Manual Técnico Del Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard (R) TM050

Página 1
MANUAL TÉCNICO
ADN genómico Wizard ®

Kit de purificacion
Instrucciones de uso de productos
A1120, A1123, A1125 y A1620
Revisado 17/05
TM050
Página 2
ADN genómico Wizard ®

Kit de purificacion
Toda la literatura técnica está disponible en: www.promega.com/protocols/
Visite el sitio web para verificar que está utilizando la versión más reciente de este Manual técnico.
Envíe un correo electrónico a los Servicios técnicos de Promega si tiene preguntas sobre el uso de este sistema: techserv@promega.com
1. Descripción ............................................... .................................................. ........................................ 1
2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento ........................................... ............................................. 2
3. Protocolos para el aislamiento del ADN genómico ........................................... .................................................. ...... 4

3.A. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (300 µl o 3 ml de volumen de muestra) ..................................... 4 4
3.B. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 10 ml) ....................................... ......... 6
3.C. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (placa de 96 pocillos) ...................................... ...................... 8
3.D. Aislamiento de ADN genómico de células de cultivo de tejidos y tejido animal ........................................ ... 10
3.E. Aislamiento de ADN genómico del tejido vegetal ............................................ ...................................... 12
3.F. Aislamiento de ADN genómico de levadura ............................................. ............................................... 13
3.G. Aislamiento de ADN genómico de bacterias Gram positivas y Gram negativas ...................................... 14
4. Solución de problemas ............................................... .................................................. ............................... 15
5. Referencias ............................................... .................................................. ....................................... dieciséis
6. Apéndice ............................................... .................................................. ......................................... 17

6.A. Composición de tampones y soluciones ............................................. ............................................ 17
6.B. Productos relacionados ................................................ .................................................. .................... 17
7. Resumen del cambio ............................................. .................................................. ........................... 17
1. Descripción
El kit de purificación de ADN genómico Wizard ® está diseñado para aislar el ADN de los glóbulos blancos (secciones 3.A,
B y C), células de cultivo de tejidos y tejido animal (Sección 3.D), tejido vegetal (Sección 3.E), levadura (Sección 3.F), y
Bacterias Gram positivas y Gram negativas (Sección 3.G). La Tabla 1 enumera el rendimiento típico para ADN purificado de cada
de estas fuentes
El kit de purificación de ADN genómico Wizard ® se basa en un proceso de cuatro pasos (1). El primer paso en la purificación.
procedimiento lisa las células y los núcleos. Para el aislamiento del ADN de los glóbulos blancos, este paso implica la lisis del rojo
células sanguíneas en la solución de lisis celular, seguidas de la lisis de los glóbulos blancos y sus núcleos en la lisis nuclear
Solución. Se puede incluir un paso de digestión de RNasa en este momento; Es opcional para algunas aplicaciones. El celular
Luego, las proteínas se eliminan mediante un paso de precipitación de sal, que precipita las proteínas pero deja el alto nivel molecular
peso de ADN genómico en solución. Finalmente, el ADN genómico se concentra y desala por precipitación de isopropanol.
El ADN purificado con este sistema es adecuado para una variedad de aplicaciones, incluida la amplificación, la digestión con
endonucleasas de restricción e hibridaciones de membrana (p. ej., transferencias Southern y punto / ranura).
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 EE. UU. · Llamada gratuita en EE. UU. 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 1
www.promega.com TM050 · Revisado 17/05
Página 3
2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento
Aislamiento a pequeña escala (minipreps)

PRODUCTO TALLA GATO.#
Kit de purificación de ADN genómico Wizard ® 100 aislamientos A1120

Cada sistema contiene suficientes reactivos para 100 aislamientos de ADN genómico de 300 µl de sangre completa
muestras Incluye:
• Solución de lisis celular de 100 ml
• Solución de lisis de núcleos de 50 ml
• 25 ml de solución de precipitación de proteínas
• 50 ml de solución de rehidratación de ADN
• 250 µl de solución de RNasa A

Cada sistema contiene suficientes reactivos para 500 aislamientos de ADN genómico de 300 µl de sangre completa
muestras Incluye:
• Solución de lisis celular de 500 ml
• Solución de lisis de núcleos de 250 ml
• Solución de rehidratación de ADN de 100 ml
• Solución de 1,25 ml de RNasa A
Aislamiento a gran escala (maxiprep)


Cada sistema contiene suficientes reactivos para 100 aislamientos de ADN genómico de 10 ml de sangre completa
muestras Incluye:
• Solución de lisis celular 3L
• Solución de lisis de núcleos 1L
• 150 ml de solución de rehidratación de ADN
Nota: Cat. # A1620 no incluye la solución RNase A.
Artículos disponibles por separado

Solución de lisis celular 1L A7933

Solución de lisis de núcleos 1L A7943
Solución de precipitación de proteínas 350ml A7953
Solución de rehidratación de ADN 50ml A7963
RNasa A (4 mg / ml) 1 ml A7973
Condiciones de almacenamiento: Almacene el kit de purificación de ADN genómico Wizard ® a temperatura ambiente (15–30 ° C). Ver producto
etiqueta para la fecha de vencimiento.
2 Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 EE. UU. · Llamada gratuita en EE. UU. 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516
TM050 · Revisado 17/05 www.promega.com
Página 4
Tabla 1. Rendimientos de ADN de diversos materiales de partida.
Cantidad de inicio
Especies y material Material Rendimiento típico de ADN Tratamiento de ARNasa
Sangre entera humana

