivante en la cubeta se
observa que la cintica se modifica. Explique este resultado calcule el valor real de la
constante de velocidad de la reaccin.
[CHD] (mM) 0.2 1
t (min) + Enzima
activa
remanente
(%)
0 100.0 100.0
10 92.2 77.8
20 93.9 56.8
30 88.4 46.3
40 76.2 36.6
60 72.1 20.4
90 60.8 9.1
120 54.6 4.3
Sugerencias:
a)Demuestre que la cintica de inactivacin es de primer orden aparente y calcular la
constante de primer orden y la vida media (no olvide las unidades).
b)Determine si la constante de primer orden vara con la concentracin del reactante CHD y
escriba una expresin para la velocidad que incluya a todos los reactantes.
c) A partir de esta ecuacin identifique que es lo que vara en cada experimento y lo que se
mantiene constante y diga porque la cintica aparece como si fuese de primer orden.
SOLUCIN
En este problema se nos pide analizar como progresa la inactivacin de una
enzima en el tiempo. Aqu, la ciclohexanodiona (CHD) es un reactivo que
modifica qumicamente con la enzima y el producto de esta reaccin es una
protena que pierde su actividad enzimtica original. Por tanto, en este
experimento, la enzima es un reactante y su actividad enzimtica es el recurso
metodolgico que sirve para evaluar la concentracin remanente de protena no
modificada por la CHD, en cada uno de los tiempos muestreados.
Se puede determinar si la reaccin qumica es de primer orden, o se encuentra en
condiciones tales que progresa como si lo fuese (aunque estrctamente no lo sea);
ello gracias a que la reacciones con cintica de primer orden (o de pseudoprimer
orden) muestran una relacin lineal entre el logaritmo natural de la concentracin
de reactante remanente y el tiempo transcurrido. De modo que, si obtenemos los
logartmos de los valores de concentracin de la enzima remanente (no importa
que se trate de un porcentaje) resultan las siguientes grficas.


La figura superior muestra la grfica logartmica, en la que se puede observar que
ambos conjuntos de puntos describen razonablemente una recta, no as en la
grfica directa de [E] vs. tiempo (panel inferior). Este resultado indica que la
inactivacin observada sigue una cintica de primer orden con respecto a la
concentracin de enzima en la condiciones empleadas. Las pendientes de estas
lneas son numricamente iguales a las constantes de primer orden, o de
pseudoprimerorden, pero con signo negativo, de modo que basta cambiar el signo
para determinar el valor de las constantes buscadas.
Note que ambas rectas presentan pendientes muy distintas, esto significa que la
concentracin de CHD si tiene un efecto sobre la velocidad de la reaccin
annque, en las condiciones experimentales empleadas, este efecto no se
manifiesta en los 120 minutos que dura el experimento; posblemente porque este
reactivo se encuentra en gran exceso. Sin embargo, una expresin correcta para la
velocidad de la reaccin debera incluir ambos reactantes y la ley de velocidad
indicara que el orden de reaccin es superior a 1 (uno para la enzima y no
sabemos exactamente cuanto para la CHD).
Finalmente, el recuadro en la figura superior muestra que las constantes aparentes
calculadas varan linealmente con la cantidad de CHD empleada en el
experimento y la lnea cruza el punto x,y (0,0). Esto nos indica que el orden de
reaccin para la CHD es tambin de 1 y la pendiente de esta grfica nos indica el
valor de la constante de 2o orden. y la expresin final para la velocidad sera:
v= k
2
[CHD][E], en donde k
2
= 0.026 mM
-1
min
-1
= 0.43 M
-1
s
-1
.
En condiciones en las que [CHD] es mucho mayor que [E], la enzima se agota
sin que la [CHD] disminuya apreciablemente. Esto es muy frecuente en la
inactivacin de enzimas, ya que la concentracin de protena apenas alcanza los
cientos de g/mL, lo que para una molcula de 10000 gr/mol de PM (si se trata
de na protena pequea) o ms, representa concentraciones inferiores a 10
-5
M.
Por su parte el agente qumico suele agragarse en concentraciones superiores a
10
-4
M, es decir 10 veces por encima como mnimo. Concencuentemente, el
cambio en concentracin de reactante rramente rebaza el 10% a lo largo de la
incubacin.


2 Ensayo actividad de una enzima. La enzima mlico deshidrogenasa cataliza la
reduccin de oxaloacetato con NADH, a malato y NAD
+
. En el siguiente experimento se
sigui la desaparicin del NADH, midiendo su absorbencia a 340 nm (c = 6220 M
-1
cm
-1
).
Si se emplearon 35 ng de protena de la preparacin enzimtica, en una cubeta de 3 mL,
para este experimento, determine la actividad de la enzima en unidades internacionales y la
actividad especfica de esta preparacin.

tiempo (min) 0.00 0.10 0.20 0.30 0.50 0.85 1.50 2.00
Absorbencia 1.34 1.28 1.26 1.22 1.16 1.10 1.02 0.99
SOLUCIN
Para resolver este problema es necesario observar que la absorbencia registrada
representa la desaparicin del NADH, que es el sustrato de la reaccin. En este
caso la estequimetra de la reaccin implica que por cada evento de reaccin, una
molcula de NADH desaparece y, por tanto, lo que necesitamos hacer para
calcular la velocidad es determinar el Cambio de absorbencia del NADH por
unidad de tiempo, para luego convertirlo a cambio de concentracin de NADH
mediante la ley de Lambert-Beer:
A = c c l Ac = AA/(e l)
de donde se sigue que
AA = c Ac l Ac/At = (AA/At)/(c l)
Si graficamos la absorbencia contra el tiempo transcurrido, la pendiente de la
curva descrita por la grfica ser (y
2
-y
1
)/(x
2
-x
1
) = AA/At. La que en este caso ser
numricamente negativa (por tratarse de la desaparicin de un producto). Sin
embargo, podremos notar en la figura inmediata inferior, que la relacin no
describe una recta perfecta, por lo que es necesario considerar tan slo el periodo
inicial, en el que las concentraciones de sustratos y productos no han cambiado
apreciablemente y, por tanto, los punto se aproximan razonablemente a una recta.

As, con una pendiente inicial de -0.3297 Uabs/min y una longitud para el paso
de luz de la celda del espectrofotmetro de 1 cm (l) se obtiene una velocidad de
desaparicin de NADH de 5.310
-5
M min
-1
, lo que en 3 mL del volumen de
cubeta representa (5.310
-5
mol L
-1
min
-1
) (310
-3
L) = (1.5910
-7
mol min
-1
).
Las unidades internacionales (UI) de actividad enzimtica son moles de
producto formado o reactante consumido por minuto, de modo que si 1 mol
equivale a 10
6
mol, la velocidad ser (v = 1.5910
-1
mol min
-1
) 0.159 UI.
Finalmente, la actividad especfica es l actividad enzimtica dividida por la
concentracin de protena, es decir a.e. = 0.159 UI/35 ng, pero debido a que la
concentracin de protena suele expresarse en mg: a.e. = 0.159 UI / 3510
-6
mg
= 4543 UI/mg de protena.


