Campuzano Márquez Pamela Lobato Ramos Alejandra Soriano Pineda Iveett

MORFOLOGÍA BACTERIANA
Las bacterias, microorganismos unicelulares englobados en el reino Procaryotae pueden presentar una morfología: ‡ En forma esférica: (coco). ‡ En forma cilíndrica (bacilo). ‡ En forma helicoidal.

COCOS
CONDICIONES SE ENCUENTRAN

Dependiendo de los planos de división celular y de la mayor o menor capacidad de separación o adherencia de las células hijas, los cocos pueden aparecer

Aislados.(individualizad os) Agrupados.

AISLADOS:

AGRUPADOS:
en parejas (diplococos). En Cadenas (estreptococos).

En Racimos (estafilococos).

Tétradas (agrupación 4 elemntos). Sarcinas (agrupación 8 elementos).

BACILOS: (L.baccillus: baston) Individualmente:

‡ Bacilo común: en forma de bastón. ‡ Claviforme: terminación en clava o maza. ‡ Fusiformes: extremos afilados. ‡ Cortados a pico o en forma recta. ‡ Filamentosos (ramificaciones).

AGRUPADOS:
Estreptobacilos (en cadenas). Empalizada. Agrupados en letras.

Cocobacilos.

HELICOIDALES O ESPIRALES: SE CLASIFICAN SEGÚN:
‡ El número de curvaturas ‡ Cuerpo rígido o flexible (poseen filamentos internos contráctiles). Rígido: Vibriones. (1 c) Espirilos. (2c)

FLEXIBLES:
Borrelia. Treponema. Leptoespira. Pleomorfismo:La morfología no siempre es constante pueden presentar forma de estrella, piriformes, discoidales con apéndices o yemas y planas cuadrangulares.

TAMAÑO BACTERIANO

Unidades de medida bacteriana: Micra (µ) o micrómetro (µm). (10¯³mm) Nanómetro (nm). (10¯ mm) Diámetro de los cocos: +/- 0.5 a 2 µm Bacilos: ancho: 0.2-2 µm largo: 2-20 µm

ESTRUCTURAS BACTERIANAS: Capsula: Es la estructura mas externa, rígida, compuesta por polisacáridos y glucoproteinas. Sirve como cubierta protectora resistiendo a la fagocitosis.

Pared Celuar: Con un esqueleto de petidoglucanos o mureina. Da esructura y protege a la bacteria de la lisis.

FLAGELOS:
Responsable de la movilidad bacteriana. Clasificados por numero y disposición:

Átrica Monótrica Anfítrica Lofótrica Perítrica

GRÁNULOS METACROMÁTICOS:

De polifosfato. Acumulan fosfato cuando la síntesis de ácidos nucleicos está impedida. Se tiñen de color púrpura con azul de metileno y se usan para identificar ciertas bacterias.
Gránulos metacrormáticos en los Ms (Giemsa x400).

ESPORAS (G. CLOSTRIDIUM Y BACILLUS)
Algunas bacterias producen formas de resistencia llamadas esporas (metabólicamente inactivas) que pueden sobrevivir en condiciones desfavorables tales como el calor o la sequía. bajo condiciones ambientales apropiadas, pueden germinar.

Las esporas que se forman dentro de la célula se llaman endoesporas, produciéndose una por célula. Existen distintos tipos según su forma (ovoides, esféricas) y localización dentro de la célula (centrales, subterminales y terminales).

TINCIÓN SIMPLE *Utilizan un solo colorante *Las estructuras se tiñen con la misma tonalidad *Se utiliza para ver la morfología y arreglo en el crecimiento de las bacterias

TINTA CHINA
Utilizada para la observación de esporas (mecanismo de defensa) Y para la tinción negativa, con la cual se observa la cápsula bacteriana

AZUL DE METILENO
Se utilizan para observar morfología y agrupación Para tinción de bacterias alcohol ácido resistente como bacilos de Tuberculosis o la lepra En este método esta solución es considerada como colorante de contraste, por lo que tiñe de color azul los tejidos de soporte y otras estructuras orgánicas de los bacilos

AZUL DE LACTOFENOL
Usado para la observación de hongos : -El fenol destruye la flora acompañante, el acido láctico conserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de gradiente osmótico con relación al interior del fúngico generando una película -Azul de algodón posee la capacidad de adherirse a la quitina presente en las hifas y conidios y de los hongos microscópicos

FROTIS

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos

PREPARACIÓN DE UN FROTIS *Colocar una pequeña gota de
agua en el centro de un portaobjetos limpio

*Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua. *Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión homogénea que quede bastante extendida para facilitar su secado.