(El rendimiento depende de 300 µl 5–15 µg Opcional
cantidad de sangre blanca 1.0ml 25–50 µg Opcional
células presentes) 10.0ml 250–500 µg Opcional
Placa de 96 pocillos 50 µl / pocillo 0.2–0.7 µg Opcional
(Procese tan poco como
20 µl / pocillo; ver tabla 2.)
Ratón Sangre Entera
EDTA (4%) tratado 300 µl 6 µg Opcional
Heparina (4%) tratada 300 µl 6–7 µg Opcional
Placa de 96 pocillos 50 µl / pocillo 0.2–0.7 µg Opcional
Líneas celulares
K562 (humano) 3 × 10 6 celdas 15-30 µg Necesario
COS (mono verde africano) 1.5 × 10 6 celdas 10 µg Necesario
NIH3T3 (ratón) 2.25 × 10 6 celdas 9,5–12,5 µg Necesario
PC12 (feocromocitoma de rata) 8.25 × 10 6 celdas 6 µg Necesario
CHO (hámster) 1–2 × 10 6 celdas 6–7 µg Necesario
Tejido animal
Hígado de ratón 11mg 15-20 µg Necesario
Cola de ratón 0.5–1.0cm de cola 10-30 µg Opcional
Insectos
Células Sf9 5 × 10 6 celdas 16 µg Necesario
Tejido vegetal
Hoja de tomate 40mg 7–12 µg Necesario
Bacterias Gram-negativo
Escherichia coli JM109 1 ml 20 µg Necesario
cultura durante la noche, 5ml 75–100 µg Necesario
~ 2 × 10 9 células / ml
20 µg Necesario
Enterobacter cloacae 1 ml
75–100 µg Necesario
cultura durante la noche, 5ml
~ 6 × 10 9 células / ml
Bacterias Gram Positivas
Staphylococcus epidermis 1 ml 6–13 µg Necesario
cultura durante la noche,
~ 3.5 × 10 8 células / ml
Levadura
Saccharomyces cerevisiae 1 ml 4,5–6,5 µg Necesario
cultura durante la noche,
~ 1.9 × 10 8 células / ml
Página 5
3. Protocolos para el aislamiento del ADN genómico.
Probamos la purificación del ADN genómico de sangre entera fresca recolectada en EDTA, heparina y anti- citrato.
tubos coagulantes y no detectaron efectos adversos en posteriores manipulaciones del ADN, incluida la PCR (2).
Las muestras de sangre anticoagulantes pueden almacenarse a 2–8 ° C durante un máximo de dos meses, pero el rendimiento del ADN se reducirá con
aumento de la duración del almacenamiento.
El protocolo en la Sección 3.A ha sido diseñado y probado para muestras de sangre de hasta 3 ml de volumen. El protocolo en
La Sección 3.B ha sido diseñada y probada para muestras de sangre de hasta 10 ml de volumen. El rendimiento del ADN genómico variará.
dependiendo de la cantidad de glóbulos blancos presentes. La sangre congelada se puede usar en los siguientes protocolos, pero produce
puede ser inferior a la obtenida con sangre fresca y se puede requerir una solución adicional de lisis celular.
Precaución: al manipular muestras de sangre (secciones 3.A, B y C), siga los procedimientos recomendados en su institución
para materiales biopeligrosos o ver referencia 3.
3.A. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (300 µl o 3 ml de volumen de muestra)
Materiales a suministrar por el usuario