3 Efecto de la concentracin de enzima. En el siguiente experimento con la enzima
fosfatasa cida de semillas de trigo germinadas se vari la concentracin de la enzima en
cubeta a dos concentraciones de sustrato y se obtuvieron los resultados siguientes:

[enz] (l) [FP] 0.1 mM [FP] 10 mM
Vel
(nmol/min)
Vel
(nmol/min)
5 1.920 6.307
10 4.059 13.169
15 5.956 19.145
20 7.766 25.694
25 9.479 32.282
30 11.844 37.882
a) Como varia la velocidad de la reaccin en funcin de la cantidad de enzima aadida?
b) Qu pasa si dividimos la velocidad registrada por la cantidad de enzima aadida al
ensayo?
c) Utilizando la ecuacin de Michelis-Menten explique sus respuestas a las preguntas
anteriores?
SOLUCIN
En este problema se nos pide determinar grficamente la relacin entre la
velocidad de la reaccin catalizada, vs. la cantidad de solucin de protena
aadida al ensayo y luego se nos pide calcular el cociente de la velocidad (
actividad de la enzima) y la cantidad de solucin deprotena aadida al ensayo.
Los resultados de tal representacin se muentran en la siguiente figura:


En el panel inferior, apreciamos que la velocidad aumenta linealmente con la
concentracin de protena, esto es lo que cabra esperar, debido a que, si
tomamos como referencia la ecuacin de Michaelis-Menten, notaremos que la
velocidad es proporcional a la Velocidad mxima y a su vez la Vmax es
proporcional a la concentracin total de enzima aadida, i.e.:

Dado que en cada una de las dos series de determinaciones la concentracin de
sustrato se mantuvo constante, el factor k
CAT
S / (K
M
+ S) se mantiene constante
y, por tanto, podemos decir que mientras se emple la misma concentracin de
sustrato en todas las medidas, v = constante E
T
. Consecuentemente, cuando se
grafica el cociente v/[E] el resultado es una constante (vease panel superior de la
figura anterior), mientras la concentracin de sustrato no sea modificada.
Lo anterior significa que la velocidad de una reaccin enzimtica es proporcional
a la concentracin de enzima, lo que constituye la base terica de las mediciones
de actividad enzimtica como una estimacin de la cantidad de esta enzima
presente en un fludo biolgico. Este principio tiene, por ejemplo, mucha
importancia en la prctica clnica, ya que nos permite determinar alteraciones en
los niveles de diversas enzimas, que pueden relacionarse a diversos estados
patolgicos. Tambin es importante en aplicaciones en la industria de alimentos,
ya que permite evaluar la cantidad de ciertas enzimas presentes en los alimentos,
cuya actividad puede ser indeseable, o bien, puede ser aadida ex professo para
modificar las propiedades de los preparados alimenticios. Todo ello, mediante un
ensayo enzimtico, generalmente sencillo, que tan slo requiere como condicin
que la concentracin de sustrato empleada, as como otras condiciones (pH,
temperatura, etc.), sean estandarizadas adecuadamente.

4-Cintica de una enzima. La actividad de la Acetil-CoA carboxilasa, medida con tres
diferentes concentraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fu la
siguiente:

[Enz] (g de
protena)
0.1 0.2 0.5
[AcetilCoA] (M) + Vel (mol / min)
0.05 0.275 0.546 1.373
0.14 0.482 1.001 2.502
0.23 0.580 1.185 2.891
0.32 0.642 1.385 3.463
0.50 0.755 1.494 3.656
0.59 0.766 1.497 3.810
a) Calcular para cada experimento el valor de Km y el valor de Vmax.
b) Son los valores de Km y Vmax iguales o diferentes?
c) Explique si lo que observ es lo que esperaba obtener
d) Sabiendo que la enzima pesa 220 000 grs/mol, haga una grfica de Vmax vs mol de
enzima.
e) Qu represnta la pendiente de esta grfica?
f) En qu se parece el valor anterior a la Actividad especfica = Vmax/mg de protena
en mol min
-1
mg de enzima
-1
?
g) Qu pasa con la medida de actividad especfica cuando la enzima no est pura?
SOLUCIN
En este problema se nos d el valor de la velocidad como funcin de la cantidad
de sustrato aadido a tres diferentes niveles de concentracin de enzima. El
valor de Vmax y Km puede calcularse a partir de estos datos de diversas
maneras. La manera directa, aunque no muy precisa, consiste en graficar los
datos y estimar el valor de Vmax a partir del valor al que tiende la velocidad
cuando la concentracin de sustrato es muy elevada. Como en realidad este
valor es el lmite superir de la curva, pero esta se aproxima indefinidamente a l
sin llegar a tocarlo, estimar este techo resulta un poco impresiso. Con el valor
obtenido, es posible calcular el valor de la Km, ya que este representa la
concentracin de sustrato a la que 50% de los sitios activos de la enzima estn
ocupados con sustrato y 50% estn vacos. En estas condiciones, la velocidad
observada deber ser igual a la Vmax/2. (vase panel A de la figura que sigue a
este prrafo). Como se describi en el problema anterior, aumentar la
concentracin de enzima resulta en un incremento en la Vmax, ya que v =
V
MAX
E
T
. Por tanto, las tres curva son semejantes en su forma, pero a mayor
cantidad de enzima tenemos curvas ms elevadas. Como es de esperar, cuando
dividimos la velocidad por la concentracin de protena empleada, la tres curvas
se superponen (ver panel B de la figura), dado que aqu la velocidad ya slo
depender de la concentracin de sustrato. Esta es una manera comn de
representar las curvas de saturacin por su sustrato de las reaccines
enzimticas, ya que no su forma es la misma sin importar cuanta enzima se
emple en el experimento.

Los pneles de la derecha en la figura anterior (C,D) son representaciones de
Linewaver-Burk, en esta representacin se grafica 1/velocidad vs. 1/[sustrato],
por lo que tambin se le conoce como la grfica de dobles recprocos. Los
valores de 1/v frente a la 1/S describen una lnea recta, cuya pendiente es
numricamente igual a K
M
/V
MAX
y que intesecta al eje "Y" en un valor numrico
igual a 1/V
MAX
y si la recta se prolonga a travs del cuarto cuadrante intersecta al
eje "X" en un valor numrico igual a -1/K
M
. En la figura, el panel derecho
inferior (C) muestra que la K
M
es independiente de la concentracin de enzima
aadida. Esto puede deducirse del hecho de que la concentracin de enzima es
casi siempre mucho menor que la de l sustrato (vease problema 1), por lo que la
cantidad de sustrato requerida para ocupar el 50% de los sitios activos slo
depende de la afinidad relativa entre la enzima y el sustrato, propiedad que no
cambia con la concentracin total de enzima. Esto mismo puede deducirse de la
ecuacin de Michaelis-Menten, ya que en ella, la concentracin de E
T
y la de
sustrato no son interdependientes. El panel superior dereho (D) reitera que al
dividir la velocidad por la concentracin de enzima empleada las tres lneas se
superponen.
Si ahora graficamos velocidad mxima obtenida contra la cantidad de enzima
aadida en mol, asumiendo que cada molcula de enzima posee un slo sitio
activo, la pendiente de la grfica ser:

Este valor nos dice que una molcula de enzima es capz de convertir 33300
molculas de sustrato a poducto por segundo y es equivalente a la actividad
especfica de una enzima pura (V
MAX
/[Protena]), excepto por la unidades
empleadas. Dado que para determinar este ltimo nmero no necesitamos una
estimacin exacta del peso molecular de la enzima, no del nmero de sitios
activos por molcula de protena, este valor es el ms frecuentemente reportado
en diversas tablas de parmentros cinticos y propiedades de enzimas. Sin
embargo, cuando la preparacin no es pura el denominador de este conciente ser
mayor, debido a la contribucin de los contaminantes a la cantidad total de
protena, en consecuencia, la actividad especfica disminuir. De este modo, la
actividad especfica es un buen indicador del grado de pureza de una preparacin
enzimtica.

5-Problema sobre un ensayo de actividad enzimtica. Considere a la enzima Invertasa,
que cataliza la hidrlisis de Sacarosa a fructosa y glucosa. Esta enzima posee una Km para
sacarosa de 0.5 mM y una constante cataltica de 175 min
-1
. Si se mide su actividad en
presencia de 0.25 mM de sacarosa con 25 pmol de enzima en la cubeta - qu velocidad de
catlisis se observar? - qu fraccin representa esto de la Vmax que se podra calcular en
esta reaccin si se variase la cantidad de sacarosa? - Cunto sustrato habra que aadir
para que la velocidad observada alcanzase 0.95% de la Vmax? - Qu importancia podra
tener esto para la posible aplicacin industrial de la enzima? - Explique sus respuestas.
SOLUCIN
En este problema se nos pide determinar la actividad como fraccin de
la V
MAX
para la enzima invertasa, la manera ms simple de proceder es reordenar
la ecuacin de Michalis y Menten como sigue:

Lo que nos indica que se alcanza el 33% de la V
MAX
, como V
MAX
= k
CAT
E
T
, se
tiene vel = 175 min
-1
2.5 10
-6
mol 0.33 = una actividad de 0.00146 mol
min
-1
. Ahora, segn lo abtenido arriba, para obtener un 95 % de la V
MAX
bastar
con que S/(K
M
+ S) = 0.95, de donde al despejar S tendremos S= K
M
0.95/(1-
0.95) = 19 K
M
. Lo que significa que habr que aadir 19 x 0.5 mM = 9.5 mM de
sacarosa para que la actividad alcance este valor.
Este problema sugiere que la cantidad de sustrato es uno de los factores
importantes a considerar cuando se desea emplear una enzima para aplicaciones
inductriales. En otras palabras, si el producto a tratar, que en este caso podra ser
un almibar hecho a base de sacarosa, posee un cancentracin de sustrato muy
baja, o sea que nuestro jarabe est muy diludo, deberemos aadr mucha ms
enzima, puesto que sta estara trabajando muy por debajo de su capacidad
mxima. Por otro lado, una alternativa para ahorrar enzima, sera tratar el jarabe
concentrado y luego aadir el agua y los otros componentes de su almibar, para
tener el producto final.


6-Problema sobre una reaccin con dos sustratos.
La enzima Aspartato transaminasa, que cataliza la reaccin:
Aspartato + Oxoglutarato Glutamato + Oxaloacetato
se realizaron los siguientes tres experimentos el siguiente experimento:
[Asp] = 1 mM [OxG] = 0.02 mM [OxG] = 0.5 mM
[OxG]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
[Asp]
(mM)
Vel
(mol/min)
0.002 0.444 0.007 0.411 0.007 0.468
0.018 2.031 0.048 1.268 0.048 2.017
0.037 2.781 0.171 1.722 0.171 3.317
0.063 3.336 0.335 1.850 0.335 3.866
0.094 3.756 0.547 1.983 0.547 4.123
0.493 4.324 1.016 2.031 1.016 4.324
a) Calcule Km y Vmax para cada sustrato.
b) Cambian las Vmax? Explique su respuesta
c) Explique que pas en el segundo experimento, con respecto al tercero.
d) Cantos y cules valores de Km debo considerar para describir la afinidad de la enzima
por sus substratos?
e) Qu conclusin se podra sacar de esos datos?
SOLUCIN
En este problema se pide calcular K
M
y V
MAX
para una enzima que posee dos
sustratos. En este caso, podemos variar la cancentracin de oxoglutarato y
mantener la concentracin de aspartato constante y viceversa. El problema
consiste en saber que concentracin de aspartato debo emplear cuando varo el
oxoglutatato y que concentracin de oxoglutaroto es recomendable mantener, al
variar el osoglutarato. Aqu, existen dos valores para la K
M
, dado que este valor
representa la cocentracin de sustrato que ocupa 50% de los sitios activos de la
enzima en el estado estacionario, sin embargo, se pueden ocupar estos sitios
activos con ambos sustratos y, por tanto, habr una K
M
(oxoglutarato ) y
otra K
M
(aspartato).
La figura sigiente muestra la grfica de velocidad contra concentracin de
sustrato (panel izquierdo, para los 3 experimentos) y la de 1/v vs 1/s (panel
derecho).

