Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido.

DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cualitativo CG
Parámetros de retención -Tiempo de retención → si se mantienen
constantes longitud, fase estacionaria, espesor de film, temperatura y
presión (flujo de carrier). • Comparación directa de tR, válida
sólo si la muestra está compuesta
por los compuestos usados en el
estándar (alcoholes)
• Coinyección: muestra + estandar
• tR es característico para un
sistema cromatográfico
determinado, pero no es
unívoco ⇒ no se puede usar
como confirmación cualitativa.


• =  
tR relativo

 

Más reproducible
• Indices de Kovats
1
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Detectores selectivos y detectores duales
FID → universal
FTD → N, P
FPD → S, P
The ingredient of peak B
appears to be a phosphorus
compound, since both FTD and
FPD detect it.
Peaks A and C are detected by
FPD only; therefore, these
appear to be sulfur compounds.
As this example shows, this
detector splitting system allows
simultaneous quantitative trace
amount analysis by combining
El uso de detectores selectivos puede multiple GC selective detectors.
ayudar a identificar ciertas clases de
compuestos.
Dual channel detection: dos detectores en
paralelo a la salida de la columna de CG.
2
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis off-line
El eluido de la columna se colecta en una trampa fría (cold trap) y se
analiza en otro instrumento → EM, FTIR, RMN, UV, microanálisis.
Evitar condensación del gas carrier
Puede ser necesario repetir varias inyecciones para atrapar material
suficiente.
3
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis on-line = Hyphenated techniques GC-MS
GC es una excelente técnica de separación, pero no se puede confirmar la
identidad del pico sólo por tR.
EM es un excelente método cualitativo. Permite confirmar identidad por el
espectro de masa o por EMn.
4
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG - Términos estadísticos
Errores de medición → determinados, no al azar.
Encontrar y eliminar la fuente error.
→ indeterminados, al azar,
estadística Gaussiana.
Distribución Gaussiana de errores, caracterizada por:
• Tendencia central, medidas asociadas: promedio (Ẋ) y mediana
• Variación simétrica alrededor de la tendencia central
• Estadísticamente se determina el valor más probable de una medida. La
habilidad de un analista para determinar este valor más probable es su
exactitud.
• La dispersión de los datos alrededor del promedio se mide como la
desviación estándar:
σ
• Varianza: σ2
• Precisión: habilidad de un analista para obtener datos con σ pequeño. 5
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Términos estadísticos
• La habilidad de un analista para determinar este valor más probable es
su exactitud.
• La dispersión de los datos alrededor del promedio se mide como la
desviación estándar:
σ
• Precisión: habilidad de un analista para obtener datos con σ pequeño.
Exactitud: proximidad al
valor verdadero
Precisión: dispersión de los Buena certeza, mala
resultados precisión ⇒Mala exactitud
ISO 5725-1 Exactitud:
determinada por certeza
(proximidad al valor
verdadero) y precisión
(dispersión de los resultados) Mala certeza, buena
precisión ⇒Mala exactitud
6
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Términos estadísticos
• Repetibilidad: precisión en un laboratorio, por un analista y en un
instrumento.
• Reproducibilidad: precisión entre diferentes laboratorios (analistas e
instrumentos diferentes).
• Ruggedness: reproducibilidad de un instrumento. El mismo método de
prueba se usa en muchos laboratorios diferentes durante un período de
tiempo prolongado.
σ
• Desviación estándar relativa: 
 σ  
Ẋ
Calibración: factor limitante
para que el análisis de
trazas sea exacto.
Buena calibración y cuidado
en la precisión dan alta
exactitud y certeza.
7
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Errores
Todas las etapas del análisis son fuente de error:
Muestreo, preparación de muestra,
Separación = cromatografía, detección
Análisis de datos: integración y cálculos
Objetivo del muestreo: pequeña porción de muestra, representativa
del total. Evitar contaminación y pérdidas. Si se usa estándar interno,
agregarlo antes de empezar el procesamiento de la muestra.
Objetivos de la cromatografía: buena resolución de todos los picos,
picos simétricos, bajo nivel de ruido, tiempo de análisis corto, tamaño
de muestra en el rango lineal del detector, etc.
Análisis de datos: integración de áreas.
8
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos
Normalización de áreas

Area %X   100
∑ 
Para que sea exacto, se debe cumplir:
• Todos los analitos deben eluir
• Todos los analitos deben ser detectados
• Todos los analitos deben tener la misma sensibilidad
(respuesta/masa)
• Ejemplo: FAMEs
9
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos
Normalización de áreas con factores de respuesta
Si hay estándares disponibles, se calcula el factor de respuesta, f.
Una sustancia (puede ser un analito de la muestra) se elige como
estándar y se le atribuye arbitrariamente f = 1,00.
Se hacen mezclas (en peso) del estándar y los otros analitos, y se
cromatografía.
Se mide el área de dos picos, As (estándar) y Ax (analito) y se calcula
la respuesta de x, fx:
 
    
 
Hay tablas de factores de respuesta.
Para mayor exactitud, calcular sus propios factores.
Todos los analitos deben eluir y ser detectados. Se reproduce la
muestra.
10
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos
Normalización de áreas con
factores de respuesta
11
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Normalización de áreas con factores
de respuesta Resultado
Pesado
CG
 