• tubos estériles de microcentrífuga de 1,5 ml (para muestras de sangre de 300 µl)
• tubos de centrífuga estériles de 15 ml (para muestras de sangre de 3 ml)
• baño de agua, 37 ° C
• isopropanol, temperatura ambiente
• 70% de etanol, temperatura ambiente
• baño de agua, 65 ° C (opcional; para rehidratación rápida de ADN)
1. Para 300 µl de volumen de muestra: agregue 900 µl de solución de lisis celular a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
Para un volumen de muestra de 3 ml: agregue 9.0 ml de solución de lisis celular a un tubo de centrífuga estéril de 15 ml.
! Importante: La sangre debe recogerse en tubos anticoagulantes con EDTA, heparina o citrato para evitar la coagulación.
2. Agite suavemente el tubo de sangre hasta que esté completamente mezclado; luego transfiera sangre al tubo que contiene la lisis celular
Solución. Invierta el tubo 5–6 veces para mezclar.
3. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente (invertir 2-3 veces una vez durante la incubación) para lisar
los glóbulos rojos Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 20 segundos a temperatura ambiente para 300 µl de muestra.
Centrifugar a 2.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente para una muestra de 3 ml.
4. Retire y deseche la mayor cantidad de sobrenadante posible sin alterar el sedimento blanco visible. Aproximadamente
Quedarán 10-20 µl de líquido residual en el tubo de 1,5 ml (muestra de 300 µl). Aproximadamente 50–100 µl de residuo
el líquido permanecerá en el tubo de 15 ml (muestra de 3 ml).
Si la muestra de sangre se ha congelado, repita los pasos 1–4 hasta que el gránulo esté blanco. Puede haber alguna pérdida de ADN de
Muestras congeladas.
Nota: Algunos glóbulos rojos o restos celulares pueden verse junto con los glóbulos blancos. Si aparece la pastilla
para contener solo glóbulos rojos, agregue una alícuota adicional de Solución de lisis celular después de eliminar el sobrenadante
encima del sedimento celular y luego repita los pasos 3–4.
Página 6
5. Agite vigorosamente el tubo hasta que los glóbulos blancos se resuspendan (10-15 segundos).
! Resuspender completamente los glóbulos blancos para obtener una lisis celular eficiente.
6. Agregue solución de lisis de núcleos (300 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 3.0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) al tubo que contiene
Las células resuspendidas. Pipetee la solución 5–6 veces para lisar los glóbulos blancos. La solución debería ser muy
viscoso. Si se ven grupos de células después de mezclar, incubar la solución a 37 ° C hasta que los grupos se rompan.
Si los grupos aún son visibles después de 1 hora, agregue solución adicional de lisis de núcleos (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl;
1,0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) y repita la incubación.
7) Opcional: Agregue solución de ARNasa (1.5 µl para 300 µl de volumen de muestra; 15 µl para 3 ml de volumen de muestra) al nuclear
lisar y mezclar la muestra invirtiendo el tubo 2–5 veces. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 minutos y
luego enfriar a temperatura ambiente.
8. Agregue solución de precipitación de proteínas (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 1.0 ml para un volumen de muestra de 3 ml) al
lisado nuclear y agitar vigorosamente durante 10-20 segundos. Pequeños grupos de proteínas pueden ser visibles después del vórtice.
Nota: Si se agregó solución adicional de lisis de núcleos en el paso 6 , agregue un total de 130 µl de precipitación de proteína
Solución para 300 µl de volumen de muestra y 1.3 ml de solución de precipitación de proteínas para 3 ml de volumen de muestra.
9. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 3 minutos a temperatura ambiente para un volumen de muestra de 300 µl. Centrifugar a
2,000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente para un volumen de muestra de 3 ml.
Debe verse un gránulo de proteína marrón oscuro. Si no se observa pellet, consulte la Sección 4.
10. Para un volumen de muestra de 300 µl, transfiera el sobrenadante a un tubo limpio de microcentrífuga de 1.5 ml que contenga 300 µl de
isopropanol a temperatura ambiente. Para un volumen de muestra de 3 ml, transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 15 ml.
que contiene 3 ml de isopropanol a temperatura ambiente.
Nota: Puede que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el gránulo de proteína. Deja este líquido residual
en el tubo para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada.
11. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras blancas de ADN en forma de hilo formen una masa visible.
12. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente para 300 µl de muestra. Centrifugar a 2.000 × g
durante 1 minuto a temperatura ambiente para 3 ml de muestra. El ADN será visible como una pequeña bolita blanca.
13. Decantar el sobrenadante y agregar un volumen de muestra de etanol al 70% a temperatura ambiente al ADN. Invierta suavemente
el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN y los lados del tubo de microcentrífuga. Centrifugar como en el paso 12.
14. Aspire cuidadosamente el etanol usando una pipeta Pasteur estirada o una punta de pipeta de secuenciación. La pastilla de ADN
está muy flojo en este punto y se debe tener cuidado para evitar la aspiración del gránulo en la pipeta. Invierta el tubo
Limpie el papel absorbente y seque el sedimento al aire durante 10-15 minutos.
15. Agregue una solución de rehidratación de ADN (100 µl para un volumen de muestra de 300 µl; 250 µl para un volumen de muestra de 3 ml) al tubo y
rehidratar el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo.
Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente oa 4 ° C.
16. Almacene el ADN a 2–8 ° C.
Página 7
3.B. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 10 ml)
Se encuentra disponible un kit a gran escala para procesar hasta 1 litro de sangre completa (Cat. # A1620). Este kit no incluye
Solución RNase ya que el paso de digestión RNase es opcional. La solución de RNasa A (4 mg / ml) está disponible como un artículo separado
(Cat. # A7973). Si es necesario, se requiere un total de 5 ml de solución de RNasa A para procesar 1 litro de sangre.

• tubos de centrífuga estériles de 50 ml
1. Para muestras de sangre completa de 10 ml: agregue 30 ml de solución de lisis celular a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
! Importante: La sangre debe recogerse en tubos anticoagulantes con EDTA, heparina o citrato para evitar la coagulación.
2. Agite suavemente el tubo de sangre hasta que esté completamente mezclado; luego transfiera 10 ml de sangre al tubo que contiene el
Solución de lisis celular. Invierta el tubo 5–6 veces para mezclar.
3. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente (invertir 2-3 veces una vez durante la incubación) para lisar
los glóbulos rojos Centrifugar a 2.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
4. Retire y deseche la mayor cantidad de sobrenadante posible sin alterar el sedimento blanco visible. Aproximadamente
Quedarán 1,4 ml de líquido residual.
Si la muestra de sangre se ha congelado, agregue 30 ml adicionales de Solución de lisis celular, invierta 5–6 veces para mezclar, y
repita los pasos 3 y 4 hasta que el gránulo esté casi blanco. Puede haber alguna pérdida de ADN en muestras congeladas.
Nota: Algunos glóbulos rojos o restos celulares pueden verse junto con los glóbulos blancos. Si aparece la pastilla
para contener solo glóbulos rojos, agregue una alícuota adicional de Solución de lisis celular después de eliminar el sobrenadante
encima del sedimento celular y luego repita los pasos 3–4 .
5. Agite vigorosamente el tubo hasta que los glóbulos blancos se resuspendan (10-15 segundos).
! Resuspender completamente los glóbulos blancos para obtener una lisis celular eficiente.
Página 8
6. Agregue 10 ml de solución de lisis de núcleos al tubo que contiene las células resuspendidas. Pipetee la solución 5–6 veces para
Lisar los glóbulos blancos. La solución debería volverse muy viscosa. Si se ven grupos de células después de la mezcla,
incubar la solución a 37 ° C hasta que los grupos se rompan. Si los grupos aún son visibles después de 1 hora, agregue 3 ml
de solución adicional de lisis de núcleos y repetir la incubación.
7) Opcional: Añadir RNasa A, a una concentración final de 20 µg / ml, al lisado nuclear y mezclar la muestra por
invertir el tubo 2–5 veces. Incubar la mezcla a 37 ° C durante 15 minutos y luego enfriar a temperatura ambiente.
8. Agregue 3.3 ml de solución de precipitación de proteínas al lisado nuclear y agite vigorosamente durante 10 a 20 segundos.
Pequeños grupos de proteínas pueden ser visibles después del vórtice.
Nota: Si se agregó solución de lisis nuclear adicional en el paso 6 , agregue 4 ml de solución de precipitación de proteínas
(en lugar de 3,3 ml).
9. Centrifugar a 2.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Debe verse un gránulo de proteína marrón oscuro. Si no se observa pellet, consulte la Sección 4.
10. Transfiera el sobrenadante a un tubo de centrífuga de 50 ml que contenga 10 ml de isopropanol a temperatura ambiente.
Nota: Puede que quede algo de sobrenadante en el tubo original que contiene el gránulo de proteína. Dejar el líquido residual
12. Centrifugar a 2.000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente. El ADN será visible como una pequeña bolita blanca.
13. Decantar el sobrenadante y agregar 10 ml de etanol al 70% a temperatura ambiente al ADN. Invierta suavemente el tubo
varias veces para lavar el sedimento de ADN y los lados del tubo de centrífuga. Centrifugar como en el paso 12.
14. Aspire cuidadosamente el etanol. El sedimento de ADN está muy suelto en este punto y se debe tener cuidado para evitar
aspirando la bolita a la pipeta. Seque el gránulo al aire durante 10-15 minutos.
15. Agregue 800 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora.
Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando el
solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4 ° C.
Página 9
3.C. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (placa de 96 pocillos)
Este protocolo se puede escalar a 20 µl, 30 µl o 40 µl de sangre. La Tabla 2 describe los diversos volúmenes de solución utilizados en cada
paso. Las preparaciones de cincuenta microlitros generalmente producen ADN genómico en el rango de 0.2-0.7 µg, dependiendo del número de
leucocitos en la muestra de sangre.
Tabla 2. Volúmenes de reactivos necesarios para diversas cantidades iniciales de sangre.
Lisis Celular Proteína ADN

