Breve historia de la Cromatografía

• La cromatografía es una de las muchas técnicas

de separación.
• Otras técnicas disponibles son destilación,
filtración, extracción con solventes,
centrifugación, etc.
• El propósito principal de la cromatografía es
separar y cuantificar un compuesto en la matriz
de una muestra.

2
Breve historia
de la Cromatografía
 1940s - Martin y Synge trabajan en el
tratamiento teórico de la cromatografía que
hizo posible definir los métodos para
mejorar la eficiencia de la separación
cromatográfica. Esto permitió la aceptación
masiva de la cromatografía.
 1950s - Estos métodos se aplican a GC.
 1957 - Golay propone el uso de columnas
capilares en GC.
Breve historia de la
Cromatografía

 1960s - Nace la HPLC

 1975 - La Cromatografía Iónica es
propuesta por Small
 1979 - Sistema de No-supresores para
cromatografía Iónica desarrollado por
Gjerde.
Breve historia de la Cromatografía
 TLC - usada como una herramienta cualitativa
para separar mezclas simples donde se requiere
velocidad, bajo costo y simplicidad.
 HPTLC - para análisis cuantitativo con alta
variedad de composición.
 Equipos - Placas de varios tamaños cubiertas con
distintos materiales dependiendo de la aplicación.
 Accesorios opcionales para la detección.
Varios tipos de Cromatografía

 HPTLC está acoplada al uso de un

densitómetro
 El densitómetro usado convierte
mancha/banda en la capa en un
cromatograma con picos de apariencia
similar a los de HPLC
 La posición de los picos escaneados es
relativa a los valores Rf de las manchas y la
altura del pico o el área es relativa a la
concentración de la sustancia en la mancha
Varios tipos de Cromatografía
CROMATOGRAFIA

GASEOSA LIQUIDA

CGS CGL COLUMNA PLANA

CLS CLL CFQU CII CE CCF CP

CPG CFG

CGS: cromatografía gas-sólido / CGL: cromatografía gas-líquido / CLS: cromatografía

líquido-sólido / CLL: cromatografía líquido-líquido / CFQU: cromatografía de fase
químicamente unida / CII: cromatografía de intercambio iónico / CCF: cromatografía de
capa fina / CP: cromatografía en papel / CE: cromatografía de exclusión / CPG:
cromatografía de permeación en gel / CFG: cromatografía de filtración en gel

7
 Varios tipos de Cromatografía
Cromatografía en Columna
-- normalmente es una elución por gravedad.
-- proceso lento que requiere grandes cantidades
de solvente, esfuerzo y alteraciones en el relleno de
la columna

relleno

Lana vidrio/vidrio sinterizado

Varios tipos de Cromatografía
Cromatografía de Gases
- Usada para compuestos volátiles o
compuestos que pueden ser vaporizados
sin descomposición.
- La Fase Móvil es gaseosa (He, N2, H2)
Varios tipos de Cromatografía

Cromatografía Líquida de Alta Performance

- El interés principal del curso.
 Ventajas de la HPLC
en particular

• Velocidad de análisis.
• Alta resolución.
• Resultados cuantitativos.
• Excelente sensibilidad.
• Total automatización.
• Amplio espectro de aplicaciones.
11
 Limitaciones de la HPLC
en particular
• Alto costo de la instrumentación.
• Dificultad para el análisis cualitativo.
• No existe detector universal y además sensible.

• Elevado costo de operación.

12
Definiciones generales

• TIEMPO de RETENCION (tr):

Es el tiempo que la muestra permanece dentro de
la columna y se mide desde el momento en que la
muestra se introduce en el sistema hasta el
momento del punto máximo de la señal o pico.
(Se expresa en minutos)

13
Definiciones generales

• TIEMPO MUERTO (to):

Es el tiempo requerido para eluir una
muestra no retenida en la columna.
Se determina el tiempo de retención de la
fase móvil misma.

14
Definiciones generales
• TIEMPO DE RETENCION AJUSTADO (t’r):
Es la diferencia entre el tiempo de retención (tr) y
el tiempo muerto (to), es decir la medida del
tiempo que la muestra permanece retenida en el
material de relleno en la columna.

t’r= tr - to

15
Definiciones generales
• ANCHO DEL PICO (Wb):
Es la porción de la línea base interceptada pasando por el
punto de inflexión, por líneas tangenciales trazadas a
ambos lados de la señal cromatográfica.
Para picos Gausianos: Wb=4
 : dispersión gaussiana de los valores
Nota: Este valor (Wb) se emplea en el cálculo de la
resolución y eficiencia de los sistemas cromatográficos.