FIJACIÓN DE LAS BACTERIAS AL PORTAOBJETOS
Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos Con metanol (para bacterias procedentes de medio líquido). Añadir unas gotas de metanol sobre la extensión completamente seca. Esperar a que el metanol se evapore completamente.

TINCIÓN DEL FROTIS BACTERIANO
*

Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo que indique el protocolo de cada tinción concreta. Suele oscilar entre 1 y 5 minutos.

Lavar la preparación con agua para eliminar el colorante. Esta operación se realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido directamente sobre él, pues podría arrastrar parte del frotis consigo

* Secar el porta presionando entre dos papeles filtro, pero en ningún caso se debe frotar el portaobjetos. * Observar la preparación al microscopio

MONTAJE DEFINITIVO DE LA PREPARACIÓN
Pasar sucesivamente los portaobjetos por las siguientes soluciones manteniéndolos un mínimo de 5 minutos en cada baño. El objetivo es que la preparación quede totalmente deshidratada. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño.  Alcohol de 70º  Alcohol de 95º  Acetona pura  Acetona-xilol (1:1)  Xilol

TINCIONES COMPUESTAS O DIFERENCIALES (COMBINADAS)

Se utilizan para mostrar las diferencias entre bacterias; se denominan compuestas porque se emplea más de un colorante. Las más utilizadas en microbiología son de Gram y Ziehl-Neelsen

COMPONENTES DE GRAM Y ZIEHLNEELSEN
1. COLORANTE PRINCIPAL O PRIMARIO; básico que a las células cargadas negativamente las colorea 2. MORDIENTE: permite al colorante actual con más intensidad y que se fije a las células (sales metálicas, solución yodada o lugol, tanino y fenol). 3. AGENTE DECOLORANTE: disolvente orgánico como el alcohol, un ácido o alcohol acetona. 4. CONTRACTOR O COLORANTE SECUNDARIO; Colorante básico de distinto color que el primer colorante

TINCIÓN DE GRAM (COLORACIÓN)
Además de observar las bacterias permite diferenciar los dos grandes grupos:

TÉCNICA PARA GRAM
1. Ya fijo el extendido cubrir la superficie con cristal violeta o con violeta de genciana (colorante primario) por un minuto. 2. Lavar con abundante agua 3. Cubrir con lugol (mordiente) durante 1 minuto 4. Lavar con abundante agua 5. Inclinar el portaobjeto y dejar gotear al alcohol de acetona (decolorante) hasta que deje de perder color 6. Lavar con agua 7. Cubrir el preparado con fucsina básica (contracolor) por 1 min 8. Lavar con agua 9. Dejar secar el preparado al aire 10. Observar con objetivo de inmersión

FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM
‡ La afinidad gram positiva o negativa depende de la composición química de la pared celular en la parte de su estructura física ‡ Después de las primeros 4 pasos, al observar al microscopio todo se ve violeta ‡ Luego del decolorante algunas conservan su color mientras que otras se decoloran. ‡ Las violetas son Gram positivas, las que pierden su color son gram negativas, pues los decolorantes orgánicos utilizados abren poros de la membrana externa de las bacterias gramnegativas (principalmente de lipoproteínas y lipopolisacáridos), permiten la salida del colorante principal; al agregar el contracolor éstos quedan rojos . ‡ La fuscina a veces es reemplazada por rojo congo o safranina

Escherichia- coli Tinción de Gram

COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Las Mycobacterium las especies Corynebacterium y algunas veces con los actinomicetos, no se tiñen con la coloración de Gram. La presente es una técnica ácido-alcohol resistente ideada por Erlich.