Solución Lisis de Nucleos Precipitación Rehidratación
Muestra (Lisis eritrocítica) Solución Solución Isopropanol Solución
20 µl 60 µl 20 µl 6,7 µl 20 µl 10 µl
30 µl 90 µl 30 µl 10 µl 30 µl 15 µl
40 µl 120 µl 40 µl 13,3 µl 40 µl 20 µl
50 µl 150 µl 50 µl 16,5 µl 50 µl 25 µl

• V-parte inferior placa de 96 pocillos (s) capaz de mantener el volumen de 300? L / pocillo (Costar ® Cat. # 3896)
• Selladores de placa de 96 pocillos (Costar ® Cat # 3095.) (Opcional; para su uso con sangre humana)
1. Agregue 150 µl de solución de lisis celular a cada pocillo.
! Importante: la sangre debe recogerse en tubos anticoagulantes con EDTA, heparina o citrato.
2. Agregue 50 µl de sangre fresca a cada pocillo y pipetee 2–3 veces para mezclar.
3. Deje la placa a temperatura ambiente durante 10 minutos, pipeteando la solución dos veces durante la incubación para ayudar
Lisar los glóbulos rojos.
4. Centrifugar a 800 × g durante 5 minutos en una centrífuga de mesa para concentrar las células.
5. Retire con cuidado y deseche la mayor cantidad de sobrenadante posible con una punta de micropipeta, dejando un pequeño
pellet de glóbulos blancos y algunos glóbulos rojos. El uso de una punta de pipeta extendida, como una punta de carga de gel, es
recomendado. Inclinar la placa de 96 pocillos a 50–80 ° (dependiendo de la cantidad de líquido presente por pocillo) permite
Eliminación más completa del líquido del pozo.
Página 10
6. Agregue 50 µl de solución de lisis de núcleos a cada pocillo y pipetee 5–6 veces para resuspender el sedimento y lisar el blanco.
células de sangre. La solución debería volverse más viscosa. Como ayuda en la visualización de pellets de ADN, 2 µl por pocillo de un
El portador (p. ej., Polyacryl Carrier [Molecular Research Center, Inc., Cat. # PC152]) se puede agregar en este paso. ADN
los rendimientos son generalmente equivalentes con o sin uso del portador.
7. Agregue 16.5 µl de solución de precipitación de proteínas por pocillo y pipetee 5-6 veces para mezclar.
8. Centrifugar a 1.400 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Una pastilla de proteína marrón debe ser visible. Si no
el pellet es visible, consulte la Sección 4.
9. Precipitación / rehidratación de ADN en una placa de 96 pocillos
a. Transfiera cuidadosamente los sobrenadantes a pozos limpios que contengan 50 µl por pozo de temperatura ambiente
isopropanol y mezclar por pipeteo.
Nota: Parte del sobrenadante puede permanecer en el pozo original que contiene el gránulo de proteína. Deja este residual
líquido en el pozo para evitar contaminar la solución de ADN con la proteína precipitada. Como en el paso 5 , inclinando el
la placa facilitará la eliminación del líquido del pozo. El uso de una punta de pipeta extendida en este paso no permite
mezcla de muestra con isopropanol.
si. Centrifugar a 1.400 × g durante 10 minutos. Retire con cuidado el isopropanol con una punta de micropipeta.
C. Añadir 100 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente por pocillo.
re. Centrifugar a 1.400 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
mi. Aspire cuidadosamente el etanol usando una pipeta Pasteur extraída o una punta de pipeta de secuenciación. El cuidado debe ser
tomado para evitar aspirar el sedimento de ADN. Coloque la bandeja en un ángulo de 30–45 ° y seque al aire durante 10–15 minutos.
F. Agregue 25 µl de solución de rehidratación de ADN a cada pocillo. Permita que el ADN se rehidrate durante la noche a temperatura ambiente.
temperatura o a 4 ° C.
sol. Almacene el ADN a 2–8 ° C.