16
 COMO SE REALIZA LA
SEPARACIÓN EN CROMATOGRAFÍA

m =fase móvil
s =fase estacionaria

Representación de una separación cromatográfica

 EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS

 Los compuestos eluidos pasan a través del/los

detectores
t donde son registrados como picos
R1

y le dan la identidad como cromatograma.

Compuesto 1 Compuesto 2
Señal
tR2

tRo w1 w2
t’R1 t’R2

t0

Inyección Muestra
 EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS
1. Cualitativo -- El tiempo de retención es siempre
constante bajo condiciones
cromatográficas idénticas.
-- es usado para identificación.

2. Cuantitativo -- El área es proporcional a la cantidad

de muestra inyectada y es usada para
el cálculo de la concentración
 EL CROMATOGRAMA
Y SUS USOS
3. El cromatograma es usado para evaluar la
eficiencia en la separación y la performance de la
columna:

 Factor de Capacidad (k’)

 Selectividad (a)
 Número de platos teóricos (N)
 Altura equivalente de plato teórico (HETP)
 Resolución (Rs)
 EL NUMERO DE
PLATOS TEORICOS (N)
Rt Ecuación :
N = 16 x ( Rt / W )2

Area Ecuación modificada para

la medición real:
N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2
H
W1/2 Ecuación modificada para
H1/2 el integrador:
W N = 6.28 x (Rt x H / Area)2
EL NÚMERO DE
PLATOS TEORICOS (N).

 Las tres ecuaciones son correctas solamente si

la forma del pico es Gausiano.
 Para picos asimétricos:
(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

donde W0.1 = ancho pico al 10% altura

y T = factor de tailing
EL NUMERO DE
PLATOS TEORICOS (N).

 N: indica eficiencia de la columna.

N=3000
N=15000

Buena eficiencia columna Mala eficiencia columna

ALTURA EQUIVALENTE
DE PLATO TEÓRICO (HETP)
• Altura Equivalente de Plato Teórico (HETP)

L
H  HETP 
N
• L= longitud de la columna (expresada habitualmente en milímetros)
• Si el valor de HETP es pequeño, significa un mayor número de platos por
unidad de columna, por lo tanto, la columna es más eficiente.

24
 ALTURA EQUIVALENTE
DE PLATO TEÓRICO (HETP)

 HETP = Largo de columna / N

Ecuación de Van Deemter
AEPT

Caudal Optimo Cada columna tiene

un caudal óptimo

Velocidad Lineal
ALTURA EQUIVALENTE
DE PLATO TEÓRICO (HETP)

 Paraobtener buena eficiencia de

columna se recomienda

4.0 mmID 0.6 mL/min

4.6 mmID 0.8 mL/min
6.0 mmID 1.0 mL/min
ALTURA EQUIVALENTE DE
PLATO TEORICO (HETP)

• El objetivo principal de la cromatografía es separar los componentes

de una muestra dentro de un plazo razonable, ya sea en bandas o
picos a medida que ellos migran a través de una columna.

27
 RESOLUCION

Cuando los picos se solapan, la determinación del ancho

de la base no es fácil. Se usa una ecuación modificada
tomando el ancho del pico a media altura:

(w2)1/2 H1/2
(w1)1/2 H

v2-v1
Rs = 1.18
(w1)1/2 +(w2)1/2
 RESOLUCION

   1   k' 
1
R  4
  
  N 
 k'1

N : promedio de N1 y N2
k' : promedio de k'1 y k'2
 RESOLUCION

Es una función de:

Selectividad
Eficiencia de Columna
Factor de Capacidad
 RESOLUCION

Rs = 0.8 Rs = 1.0?? Rs = 1.25

Si la forma del pico es triangular, los dos picos se pueden separar a Rs = 1.
Pero el pico muestra poca distribución Gaussiana.
 RESOLUCION

Valor del área del pico

Rs 1:1 1:3 1:10 1:30 1:100

0.8 5.9% 5.0% (*)% (*)% (*)%

1.0 2.3 2.6 22.7 2.9 (*)
1.2 0.83 1.1 1.4 1.6 1.8
1.4 0.26 0.41 0.49 0.71 0.92
1.6 0.069 0.1 0.16 0.22 0.33
1.8 0.016 0.022 0.032 0.050 0.086
2.0 0.003 0.005 0.009 0.013 0.021
2.2 0.001 0.001 0.001 0.003 0.003
(*) a pico pequeño se marca con un *
 RESOLUCIÓN

Inicial

incrementarN
Disminuir el contenido de
solvente orgánico para
incrementar k* columnas de ODS.