    
 
#
  %"  ∑$ # %
100

12
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos - Estándar externo
Se cromatografían cantidades conocidas del analito de interés.
Se miden las áreas → curva de calibración
Concentración variable de analito y volumen de inyección constante.
Ventajas:
• Sólo se calibran los picos
de interés.
• La calibración de cada
analito es independiente.
Desventajas:
• Se debe tener un estándar
de cada analito.
• Se desprecian variaciones
instrumentales en el tiempo.
Se deben correr muestras
estandar para corregir esto.
• Difícil de hacer mediante
inyección manual.
13
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos - Estándar interno
Para técnicas poco reproducibles:
• No requiere volumen de inyección constante.
• No requiere conocer factores de respuesta.
Estándar:
• No debe estar presente en la muestra.
• No se debe superponer con ningún pico.
• Debe eluir cerca de los analitos.
• Debe ser químicamente similar a los analitos
• No debe reaccionar con los componentes de la muestra.
• Disponible en alta pureza (como cualquier estándar)
14
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Métodos - Estándar interno
• Se hacen 3 ó más mezclas de calibración con analito puro y se
agrega una cantidad conocida de estándar interno.
• Se miden las áreas de analito y de estándar interno. Gráfico.
• Se agrega una cantidad conocida del estándar a cada muestra,
en cantidad similar a la esperada para el analito. La concentración
de analito se obtiene del gráfico.
15
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Resumen de métodos
• En los 3 métodos se cromatografían estándares y muestras. Los
estándares se usan en cantidad conocida y se desconoce la
concentració de las muestras. Se determina el área de los picos
en todos los casos.
• Las diferencias entre los 3 métodos está en la segunda parte, en
la información necesaria para correlacionar el estándar con la
muestra.
1. Normalización interna: el total de los picos analizados, de
estándar y de muestra, alcanzan el 100%.
2. Estándar externo: cantidades exactamente conocidas de
estándar y desconocidas de muestra se inyectan en el
cromatógrafo.
3. Estándar interno: cantidad exactamente conocida de un material
diferente que se agrega a una cantidad conocida de estándar y
de muestra.
16
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – Estandar interno, dos significados
1. Desarrollo original: para compensar diferencias debidas a
inyección manual. Para esto, el estándar interno se agrega a la
muestra justo antes de la inyección (después de todos los
tratamientos). Requisitos: ausente en la muestra original, pico
bien resuelto con respecto a los de la muestra. No necesita ser
químicamente similar.
2. Aplicaciones bioquímicas y similares: el estándar interno se
agrega a la muestra inicial, antes de cualquier tratamiento. Debe
ser químicamente similar a los analitos, de modo que se vea
afectado por los pasos de tratamiento de manera similar. Corrige
dos aspectos:
a. Variación en el porcentaje de recuperación durante el work-
up.
b. Diferencias en el tamaño de inyección.
17
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – EM
Cualquier método de ionización de EM tiene diferentes eficiencias de
ionización, que varían según los compuestos. Es necesaria una
calibración cuidadosa de la respuesta del instrumento frente a la
concentración de la muestra.
1. Estándar externo: Repetición de las medidas para construir la
curva de calibración. Derivas en la sensibilidad del instrumento,
por ejemplo por contaminación de la fuente.
2. Estándar interno: No compensa las diferencias en eficiencia de
ionización entre analito y estándar. El estándar debe ser muy
similar al analito en términos de eficiencia de ionización y de tR.
Puede ser un isómero o un homólogo.
18
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Análisis cuantitativo CG – EM
1. Estándar externo.
2. Estándar interno: No compensa las diferencias en eficiencia de
ionización entre analito y estándar. El estándar debe ser muy
similar al analito en términos de eficiencia de ionización y de tR.
Puede ser un isómero o un homólogo.
3. Dilución isotópica. Analito marcado isotópicamente (2H, 13C, 15N,
18O)
CG → igual tR,
EM → valores desplazados de m/z
Al menos 3 átomos de deuterio – Sin superposición con abundancia
isotópica natural.
Elevado porcentaje de marcación.
Sustitución en posiciones definidas y estables.
19
Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Dilución isotópica. Confirmación de drogas de abuso en orina
CO2CH3 CO2H CO2CH2CF2CF3
H2O CF3CF2CH2OH
H3 C N O H3C N O H3C N O
(CF3CO)2O
O O O
Cocaína Benzoilecgonina (BEG) PFP-BEG
CO2CH2CF2CF3
H3 C N O
O
300
316
M+• 421
PFP-BEG
CO2CH2CF2CF3
2
H3 C N O
O
303
319 M+• 424
d3-PFP-BEG
Clin. Chem. 1990, 36, 742-747.
20
 Fundamentos y Aplicaciones de Cromatografía Gas-Líquido. DQO-FCEN-UBA 2013
Dilución isotópica. Confirmación de drogas de abuso en orina
CO2CH2CF2CF3
H3 C N O
O
300
316
M+• 421
PFP-BEG
CO2CH2CF2CF3
2
H3 C N O
O
303
319 M+• 424
d3-PFP-BEG
Confirmación cualitativa: aparecen los iones seleccionados,
relación adecuada de abundancias relativas
tR esperado
Cuantificación: comparación entre las corrientes iónicas de estandar interno
y de analito
21