Nota: Pequeños volúmenes de ADN se pueden recolectar fácilmente en el fondo de un pozo en V centrifugando brevemente el pozo de 96
placa antes de usar.
Página 11
3.D. Aislamiento de ADN genómico de células de cultivo de tejidos y tejido animal

• Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml
• Tubos de centrífuga de 15 ml (para tejido animal)
• homogeneizador pequeño (Fisher Tissue Tearor, Cat. # 15-338-55, o equivalente) (para tejido animal)
• tripsina (solo para células de cultivo de tejidos adherentes)
• PBS (para células de cultivo de tejidos)
• nitrógeno líquido (opcional; para células de cultivo de tejidos, Paso 1.d; para molienda de tejidos animales, Paso 2.b, en lugar de pequeños
homogeneizador; y para la cola del ratón, Paso 3.b)
• mortero y mano de mortero (opcional; para moler tejidos de animales, Paso 2.b, en lugar de un pequeño homogeneizador; y para ratones
cola, paso 3.b)
• Baño de agua a 95 ° C (opcional; para células de cultivo de tejidos, Paso 1.d)
• 0.5M EDTA (pH 8.0) (para cola de ratón)
• Proteinasa K (20 mg / ml en agua; Cat. # V3021) (para cola de ratón)
• Baño de agua a 55 ° C (para cola de ratón)
1. Células de cultivo de tejidos
a. Coseche las células y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para las células adherentes, tripsinice las células.
antes de la cosecha.
si. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 10 segundos para sedimentar las células.
C. Retire el sobrenadante, dejando atrás el sedimento celular más 10–50 µl de líquido residual.
re. Añadir 200 µl de PBS para lavar las células. Centrifugue como en el Paso 1.b, y retire el PBS. Agitar vigorosamente para
resuspender las células.
Nota: Para las células que no se lisan bien en la solución de lisis de núcleos sola (p. Ej., Células PC12), realice una operación adicional
paso de congelación-descongelación de la siguiente manera antes de continuar con el Paso 1.e: Lave las células como en el Paso 1.d; luego congelar en líquido
nitrógeno. Descongele las células calentando a 95 ° C. Repita este procedimiento para un total de 4 ciclos.
mi. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos y pipetee para lisar las células. Pipetee hasta que no queden grupos de células visibles.
F. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.

2. Tejido animal (hígado y cerebro de ratón)
a. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos a un tubo de centrífuga de 15 ml y enfríe en hielo.
si. Agregue 10–20 mg de tejido fresco o descongelado a la solución de lisis de núcleos enfriada y homogeneice durante 10 segundos
usando un pequeño homogeneizador. Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Alternativamente, muela el tejido
en nitrógeno líquido usando un mortero y una mano de mortero que ha sido preenfriado en nitrógeno líquido. Después de moler,
permita que se evapore el nitrógeno líquido y transfiera aproximadamente 10–20 mg del tejido molido a 600 µl
de solución de lisis de núcleos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
Pagina 12
C. Incubar el lisado a 65 ° C durante 15-30 minutos.
re. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.
3. Tejido animal (cola de ratón)
a. Para cada muestra a procesar, agregue 120 µl de una solución de EDTA 0.5M (pH 8.0) a 500 µl de lisis de núcleos
Solución en un tubo de centrífuga. Relájate en hielo.
Nota: La solución se volverá turbia cuando se enfríe.
si. Agregue 0.5–1cm de cola de ratón fresca o descongelada a un tubo de microcentrífuga de 1.5ml.
Nota: El tejido se puede moler a un polvo fino en nitrógeno líquido usando un mortero y una mano de mortero que ha sido
preenfriado en nitrógeno líquido. Luego transfiera el polvo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
C. Agregue 600 µl de EDTA / solución de lisis de núcleos del paso 3.a al tubo.
re. Añadir 17.5 µl de 20 mg / ml de Proteinasa K.
mi. Incubar durante la noche a 55 ° C con agitación suave. Alternativamente, realice una incubación de 3 horas a 55 ° C (con
sacudida); agite en vórtex la muestra una vez por hora si realiza una incubación de 3 horas. Asegúrate de que la cola esté
completamente digerido
4) Opcional para la cola del ratón: agregue 3 µl de solución de ARNasa al lisado nuclear y mezcle la muestra invirtiendo el
tubo 2–5 veces. Incubar la mezcla durante 15-30 minutos a 37 ° C. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente
durante 5 minutos antes de continuar.
5. A la muestra a temperatura ambiente, agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad.
por 20 segundos Enfríe la muestra en hielo durante 5 minutos.
6. Centrifugar durante 4 minutos a 13,000–16,000 × g . La proteína precipitada formará un granulado blanco apretado.
7. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene el ADN (dejando atrás el sedimento de proteínas) y transfiéralo a un
Limpie el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente.
9. Centrifugar durante 1 minuto a 13,000–16,000 × g a temperatura ambiente. El ADN será visible como un pequeño blanco
bolita. Decantar cuidadosamente el sobrenadante.
10. Agregue 600 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el ADN.
Centrifugar durante 1 minuto a 13,000–16,000 × g a temperatura ambiente.
11. Aspire cuidadosamente el etanol usando una pipeta Pasteur estirada o una punta de pipeta de secuenciación. El sedimento de ADN es
muy flojo en este punto, y se debe tener cuidado para evitar aspirar el pellet en la pipeta.
12. Invierta el tubo en papel absorbente limpio y seque el sedimento al aire durante 10-15 minutos.
13. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN y rehidrate el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora. Periódicamente
mezcle la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución sobre
noche a temperatura ambiente o a 4 ° C.
Página 13
3.E. Aislamiento de ADN genómico del tejido vegetal