Puede observarse que las curvas y las rectas correspondientes a los experimentos
1 y 3 extrapolan a la misma V
MAX
, este es el primer diagnstico. LaV
MAX
es la
velocidad de catlisis cuado la enzima se encuentra saturada con sus sustrato,
pero dado que aqu hay dos sustratos, habr que saturar con ambos. Esto significa
que cuando variamos la concentracin de aspartato, la concentracin de
oxoglutarato debe estar saturante desde el primero hasta el ltimo tubo medido y
viceversa. Si esto no se asegura, entonces el resultado ser como el mostrado en
el experimento 2, en el que la V
MAX
determinada es considerablemente inferior al
valor real, decimos que se trata de un valor aparente. Ahora -cmo sabemos que
la concentracin de un sustrato es o no saturante?- bueno, como se vi en el
problema anterior, nosotros nos aproximamos al 95% de la V
MAX
cuando la
concentracin de sustrato es 19 vecesK
M
. En este caso, habr que elegir una
concentracin de oxoglutarato igual a 19*K
M
(oxoglutarato ) cuando se vara el
aspartato y viceversa.
El problema es que de entrada, no sabemos cual es el valor de la K
M
para ninguno
de los sustratos y, por tanto, no es posible determinar a priori que concentracin
ser saturante. Para resolver este dilema se realiza un primer experimento y se
determina el valor de KM para un sustrato (el que se vari). En nuestro caso, se
trata del experimento con oxoglutarato variable. Con este resultado, se calcula el
valor de K
M
(oxoglutarato ) aparente y se realiza entonces otro variando la
concentracin de aspartato con una concentracin de osoglutarato de al menos
20*K
M
(oxoglutarato ). De este nuevo experimento se determina ahora
la K
M
(aspartato), con lo que podemos saber si la concentracin de aspartato
empleada anteriormente fue realmente saturante. Si la respuesta es afirmativa,
ambos valores de V
MAX
deben ser muy cercanos. De lo contrario, es necesario
repetir el primer experimento con una concentracin de sustrato mayor a la
empleada inicialmente.
En nuestro caso, la K
M
(oxoglutarato) determinada en el primer experimento es
0.022 mM y la V
MAX
4.54 mol min
-1
. En el segundo experimento, realizado con
0.02 mM de oxoglutarato, la concentracin no fue realmente saturante y no es
sorprendente ver que el valor de Vmax es inferior al anterior (2.06 mol min
-1
) y
la K
M
(aspartato) obtenida no es necesariamente el valor real tampoco (0.03 mM).
Sin embargo, en el tercer experimento, la concentracin de oxoglutarato fue de
0.5 mM, es decir, 22 veces la K
M
(oxoglutarato) del primer experimento (que por
cierto, an no sabemos si es cercana al valor real), por consiguiente la V
MAX
es
ahora mayor (4.58 mol min
-1
, de hecho ms cercana a la obtenida en el primer
experimento) y el valor de K
M
(aspartato) es ahora 0.062 mM.
Es decir, ahora podemos determinar que la concentracin de aspartato empleada
en el primer experimento fue 16 veces K
M
(aspartato), cercano a la saturacin,
pero se deseamos resultados an ms limpios, habra que repetir este experimento
con una concentracin an mayor (digamos 2 mM).


7- Problema sobre la energa de activacin.
Para la enzima catalasa se realiz un experimento en el que se determin la velocidad de
descomposicin del perxido de hidrgeno en ausencia en presencia de 10 nM de enzima
en el ensayo.
T vel(sin catalasa) vel(con catalasa)
(C) (mol/s) (mol/s con 10nM Et)
4 0.40E-08 0.0410
10 7.74E-09 0.0464
15 1.31E-08 0.0476
20 2.09E-08 0.0497
25 3.52E-08 0.0530
30 5.74E-08 0.0598
-Suponiendo que la concentracin de perxido de hidrgeno fue suficiente para garantizar
la saturacin de la enzima, calcular la energa de activacin de la reaccin con o sin enzima
y discuta sus resultados. (R=1.987 cal/mol/K)
SOLUCIN
En este problema se nos pide calcular la energa de activacin de Arhenius, para
ello, el procedimiento ms sencillo es el obtener una grafca de Log(k) vs. 1/T
(absoluta) y la pendiente de esta grafica ser igual a -Ea/R (siendo R la constante
universal de los gases). En este caso no tenemos el valor de k, sino tan slo el
valor de la velocidad de reaccin. Sin embargo, la pendiente de una grfica de
Arhenius es:

Ello gracias a que la velocidad es proporcional a la concentracin de reactante
(v = k R) y asumiendo que sta no se modific durante el experimento. Lo que
significa que para efectos del clculo de la pendiente y de la energa de
Activacin, es equivalente graficar la k o la velocidad directamente, siempre que
las mediciones se hallan realizado con un cantidad constante de reactante.


La fugura anterior muestra la grfica directa de velocidad vs. Temperatura, la que
muestra que la velocidad de la reaccin crece exponencialmente con la
temperatura. Tambin es claro, que en el caso de la reaccin catalizada, no se
observa una cada en el rango de temperatura empleado, lo que nos dice que no
se presenta desnaturalizacin trmica de la protena y, por ello, es posible
emplear todos los puntos para construir el grafico de Arhenius, mismo que se
muestra a la derecha de la figura anterior. Note que para realizar esta igura las
temperaturas fueron primero convertidas a temperaturas absolutas en
o
K.
De la pendiente de la grfica y sabiendo que R=1.987 cal mol
-1

o
K
-1
se obtienen
los valores para la energa de Activacin de la reaccin catalizada por la enzima
y en ausencia de catalizador, ya que E
A
= pendiente -1 R. Aqu se puede ver
que la energa de activacin de la reaccin catalizada por la enzima es cerca de 8
veces menor que la de la reaccin en ausencia de enzima. Lo que confirma que
las enzimas actan reduciendo el tamao de esta barrera enegtica.

8-Efecto de temperatura sobre una enzima:
Los valores de Km y Vmax siguientes se determinaron midiendo la hidrlisis de bromuro
de acetilcolina catalizada por la esterasa bovina a diferentes temperaturas:
T (C) K
M
(mM) k
cat
(mol min
-1
pmol_[E]t
-1
)
20 0.403 0.307
25 0.375 0.322
30 0.335 0.340
35 0.305 0.362
45 1.500 0.013
a) Qu intervalo de termperaturas deberan emplearse como datos para calcular la energa
de activacin de la reaccin catalizada por la enzima?.
c) Para ralizar el clculo anterior: debera emplearse los valores de Km o de k
cat
.
b)-Por qu vara K
M
con la temperatura? (sugerencia: vea la deficincin de K
M
).
SOLUCIN
Este es un problema en el que lo que tenemos que hacer es muy semejante a lo
que hicimos en el problema anterior. Aqu sin embargo hay que determinar que
datos debemos usar. Dado que la grfica de Arhenius implica la relacin entre
Log(k) vs 1/T absoluta, y k es una constante de velocidad, debemos identificar
aqu la constante de velocidad relacionada con el proceso de catlisis, esta el
la k
CAT
. La KM como puede verse, tambin puede ser modificada por la
temperatura, debido a que su valor es una relacin de varias constantes de
velocidad (vease la definicin de K
M
en la deduccin de la ecuacin de Michaelis
y Menten), por tanto, al cambiar la temperatura las constantes de velocidad
cambin y esto afecta el valor de K
M
. Esto es lgico, ya que la temperatura
tambin puede afectar la unin del sustrato a la protena y este proceso se refleja
en el valor de K
M
.
Ahora, en adicin a lo anterior, se puede identificar en la siguiente figura que a
las temperaturas ms altas se observa un claro efecto de desnaturacin de la
protena y por tanto una caida en la catlisis. Dado que la energa de activacin
que deseamos medir es la del proceso cataltico, debemos considerar slamente
los puntos que reflejan el efecto de la temperatura sobre la reaccin catalizada y
no acusan an efectos sobre la reaccin qumica paralela de desnaturalizacin de
la protena:

En la grfica de la derecha, se puede ver la recta que se obtiene en el grfico
Ln(k) vs 1/T, del que se deduce una energa de activacin de 1.96 Kcal/mol.
Ntese como clramente el punto que corresponde a la mayor temperatura no
cae sobre la recta. Esto debido a que este punto presenta una mezcla de los
efectos de la temperatura sobre la velocidad de catlisis y sobre la velocidad de
desnaturalizacin de la protena.
9- Efecto del pH sobre la Vmax. Los siguientes valores de velcidad inicial de enzimas
fueron obtenidos para la o-Quimotripsina actando sobre un sustrato artificial (ester etlico
de acetil-L-triptofano):
pH Vel (unidades
internacionales)
pH Vel (ui)
5.4 10 6.8 192
5.6 19 7.2 260
5.8 32 7.4 280
6.4 99 7.8 300
6.5 112 8.0 328
6.6 141 8.4 331
sigue en las columna 3 y 4. 9.0 327
a) Determine los valores de pKa(s) del (los) grupo(s) involucrado(s) en este
comportamiento.
b) Diga que residuos de aminocido podran responsables de esta respuesta.
c) Si el experimento se extendiera hacia la regin ms alcalina de la escala de pH que
cabra esperar (explique su respuesta).
SOLUCIN
En este problema se nos pide determinar el valor del pKa del grupo involucrado
en la respuesta de la enzima frente al pH. As, haciendo una grfica de la
actividad frente al pH, se obtiene la curva siguiente (lnea contnua):

Esta curva es equivalente a una curva de titulacin como las que se ven cuando
se aade base a un cido debil en solucin y se siguen los cambio de pH, slo que
aqu, en lugar de equivalentes de base aadida, lo que estamos modificando el el
pH y observando los equivalentes de enzima activa presentes. Dado que el
intervalo de pH empleado no es muy extremo, es de esperarse que la cada en la
actividad hacia el pH de 6, se reflejo de que la mayora de la enzima no est en su
forma inica catalticamente competente, por lo que no manifiesta su actividad,
pero es improbable que est irreversiblemente desnaturalizada. En cualquier
caso, para estar completamente seguros de este hecho, habra que hacer un
experimento distinto, en el que la enzima se incubara a los diferentes pH durante
un cierto intervalo de tiempo y luego se regresara al pH de 8.5-9 (en donde tiene
su mxima actividad de acuerdo con la curva anterior) y se medira cuanta de la
enzima puede recuperarse despus del tratmiento. Este experimento nos dara la
misma actividada a todos los pH's en los que la enzima es estable y reportara
bajas de la actividad en las regiones en las que el pH desnaturaliza a una fraccin
de la protena en forma irreversible.
a) A partir de la curva dibujada, se puede ver que el punto de inflexin de la
curva es paroximadamente de 6.7, lo que se da a un valor de activida de
aproximadamente la mitad del mximo observado a un pH entre 8.5 y 9.
b) Lo anterior nos indica que podra tratarse de algn aminocido como la
histidina. Menos probables, pero no se pueden descartar, seran los carboxilatos
de Asp y Glu o el grupo SH de una cistena libre (es decir que no est formando
puente de disulfuro. Aunque los pKa de los grupos R de estos ltimos 3
aminocidos en su forma libre se encuentran relativamente alejados de 7 (4.7
para los carboxilatos y 8 para el tiol), en el interior de las protenas y
especialmente en el sitio activo de las enzimas, se pueden observar desviaciones
impertantes de los pKa, causadas por las caractersticas de polaridad del sitio
activo, que son casi seimpre muy diferentes a las del medio acuoso puro.
c) Fnalmente, la lnea punteada de la figura anteror indica de manera
aproximada lo que se espera observar a valores de pH mucho ms alcalinos. En
esas condiciones, la desprotonacin masiva de muchos aminocidos, es decir casi
todas las histidinas, los tioles y la gran mayora de lisinas, as como muchas
argininas, perdern su carga positiva provocando la desestabilizacin de
numerosos puentes de sal en la protena, con lo que la estructura se ver
severamente afectada. Consicuentemente, se espera a que un pH superior a 10 u
11, la actividad comenzar a desiminuir abruptamente y para un pH de 12 o 13 la
enzima presentar una actividad nula. Esto es casi siempre cierto, pero cabe
aclarar que algunas protenas de bacterias alcaloflicas y que se encuentran en
medios extremos pueden soportar pH cercanos a 14 sin perdida de la actividad.

10-Problemas sobre inhibicin:
Se realizaron estudios de inhibicin para dos enzimas diferentes presentes en el suero
bovino. Se vari la concentracin de sustrato a en ausencia y en presencia de tres
concentraciones diferentes de inhibidores de cada enzima. En cada caso encontrar:

a) El tipo de inhibicin.
b) El valor de Km y Vmax.
c) El valor de Ki para el inhibidor.

Enzima: Fosfatasa alcalina de suero bovino, inhibidor: Oxalato de Bromolevamisol

[Bromolevamisol]
(M)
0 8 16 40
[Sustrato] +[FP](mM) Velocidades iniciales (mol min
-1
mgProt.
-1
)
0.1 0.231 0.210 0.191 0.158
0.3 0.431 0.369 0.309 0.239
0.7 0.607 0.488 0.425 0.277
1.3 0.751 0.599 0.467 0.304
1.8 0.811 0.657 0.530 0.319
2.6 0.912 0.657 0.546 0.328
4.1 0.957 0.688 0.561 0.351
5.8 0.981 0.741 0.558 0.344
Enzima: Transaminasa Glutmico Pirvica.

[2hidroxisuccnico]
(mM)
0.0 1.0 2.0 5.1
[Sustrato] +[Glu](mM) Velocidades iniciales (mol / min / mgProt)
0.6 0.59 0.48 0.38 0.24
1.4 1.12 0.91 0.78 0.51
2.9 1.63 1.43 1.19 0.87
5.2 1.94 1.70 1.64 1.19
8.0 2.19 1.94 1.94 1.56
10.3 2.28 2.06 1.99 1.74
16.0 2.32 2.33 2.24 1.89
25.1 2.62 2.53 2.25 2.09

SOLUCIN
parte a. En este problema, podemos graficar los valores de velocidad frente a la
concentracin de sustrato para las series obtenidas sin y con las distintas
concentraciones del inhibidor. Esto se muestra en la figura que sigue, en el panel
inferior izquierdo. Aunque es posible estimar los valores de Km y Vmax (en
ausencia del inhibidor) y los valores de las constantes aparentes en presencia del
inhbibidor en esta figura, el estimado ser difcil de hacer, debido a que la Vmax
es una valor lmite que debe extrapolarse y el valor de Km debe estimarse una
vez que se conoce la Vmax, lo que significa que un mal estimado de Vmax dar
un mal estimado de Km. Una manera sencilla de resolver este problema es
realizar la grfica que se presenta en el lado izquierdo de la figura, la
representacin de 1/v vs. 1/s propuesta por Linewaver & Burk permite, unindo
los puntos con una recta, determinar los valores de 1/Vmax a partir de la
intercepcin con el eje ordenado y -1/Km a partir de la intercepcin de la recta
extrapolada al eje de las abscisas. Aunque existen otras formas de graficar estos
datos que pueden ser ms convenientes desde el punto de vista del estimado
numrico obtenido, esta es la ms extendida en la literatura.
a) A partir de la representacin mostrada en el panel derecho de la figura, puede
tambin determinarse el tipo de inhibidor que se tiene, que en este caso
esacompetitivo (tambin llamado incompetitivo), dado que las rectas que unen
cada una de las series de puntos son paralelas. Note que aqu de poco sirve
emplear un anlisis de regresin lineal, dado que los errores experimentales
provocan que las rectas obtenidas por regresin no presenten la misma pendiente.
En estos casos, una vez que se ha decidido que los puntos realmente representan
rectas paralelas, lo mejor es tomar una regla y trazar todas las recta paralelas
buscando que el conjunto de lneas realmente describan, tan cercnamente como
sea posible, el conjunto de puntos experimentales.
b) Aqu, el nico valor de Vmax para la enzima es el determinado en ausencia del
inhibidor (O). Es decir 1/Vmax = 0.965 (mol
-1
min mg prot) Vmax = 1.04
(mol