TÉCNICA
1. Ya fijo con la superficie cubierta con carbolfuscina como colorante principal (fucsina)+ un primer mordiente (ácido fénico o carbólico) 2. Calor por 5 min con un hisopo encendido hasta que haya vapor (calor mordiente físico o segundo mordiente) 3. Lavar con abundante agua 4. Inclinar el portaobjetos y gotear el ácido alcohol (decolorantes: ácido sulfúrico al 3% en el alcohol etílico al 95%) hasta que deje de transmitir calor. 5. Lavar con abundante agua 6. Cubrir el preparado con azul de metileno (contracolor) por 1 min 7. Lavar con agua 8. Dejar secar el preparado al aire 9. Observar el preparado con objetivo de inmersión

FUNDAMENTO DE LA COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Manifiesta la capacidad de resistir a la decoloración gracias al alto contenido de lípidos complejos (ácidos micólicos) y ceras que poseen algunos microorganismos en su pared celular. Los que resisten la decoloración se llaman ácido alcohol resistentes AAR y se ven rojos mientras que se tiñen azul son los no ácido alcohol reisistentes (no AAR).
Tinciones de Ziehl-Neelsen y PAS sin nada a destacar.

Formación nodular de 3 cm de diámetro máximo, compatible con ganglio linfático que muestra superficie externa lisa con restos de tejido adiposo, y superficie de corte amarillenta homogénea

COLORACIÓN DE GIEMSA
Modificación de la de Romanowsky (azul de metileno y eosina) : Para diferenciar lo intracelular de lo extracelular de parásitos en sangre circulante en las especies como plasmodium y Leishmania, Para demostración de formas de levaduras de Candida, Histoplasma capsulatum y Pneumocystis carinii, para la observación de especies Mollicutes, especies de Rickettsia y cuerpos elementales de especies de Chlamydia. En laboratorios de hematología para demostrar la diferencia entre el núcleo y el citoplasma de las distintas células sanguíneas.

TINCIÓN NEGATIVA
El colorante no tiñe los microorganismos, se queda alrededor de ellos. Se usa tinta china (suspensión de partículas de carbón coloidal) o nigrosina (colorante negro insoluble en agua) Se usa para encontrar presencia de cápsulas alrededor de las células microbianas y micóticas, ya que este elemento no se tiñe con bases. Para examinar estas tinciones debe aumentarse el contraste cerrando el diafragma del condensador, la cápsula parece un halo que se ve gris en el fondo negro.

TINCIÓN DE ENDOSPORAS
Ya que las endosporas poseen cubiertas exclusivas para teñirlas se requiere calor para que el colorante pueda penetrar se usa el verde de malaquita y safranina o fucsina (tiñe contraste en formas vegetativas)
Según lo visto con aceite de inmersión, la presencia de endosporas teñidas de verde con malaquita verde y las células vegetativas se tiñe con safranina. Sin errores el material verde que puede estar presente en la diapositiva después de la tinción de endosporas -las endosporas son simétricos en forma y apariencia, y más pequeñas que las células vegetativas (varios se indican con flechas de color negro). En este grupo, endosporas quedan algunos dentro de las células (un ejemplo de una endospora en una celda se muestra por la flecha azul), prácticamente todos han sido liberados

TINCIÓN DE FLAGELOS Y CILIOS
Estructuras muy delgadas se realiza una suspensión coloidal de sales de ácido tánico (mordiente) que forman un precipitado que se deposita sobre las estructurasy a la fucsina ácida los cilios y flagelos pueden ser visualizados como estructuras de color rojo.

COLORACIONES FLUORESCENTES
Se usan colorantes llamados fluorocromos que se iluminan con luz especial como : naranja de acridina (afinidad especial por el ácido nucleico) rodamina-auramina (ácidos micólicos de las paredes de micobacterias) y el blanco coflúor (afinidad hacia celulosa, levaduras, hifas y seudohifas).

Naranja de acridina susceptibilidad del ADN del espermatozoide al ácido inducido por la desnaturalización in situ por cuentificación del cambio metacromático del naranja de acridina fluorescente del verde (ADN natural) al rojo (ADN desnaturalizado

BIBLIOGRAFÍA
Negroni Marta ´Microbiología estomatológica , Editorial Médica Panamericana S. A., Buenos Aires 1999. Liebana Ureña J. ´Microbiología oral 2ª Ed. Interamericana de España Mc Graw- Hill, Madrid, 1995

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