• nitrógeno líquido
• Tubo de microcentrífuga de mano o mortero y mano de mortero
1. Procese el tejido de la hoja congelándolo con nitrógeno líquido y moliéndolo en un polvo fino usando un tubo de microcentrífuga
maja o un mortero y maja. Agregue 40 mg de esta hoja en polvo a un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.
2. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos y agite 1–3 segundos para humedecer el tejido.
3. Incubar a 65 ° C durante 15 minutos.
4. Agregue 3 µl de solución de RNasa al lisado celular y mezcle la muestra invirtiendo el tubo 2–5 veces. Incubar el
mezcla a 37 ° C durante 15 minutos. Deje que la muestra se enfríe a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de continuar.
5. Agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos.
6. Centrifugar durante 3 minutos a 13,000–16,000 × g . Las proteínas precipitadas formarán un granulado apretado.
7. Retire con cuidado el sobrenadante que contiene el ADN (dejando atrás el sedimento de proteínas) y transfiéralo a un
Limpie el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente.
8. Mezcle suavemente la solución por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilo formen una masa visible.
9. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.
10. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. Agregue 600 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente e invierta suavemente el tubo varias veces.
veces para lavar el ADN. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 1 minuto a temperatura ambiente.
11. Aspire cuidadosamente el etanol usando una pipeta Pasteur estirada o una punta de pipeta de secuenciación. El sedimento de ADN es
muy flojo en este punto y se debe tener cuidado para evitar aspirar el pellet en la pipeta.
12. Invierta el tubo sobre papel absorbente limpio y seque el sedimento al aire durante 15 minutos.
13. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN y rehidrate el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora. Periódicamente
mezcle la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución sobre
noche a temperatura ambiente o a 4 ° C.
Página 14
3.F. Aislamiento de ADN genómico de levadura

• Caldo YPD
• EDTA 50 mM (pH 8.0)
• líticasa (Sigma Cat. # L2524), resuspendida con agua libre de nucleasa hasta una concentración final de 75 unidades / µl
1. Añadir 1 ml de un cultivo cultivado durante 20 horas en caldo YPD a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 2 minutos para sedimentar las células. Eliminar el sobrenadante.
3. Resuspender las células a fondo en 293 µl de 50 mM EDTA.
4. Agregue 7,5 µl de 75 unidades / µl de líticasa y pipetee suavemente 4 veces para mezclar.
5. Incubar la muestra a 37 ° C durante 30–60 minutos para digerir la pared celular. Enfriar a temperatura ambiente.
6. Centrifugue la muestra a 13,000–16,000 × g durante 2 minutos y luego retire el sobrenadante.
7. Agregue 300 µl de solución de lisis de núcleos al sedimento celular y pipetee suavemente para mezclar.
8. Agregue 100 µl de solución de precipitación de proteínas y agite vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos.
9. Deje que la muestra repose en hielo durante 5 minutos.
10. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 3 minutos.
11. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo limpio de microcentrífuga de 1.5 ml que contiene 300 µl de espacio
temperatura isopropanol.
12. Mezcle suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilo formen una masa visible.
14. Decantar cuidadosamente el sobrenadante y drenar el tubo sobre papel absorbente limpio. Añadir 300 µl de temperatura ambiente
70% de etanol e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.
15. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 2 minutos. Aspire cuidadosamente todo el etanol.
16. Drene el tubo sobre papel absorbente limpio y permita que el gránulo se seque al aire durante 10-15 minutos.
17. Agregue 50 µl de solución de rehidratación de ADN.
18. Añadir 1,5 µl de solución de ARNasa a la muestra de ADN purificada. Agitar en vórtex la muestra durante 1 segundo. Centrifugar brevemente en un
microcentrifugar durante 5 segundos para recoger el líquido e incubar a 37 ° C durante 15 minutos.
Página 15
3.F. Aislamiento de ADN genómico de levadura (continuación)
19. Rehidrate el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora. Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo.
Alternativamente, rehidrate el ADN incubando la solución durante la noche a temperatura ambiente oa 4 ° C.
20. Almacenar el ADN a 2–8 ° C.
3.G. Aislamiento de ADN genómico de bacterias Gram positivas y Gram negativas