min
-1
mg prot
-1
). Los valores obtenidos con las otras rectas representan tan
slo parmetros cinticos aparentes cuyo valor refleja las alteraciones impuestas
sobre la actividad enzimtica por la presencia del inhibidor. Km se determina por
consiguiente del valor de la intercepcin con las absisas de esta misma recta i.e. -
1/Km = -2.4 mM
-1
Km = -1/-2.4 mM = 0.417 mM de p-nitrofenilfosfato. Esto
significa que cuando la concentracin de p-nitrofenilfosfato en el medio de
reaccin (al pH y temperatura empleados en este experimentos) alcanzan 0.417
mM, el 50% de los sitios activos de la enzima se encontrarn saturados y por
tanto la actividad der igual a la mitad de la mxima que puede observarse en
dichas condiciones.


c) Finalmente, dado que los inhibidores acompetitivos afectan al valor de la
intercepcin con la ordenada de la grfica de (1/v,1/s), los valores de este
parmetro pueden emplearse para calcular grficamente el valor de Ki sin recurrir
al lgebra. Para ello, basta graficar estos valores frente a la concentracin de
inhibidor empleada en cada serie de determinaciones, lo que se muestra en el
panel izquierdo superior. Aqu, se unen los puntos con una recta y se extrapolan
al eje de las absisas, el punto de crte es numricamente igual a -Ki = -20.47 M
Ki = 20.47 M de bromolevamisol. Note que el primer punto de la grfica
representa el valor de la intercepcin cuando la concentracin de inhibidor el
cero, es decir, este punto es numricamente igual a 1/Vmax.
parte b. a) La solucin de este problema es muy semejante a la descrita para el
problema anterior, de manera que no abundaremos en los detalles. Aqu, el
patrn del grfico de Lineweaver-Burk es claramente no paralelo, sin embargo,
habr que dterminar si las rectas se cortan en un punto sobre el eje de las
ordenadas, o sobre un punto en el segundo o tercer cuadrante. La distincin entre
ambos casos debe hacerse nuevamente al observar todo el conjunto de puntos y
el empleo de la regresin lineal aporta poco para una eleccin adecuada del
conjunto de rectas y del punto de corte entre ellas. En el caso presente es claro
que el mejor patrn es un abanico de rectas que se cortan en el eje de las
ordenadas, por lo que puede decirse con facilida que el inhibidor escompetitivo.
Note que a pesar de tener la misma Vmax, las curva de la grfica directa no dan
la apariencia de tener la misma asntatota. Esto se debe a que en cada una de las
series de experimentos, al estar una concentracin de inhibidor distinta presente,
se alcanza un grado de saturacin distinta de la enzima y por ello es muy difcil
decidir si todas las rectas, dada una concentracion de sustrato suficientemente
alta, alacanzarn el mismo techo. Esto recalca la dificultad de emplear la
representacin directa para el clculo grafico de los valores de Vmax y Km. Sin
embargo, con la ayuda de un programa de regresin no lineal, es posible
determinar un estimad de Km y Vmax a partir de esta representacin, cuyo valor
constituye un mejor estimado que el obtenido por cualquiera de los mtodos
grficos descritos en la literatura, salvo quiz una excepcin (ref).
b) los valores de Vmax y Km se obtiene de la serie realizada en ausencia de
inhibidor (O); aqu, Vmax = 1/0.38 (mol

min
-1
mg prot
-1
) = 2.63 (mol

min
-1
mg
prot
-1
) y -1/Km = -0.51 mM
-1
Km = -1/-0.51 mM = 1.95 mM de glutamato.


c) Finalmente, el valor de Ki puede obtenerse ahora del efecto que el inhibidor
produce sobre la pendiente de la grfica de Linewaver-Burk (que en ausencia de
inhibidor es numricamente igual a Km/Vmax). De nuevo, si se grafica el valor
de estas pendientes frente a la concentracin de inhibidor empleada (panel
superior izquierdo). El valor obtenido para Ki es ahora 2.38 mM de 2-
hidroxisuccinato. Es importante recalcar que cuando las rectas no se cortan en
el eje "Y" como en este caso, esto significar que el inhibidor ( no competitivo)
producir alteraciones en los valores de la pendiente y de los interceptos con la
ordenada del grfico (1/v, 1/s), por tanto aqu se podrn obtener dos valores de
Ki (usualmente llamados Kiu y Kic, respectivamente). Lo que representa una
medida inversa de la fuerza con la que el inhibidor se une a la enzima cuando
esta tiene su sitio activo vaco (Kic) o de la fuerza de unin a la enzima con el
sitio activo ocupado (Kiu), por ello es que se obtienen dos valores de Ki. Si todas
las rectas se cortasen en un punto sobre el eje "X", esto significara que Kiu y Kic
son numricmente idnticos, pero esta coincidencia no es el caso ms comn.
11-Problema sobre inhibicin:
El siguiente experimento fu realizado con la fosfoenolpyruvato:pyruvil tranferasa
de streptococcus sp. Este enzima participa en la sntesis de la pared celular de las bacterias
y cataliza la transferencia de un grupo piruvilo a un precursos del pptidoglicano, liberando
fosfato. La fosfomicina (FSM) es un antibitico sintetizado por ciertas bacterias del
grupo streptomyces que inhibe a esta enzima. Usando el fosfoenolpiruvato (PEP) como
sustrato a dos diferentes niveles de concentracin, se estudi la inhibicin de esta enzima
por fosfomicina.