• EDTA 50 mM (pH 8.0) (para bacterias gram positivas)
• 10 mg / ml de lisozima (Sigma Cat. # L4919) (para bacterias gram positivas)
• 10 mg / ml de lisostafina (Sigma Cat. # L7386) (para bacterias gram positivas)
1. Agregue 1 ml de un cultivo nocturno a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 2 minutos para sedimentar las células. Eliminar el sobrenadante. Para Gram Positivo
Bacterias, continúe con el Paso 3. Para Bacterias Gram Negativas vaya directamente al Paso 6.
3. Resuspender las células a fondo en 480 µl de EDTA 50 mM.
4. Agregue la (s) enzima (s) lítica (s) apropiada (s) al sedimento celular resuspendido en un volumen total de 120 µl, y pipetee suavemente
mezcla. El propósito de este pretratamiento es debilitar la pared celular para que pueda realizarse una lisis celular eficiente.
Nota: Para ciertas especies de Staphylococcus , una mezcla de 60 µl de lisozima de 10 mg / ml y 60 µl de 10 mg / ml
La lisostafina es necesaria para una lisis eficiente. Sin embargo, muchas cepas bacterianas grampositivas (p. Ej., Bacillus subtilis ,
Micrococcus luteus , Nocardia otitidiscaviarum , Rhodococcus rhodochrous y Brevibacterium albidium ) lisis
usando eficientemente lisozima sola.
5. Incubar la muestra a 37 ° C durante 30–60 minutos. Centrifugue durante 2 minutos a 13,000–16,000 × gy retire el
flotante.
6. Agregue 600 µl de solución de lisis de núcleos. Pipetee suavemente hasta que las células se resuspendan.
7. Incubar a 80 ° C durante 5 minutos para lisar las células; luego enfriar a temperatura ambiente.
8. Agregue 3 µl de solución de RNasa al lisado celular. Invierta el tubo 2–5 veces para mezclar.
9. Incubar a 37 ° C durante 15–60 minutos. Enfriar la muestra a temperatura ambiente.
10. Agregue 200 µl de solución de precipitación de proteínas al lisado celular tratado con RNasa. Vórtice vigorosamente a alta velocidad para
20 segundos para mezclar la solución de precipitación de proteínas con el lisado celular.
11. Incubar la muestra en hielo durante 5 minutos.
Página 16
13. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN a un tubo limpio de microcentrífuga de 1.5 ml que contiene 600 µl de espacio
temperatura isopropanol.
14. Mezcle suavemente por inversión hasta que las hebras de ADN en forma de hilo formen una masa visible.
16. Con cuidado, vierta el sobrenadante y drene el tubo sobre papel absorbente limpio. Agregar 600 µl de temperatura ambiente
70% de etanol e invierta suavemente el tubo varias veces para lavar el sedimento de ADN.
17. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 2 minutos. Aspire cuidadosamente el etanol.
18. Drene el tubo sobre papel absorbente limpio y permita que el gránulo se seque al aire durante 10-15 minutos.
19. Agregue 100 µl de solución de rehidratación de ADN al tubo y rehidrate el ADN incubando a 65 ° C durante 1 hora.
Mezcle periódicamente la solución golpeando suavemente el tubo. Alternativamente, rehidrate el ADN incubando el
solución durante la noche a temperatura ambiente o a 4 ° C.
20. Almacenar el ADN a 2–8 ° C.
4. Solución de problemas
Para preguntas que no se aborden aquí, comuníquese con su sucursal o distribuidor local de Promega. Información del contacto
disponible en: www.promega.com . Correo electrónico: techserv@promega.com
Síntomas Comentarios
Coágulos de sangre presentes en muestras de sangre. El tubo puede haber sido almacenado incorrectamente; la sangre no era
Se usaron tubos completamente mezclados o inapropiados para dibujar
sangre. Deseche la sangre coagulada y extraiga nuevas muestras usando
Tubos anticoagulantes tratados con EDTA, heparina o citrato.
Bajo rendimiento de ADN La muestra de sangre puede contener muy pocos glóbulos blancos. Dibujar
Nuevas muestras de sangre.
El sedimento de glóbulos blancos no se resuspendió completamente en

Paso 5 de la Sección 3.A o B. El sedimento de glóbulos blancos debe ser
agitó vigorosamente para resuspender las células.
La muestra de sangre era demasiado vieja. Los mejores rendimientos se obtienen con
sangre fresca. Muestras que se han almacenado a 2–8 ° C por más
más de 5 días pueden dar rendimientos reducidos.
El sedimento de ADN se perdió durante la precipitación de isopropanol. Utilizar

cuidado extremo al eliminar el isopropanol para evitar perder el
bolita.
Página 17
4. Solución de problemas (continuación)
Síntomas Comentarios
ADN degradado (<50 kb de tamaño) Recolección o almacenamiento incorrecto de la muestra de sangre. Obtener un
nueva muestra en las condiciones adecuadas.
Bajo rendimiento de ADN con Gram positivo Los cultivos que crecen durante un tiempo prolongado contienen una alta proporción
protocolo de bacterias de células que se lisan fácilmente tras la exposición al tratamiento con lisostafina.
Comience las purificaciones con una cultura saludable.
Sin pellet proteico La muestra no se enfrió a temperatura ambiente antes de agregar
la solución de precipitación de proteínas. Enfriar la muestra a la habitación
temperatura (al menos 5 minutos) o enfriar en hielo durante 5 minutos,
agitar 20 segundos, centrifugar durante 3 minutos a 13,000–16,000 × g
(10 minutos a 2.000 × g para un volumen de muestra de 3 ml) y proceder
con el protocolo
La solución de precipitación de proteínas no se mezcló completamente

con el lisado nuclear. Mezcle siempre el lisado nuclear y
Solución de precipitación de proteínas por completo.
Pellet de ADN difícil de disolver Las muestras pueden haberse secado demasiado. Rehidratar el ADN por incubación
1 hora a 65 ° C, y luego dejar la muestra a temperatura ambiente
tura o 4 ° C durante la noche. Precaución: no deje el ADN a 65 ° C
durante la noche.
Las muestras no se mezclaron durante la etapa de rehidratación. Recuerda

mezclar las muestras periódicamente durante el paso de rehidratación.
5. Referencias
1. Miller, SA, Dykes, DD y Polesky, HF (1988) Un procedimiento simple de extracción para extraer ADN de
células nucleadas humanas. Nucl. Acidos Res. 16 , 1215.
2. Beutler, E., Gelbart, T. y Kuhl, W. (1990) Interferencia de la heparina con la reacción en cadena de la polimerasa.
BioTechniques 9 , 166.
3. Departamento de Trabajo de los Estados Unidos, Administración de Seguridad y Salud Ocupacional (1991) Exposición ocupacional a
patógenos transmitidos por la sangre, regla final. Registro Federal 56 , 64175.
dieciséis
Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 EE. UU. · Llamada gratuita en EE. UU. 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516
Página 18
6. Apéndice
6.A. Composición de tampones y soluciones
Solución de rehidratación de ADN (provista) RNase A

Tris-HCl 10 mM (pH 7,4)
Disolver RNasa A a 4 mg / ml en rehidratación de ADN
EDTA 1 mM (pH 8.0) Solución, hervir 10 minutos para eliminar la DNasa contaminante
y almacenar en alícuotas a –20 ° C. Esta solución también es
disponible de Promega (Cat. # A7973).
6.B. Productos relacionados
Sistemas de purificación de ADN

Producto Talla Gato.#
Sistema de purificación de ADN genómico ReadyAmp ™ 100 reacciones A7710
Sistema de purificación de ADN Wizard ® Plus SV Minipreps 50 preparaciones A1330
Sistema de purificación de ADN Wizard ® Plus SV Minipreps + adaptadores de vacío 50 preparaciones A1340
Sistema de purificación de ADN Wizard ® Plus SV Minipreps 250 preparaciones A1460
Sistema de purificación de ADN Wizard ® Plus SV Minipreps + adaptadores de vacío 250 preparaciones A1470
Adaptadores de vacío 20 cada uno A1331
Sistemas de amplificación de ADN
Producto Talla Gato.#

GoTaq ® PCR Core System I 200 reacciones M7660
GoTaq ® PCR Core System II 200 reacciones M7665
7. Resumen del cambio
Se realizó el siguiente cambio en la revisión 5/17 de este documento:
1. Actualización Sigma Cat. # Para lisozima de 10 mg / ml, Sección 3.G.
Página 19
© 1999, 2002, 2005, 2009, 2010, 2014, 2017 Promega Corporation. Todos los derechos reservados.
GoTaq y Wizard son marcas registradas de Promega Corporation. ReadyAmp es una marca registrada de Promega Corporation.
Costar es una marca registrada de Corning, Inc.
Los productos pueden estar cubiertos por patentes pendientes o emitidas o pueden tener ciertas limitaciones. Por favor visite nuestro sitio web para más información.
Todos los precios y especificaciones están sujetos a cambios sin previo aviso.
Las reclamaciones de productos están sujetas a cambios. Póngase en contacto con los servicios técnicos de Promega o acceda al catálogo en línea de Promega para obtener la información más actualizada.
información sobre los productos Promega.
18 añosPromega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 EE. UU. · Llamada gratuita en EE. UU. 800-356-9526 · 608-274-4330 · Fax 608-277-2516

Manual Técnico Del Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard (R) TM050

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Manual Técnico Del Kit de Purificación de ADN Genómico Wizard (R) TM050

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Página 1

ADN genómico Wizard ®

ADN genómico Wizard ®

1. Descripción ............................................... .................................................. ........................................ 1

2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento ........................................... ............................................. 2

3. Protocolos para el aislamiento del ADN genómico ........................................... .................................................. ...... 4

4. Solución de problemas ............................................... .................................................. ............................... 15

5. Referencias ............................................... .................................................. ....................................... dieciséis

6. Apéndice ............................................... .................................................. ......................................... 17

7. Resumen del cambio ............................................. .................................................. ........................... 17

2. Componentes del producto y condiciones de almacenamiento

Aislamiento a pequeña escala (minipreps)

Kit de purificación de ADN genómico Wizard ® 100 aislamientos A1120

Kit de purificación de ADN genómico Wizard ® 500 aislamientos A1125

Aislamiento a gran escala (maxiprep)

Kit de purificación de ADN genómico Wizard ® 100 aislamientos A1620

Nota: Cat. # A1620 no incluye la solución RNase A.

Artículos disponibles por separado

Solución de lisis celular 1L A7933

Sangre entera humana

3. Protocolos para el aislamiento del ADN genómico.

3.A. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (300 µl o 3 ml de volumen de muestra)

Materiales a suministrar por el usuario

16. Almacene el ADN a 2–8 ° C.

3.B. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (volumen de muestra de 10 ml)

Materiales a suministrar por el usuario

9. Centrifugar a 2.000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

16. Almacene el ADN a 2–8 ° C.

3.C. Aislamiento de ADN genómico de sangre total (placa de 96 pocillos)

Tabla 2. Volúmenes de reactivos necesarios para diversas cantidades iniciales de sangre.

Lisis Celular Proteína ADN

Materiales a suministrar por el usuario

1. Agregue 150 µl de solución de lisis celular a cada pocillo.

9. Precipitación / rehidratación de ADN en una placa de 96 pocillos

C. Añadir 100 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente por pocillo.

re. Centrifugar a 1.400 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

sol. Almacene el ADN a 2–8 ° C.

3.D. Aislamiento de ADN genómico de células de cultivo de tejidos y tejido animal

Materiales a suministrar por el usuario

1. Células de cultivo de tejidos

si. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 10 segundos para sedimentar las células.

F. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.

C. Incubar el lisado a 65 ° C durante 15-30 minutos.

re. Continúe con la Sección 3.D, Paso 4.

3. Tejido animal (cola de ratón)

re. Añadir 17.5 µl de 20 mg / ml de Proteinasa K.

3.E. Aislamiento de ADN genómico del tejido vegetal

Materiales a suministrar por el usuario

3. Incubar a 65 ° C durante 15 minutos.

9. Centrifugar a 13,000–16,000 × g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

14. Almacene el ADN a 2–8 ° C.

3.F. Aislamiento de ADN genómico de levadura

Materiales a suministrar por el usuario

3. Resuspender las células a fondo en 293 µl de 50 mM EDTA.

4. Agregue 7,5 µl de 75 unidades / µl de líticasa y pipetee suavemente 4 veces para mezclar.

6. Centrifugue la muestra a 13,000–16,000 × g durante 2 minutos y luego retire el sobrenadante.

9. Deje que la muestra repose en hielo durante 5 minutos.

10. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 3 minutos.

13. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 2 minutos.

15. Centrifugar a 13,000–16,000 × g por 2 minutos. Aspire cuidadosamente todo el etanol.

17. Agregue 50 µl de solución de rehidratación de ADN.

20. Almacenar el ADN a 2–8 ° C.

3.G. Aislamiento de ADN genómico de bacterias Gram positivas y Gram negativas