[PEP] (M) 75 200
[FSM] (M) +
Velocidad
(nmol min
-
1
mgProt
-1
)
Velocidad
(nmol min
-
1
mgProt
-1
)
0 0.73 2.49
5 0.53 2.29
10 0.42 2.15
25 0.26 1.78
50 0.16 1.4
100 0.09 0.98

a) Identifique el tipo de inhibicin que se presenta
b) Calcule el valor de la I
50
para este inhibidor a la concentraciones ms baja y ms alta de
sustrato empleadas en el experimento.
b) Qu diferencias observa entre este parmetro calculado con diferentes concentraciones
de sustrato?
c) Suponga que encuentra reportados en la literatura otros inhibidores de esta enzima que
actan por un mecanismo semejante a este compuesto, pero descubre que en varios casos
los autores emplearon diferentes concentraciones de PEP para estudiar el efecto del
inhibidor. Sera vlido comparar los valores de K
I
reportados? - explique su razonamiento.
SOLUCIN
En este problema se presenta un caso comn en la investigacin farmacolgica.
Se trata de buscar un inhibidor que sea efectivo contra una enzima que resulta
vital para un microorganimo y, por tanto, nos puede servir para defendernos de
l. Lo primero que observamos, es que en lugar de hacer medidas a diferentes
concentraciones de sustrato en presencia y ausencia del activador, aqu se
realizaron determinaciones de la actividad a una u otra concentracin fija de
sustrato y con cantidades crecientes del inhibidor.
a) Para identificar el tipo de inhibidor que acta, se pueden emplear diversas
estrategias, por ejemplo, se pueden ordenar los datos de manera que se tienen dos
valores de velocidad y dos concentraciones de sustrato para diferentes
concentraciones de inhibidor. Esto es lo que se hizo en la figura inferior (panel
B). Ntese que si trazaraos rectas estas cruzaran hacia el lado negativo del eje.
Dado que las medidas de actividad se realizan sin aadir producto, una velocidad
negativa carece de sentido, porque tendra que generarse sustrato en lugar de
desaparecer y si no hay producto - de dnde puede aparecer sustrato?
El resultado anterior nos indica que la cintica de esta enzima no es michaelina
(hiperblica), por lo que no podemos trazar rectas, sino que debera mos trazar
curvas en esta figura. Por lo que lo nico que podemos decir del tipo de
inhibicin con estos datos es que podra ser complejo y que se necesita ms
informacin para determinarlo.

b) Respecto al valor de I50, las curvas y los valores correspondiente se muestran
en la figura inmediata superior, panel A. Como puede observarse el valor de I50
decrese cuando hay menor cantidad de sustrato. El valor de I50 nos indica cuanto
inhibidor requerimos para inhibir la actividad de la enzima a la mitad en una
cierta condicin. Es evidente que el resultado nos dice que si hay ms sustrato
disponible el inhibidor ser menos efectivo y refleja la existencia de un
componente competitivo en la inhibicin, lo que no significa que la inhibicin
sea realmente competitiva.
c) Como puede verse, si otros inhibidores se quisieran comparar con este,
primero habra que asumir que el mecanismo de inhibicin es el mismo. Esto
suele hacerse en la investigacin farmacolgica, ya que a menudo los compuestos
a ensayar son iguales en su estructura qumica, excepto por uno o dos
substituyentes. En segundo trmino, los valores de I50 tendrn que haber sido
determinados con la enzima ensayada en condiciones idnticas, excepto por la
adicin del inhibidor en estudio. Por ello, la respuesta a la pregunta que se
plantea en el problema es NO - no es posible compara los valores puesto que no
fueron medidos bajo las mismas condiciones.

1. Problemas sobre mecanismos de catlisis.
1.- El RNA se hidroliza rpidamente en solucin alcalina. Sin embargo el DNA que carece
del -OH en la posicin 2'- del anillo furansido de la ribosa es resistente a esta condicin.
Basado en su conocimiento del mecanismo qumico de la RNAasa explique esta
observacin.
SOLUCIN
El mecanismo de catlisis de la Ribonucleasa indica que hay tres grupos
qumicos escenciales para la catlisis de la hidrlisis del enlace ester de fosfato
del RNA. Dos de ellos (la H12 y la H119) pertenecen a la enzima, mientras que el
tercero el el propio hidroxilo de la posicin 2 de la ribosa del RNA (el sustrato),
el que, activado por la H119 (base general) se convierte en un nuclefilo activo
capz de atacar el tomo de fosforo iniciando as el rearreglo de diester
fosfrico que lleva a la hidrlisis del RNA. Este mismo mecanismo puede ser
catalizado por otras bases, incudo el grupo hidroxilo, de manera que se generen
nucletiods 2',3' fosfato cclicos, con hidrlisis del enlace 5'fosfato adyacente.
Por ello, el RNA se hidroliza fcilmente en medio ligeramente alcalinos (pH >8).
El DNA no cuenta con el OH de la posicin 2', ya que la azcar que lo compone
el la desoxirribosa. Consecuentemente es mucho ms estable a pH's alcalinos.
De hecho, esta caractrastica se emplea para purificar el DNA, ya que al
incubarlo a pH de 8 es posible eliminar el RNA que pueda venir como
contaminante.
2. En la lactonizacin siguiente:

La reaccin es 3.4 X 10
11
veces ms rpida cuando R1 es CH
3
que cuando R1= H. Explique
este resultado. Cmo se relaciona lo anterior con los mecanismos de catlisis enzimtica?
SOLUCIN
En este caso, la presencia de grupos ms voluminosos en la molcula forza al
grupo carboxilo a aproximarse ms al -OH fenlico, lo que favorece la
lactonizacin. De hecho, la geometra de la molcula en tre dimensiones revela
que a fin de acomodar los grupos tan voluminosos el anillo benzenico debe
permitir una leve pero apreciable desviacin de la planaridad, por consiguiente,
la eliminacin de un tomo de oxgeno como resultado de la lactonizacin hace
ms estable la geometra de toda la molcula.

En la imagen anterior se puede ver como la posicin de los metilos en la
molcula (vista aqu desde el canto superior del anillo bencnico) favorecen
conformaciones en las que hay mayor aproximacin de los grupos carboxilato y
OH fenlico (identificados aqu por el color amarillo de los tomos de oxgeno.
En las enzimas, la cudadosa orientacin geomtrica de los grupos qumicos en el
sitio activo de la enzima favorece la unin de los sustratos con geomietras
predeterminadas, de modo que se eleva notablemente la probabilidad de que los
grupos que deben reaccionar se orienten correctamente. Estos se denominan
factores de proximidad y orientacin, siendo uno de los efectos importantes en la
catlisis enzimtica.

3.- Explique en trminos termodinmicos porque una enzima que pueda estabilizar el
complejo de Michaelis ES tanto como el estado de trasicin ES
#
, no cataliza la reaccin.
SOLUCIN
La habilidad de una enzima para favorecer una reaccin qumica y aumentar la
velocidad con la que esta ocurre depende de que la barrera energetica que separa
al estado de transicin de los reactante pueda ser superada. Por ello, las enzima
actan empleando caminos qumicos distintos a los que se observan en solucin y
modificando el entorno qumicos de los reactantes y del estado de transin a fin
de favorecer la ocurrencia de este ltimo. Esto significa que la diferencia
energtica entre reactantes y estado de transicin debe reducirse. Pero si el
complejo enzima sustrato al formarse libera una gran cantidad de energa libre,
esto significa que el estado basal de los reactantes se encuentra a un nivel
energtico an ms bajo, por consiguiente, alcanzar el estado de transicin
requerira ahora mucha ms energa, a menos que el complejo enzima-estado de
transicin sea todava ms estable con respecto al estado de transicn en
solucin, que lo que es el complejo enzima sustrato con respecto al reactante. Por
ello, una enzima que realmente catalice una reaccin debe estabilizar ms el
estado de transicin que lo que estabiliza al sustrato al interactuar con cada uno
de ellos. De otra manera, no habra reduccin de la energa de activacin efectiva
y no se favorecer la catlisis.
De hecho, una de las maneras en las que puede hacerse a una enzima peor
catalizador, es modificando ciertos grupos importantes en la interaccin enzima-
sustrato de modo que la unin sea ms fuerte, el resultado es una enzima que
libera lentamente los productos y, en consecuencia, cataliza ms lentamente la
reaccin, an cuando si kcat (medida cinticamente) cambie poco.

La figura anterior ilustra tres casos, la reaccin no catalizada, la reaccin en
presencia de la supuesta enzima descrita en el problema y el caso de una
verdadera enzima en la que el estado de transicin es estabilizado mucho ms
que el sustrato al unirse con la enzima. En los dos primeros casos la energa de
activacin es la misma y por tanto no habra aumento en la velocidad de la
reaccin.


4.- Wolfenden afirma que carece de sentido distinguir entre sitios de unin y sitios
catalticos en una enzima. Discuta esta afirmacin.
SOLUCIN
Los estudios modernos sobre la catlisis enzimtica demuestran que cambios en
aminocidos cuyo papel se considera de unin pueden resultar en alteracines
importantes en la kcat y viceversa. El papel de estos grupos es asignado casi
siempre con base a la posicin del grupo en los cristales de la enzima obtenidos
en presencia de analogos del sustrato, datos que se compaginan con eltras
evidencia experimentales diversas. Debido a que la geometra completa del sitio
activo ha sido diseada para favorecer una mayor estabilidad del estado de
transicin, an pequeos cambios en la polaridad de los grupos y o su orientacin
pueden tener efectos importantes sobre la catlisis. Por ello es muy difcil asignar
papeles especficos a los residuos de aminocido delimitando su fincin a
nicamente unin y nicamente catlisis, de hecho, basta recordar que durante la
catlisi los intermediarios deben permanecer unidos a la protena, de otro modo
no podramos adscribirle la catlisi a la enzima.
Sin embargo, cabe aclarar que las determinaciones cinticas demuestran que los
eventos de unin de los sustratos al sitio activo de la enzima y los evntos
qumicos de catlisis ocurren en ciertan secuencia y no son simultneos. Es por
tanto factible pensar que durante los eventos de unin hay grupos que no son
importantes, sino hasta que se inicien los eventos catalticos, en este sentido,
quiz sea posible distnguir entre grupos que participan en unin y en catlisis y
grupos que participan principalmente en catlisis.


5.- Una dificultad grande al estudiar las proteasas pancreticas es que, al ser ellas mismas
protenas. Son enzimas que se autodigieren. El problema es menos grave con la
quimotripsina que con la tripsina. Por qu?
SOLUCIN
La tripsina y la quimotripsina son proteasas muy activas pertenecientes a la
familia de las sern-proteasas. Estas protenas difieren en la especificidad por el
enlace peptdico que hidrolizan; mientra la tripsina es muy selectiva hacia
enlaces peptdicos en los que participan aminocidos bsicos con carga positiva
(Lys y Arg), la quimotripsina prefiere aminocidos aromticos y puede tambin
atacar enlaces peptdicos en los que participen aminocidos alifticos
voluminosos, principalmente L, I y V. En consecuencia, la quimotrispsina es
menos activa frente a protena nativas, ya que es menos probable que un enlace
peptdico formado por aminocidos apolares se encuentre en la superficie de la
protena, generalmente estos se encuentran en el interior. Por el contrario, la
tripsina ataca aminocidos polares y cargados, que con mucha frecuencia se
encuentran en la superficie de la protena, expuestos al solvente. As, la
quimotripsina es poco activa contra si misma en su estado nativo, mientra la
tripsina es muy activa contra su propio estado nativo, por ello es una protena
difcil de purificar. Afortunadamente, son tambin protenas que recuperan
fcilmente su plegamiento nativo y es posible purificarlas a pH's extremos en los
que su actividad es mnima y por tanto no se autodigieren, una vez purificadas
se pueden incubar al pH en el que son activas para que recuperen su
conformacin nativa y sirvan a los diversos fines cientficos y/o tecnolgicos que
requirieron su purificacin.

6.- En la elaboracin del Tof, un preparado de la soya tambin llamado "queso de soya",
se emplea un tratamiento que elimina el inhibidor de tripsina normalmente presente en los
frijoles de soya, pero que, por lo dems, no afecta la apariencia, la textura o el sabor del
producto.
a) Qu hace necesario este proceso?
b) Qu caractersticas cree usted que presenten las proteasas del aparato digestivo del
Gorgojo de la soya?
SOLUCIN
a) El inhibidor de tripsina de soya es una pequea protena capaz de unirse al
sitio activo de la tripsina con gran fuerza, de modo que aunque es hidrolizado
uno de sus enlaces peptdicos, la enzima no puede liberar el producto y esto evita
que contine con su actividad hidroltica. Dado que la tripsina es una de las
enzimas importantes en la digestin de las protenas que nos sirven como
alimento, es necesario inactivarlo a fin de que los productos elaborados con
protena de frijol soya puedan ser digeridos por los humanos. De hecho la
ingestin de protena de soya cruda puede causar la muerte por congestin
digestiva.
b) En el caso del Gorgojo de la soya, es evidente que debe poseer proteasas
especiales cuya especificidad y bolsillo de unin sean diferentes de la de la
tripsina, lo que las hace insensibles al inhibidor.

7.- Para muchas enzimas, el mecanismo qumico de accin implica catlisis cida
(donacin de un protn) sobre un grupo y catlisis bsica sobre otro. Si la enzima libre
posee tanto a la base como al cido, porqu estos no se neutralizan mutuamente.
SOLUCIN
La respuesta a esta pregunta est en el cuidadoso balance entre rigidez y
flexibilidad de la estructura de la protena, que permite que cada grupo qumico
se encuentre casi continuamente rodeado de un conjunto de aminocidos
definidos. Esto es especialmente cierto en el sitio activo, en el que la disposicin
y ordenamiento especial de los grupos qumicos est cuidadosamente elegida
para favorecer la catlisis. De este modo, un protn, atrapado por un grupo
qumico con baja afinidad protnica puede encontrarse demasiado lejos de la
base como para ser transferido a esta y con frecuencia, puede adems estar
estabilizado por la presencia de otros grupos con densidad electrnica, lo que
favorece que permanezca en dicho entorno, en lugar de migrar hacia el entorno
de la base, el que a su vez puede estar rodeado de grupos can baja densisdad
electrnica reduciendo la estabilidad de los protones que entren en este sitio.