Cambiar el contenido de
cambiar a
orgánico, pH, y temperatura
de la columna.
RELACION ENTRE VELOCIDAD, CAPACIDAD y
RESOLUCION.
• RESOLUCION

VELOCIDAD CAPACIDAD

34
RESOLUCION

35
CURVAS ESTANDAR
PARA VARIOS VALORES DE “R”

RANGO= 0,4-1,25 - RELACION DE TAMAÑO= 16:1

36
CURVAS ESTANDAR
PARA VARIOS VALORES DE “R”

RANGO= 0,4-1,25 - RELACIÓN DE TAMAÑO= 1: 1

37
 SELECTIVIDAD, (a)

La Selectividad es una
V0 indicación del grado de
V1 separación entre 2 picos.
V2

k' 2 V2  V0
Selectividad = 
k'1 V1  V0
 SELECTIVIDAD,
(a)

 Dos compuestos no pueden ser separados, si k’

es exactamente el mismo para ambos.
 La distribución de la diferencia es por la
selectividad, no hay separación posible si a =1.
 Afectado por la selección de la fase
estacionaria y la fase móvil.
CALCULO DEL VOLUMEN
MUERTO (Vm) DEL SISTEMA

• El Vm es aproximadamente el 50% del

volumen de la columna, se puede calcular
usando la siguiente fórmula:
Vm (/8 x103)x D x L

D = diámetro de la columna en mm
L = longitud de la columna en mm

40
MEJORAS EN LA SELECTIVIDAD
DE LA COLUMNA
• Las principales mejoras se consiguen cambiando el coeficiente
de distribución (K) y/o el volumen de la fase estacionaria (Vs).
Cambiando la Fase Móvil: por ej. incrementando la polaridad,
pH y/o la fuerza Iónica. Esto se usa en elución por gradiente.
Cambiando la Fase Estacionaria: cambiando el tamaño de los
poros de los geles, modificando la superficie de los
adsorbentes.
Cambiando la temperatura: ocasionalmente puede mejorarse
la selectividad, pero el control de la temperatura es importante
para mejorar la reproducibilidad de la separación.

41
 MEJORAS EN LA SELECTIVIDAD
DE LA COLUMNA
Cambiando la naturaleza del soluto: por ej. eliminando la carga de un aminoácido
cambiando el pH de la Fase Móvil para reducir la afinidad por las resinas de
intercambio iónico o por la formación de un par iónico.

• Generalmente los cambios en el caudal o la presión de la columna no causan efecto

sobre la selectividad.

42
COEFICIENTE DE DISTRIBUCIÓN
(K)

 fase estacionaria
K
 fase móvil

• Es el cociente entre las concentraciones del soluto en la

fase estacionaria y en la móvil.
• Según el tipo de cromatografía, se lo conoce también como
“coeficiente de partición”,“coeficiente de permeación”, “coeficiente
de adsorción”.
43
FACTOR de CAPACIDAD (k’)

Vr - V0
Vr k'=
V0
V0 Vr = volumen de retención pico de soluto
V0 = volumen muerto de columna
pico de solvente (pico no retenido)

Tiempos de Retención
se usan en lugar de Volumen.
FACTOR de CAPACIDAD (k’)

 El tiempo de retención es dependiente del caudal

y dimensiones de la columna, esto no es
adecuado para comparación entre cromatogramas

El factor de capacidad es independiente de estos

factores y también es el preferido.

 Los valores de k’ entre 1 y 5 son los preferidos

FACTOR de CAPACIDAD (k’)

6.0 mmID x 150 mmL. (1 mL/min)

6 min (t1) k' = 2

2 min (t0)

6.0 mmID x 300 mmL. (1 mL/min)

12 min (t1) k' = 2

4 min (t0)
FACTOR de CAPACIDAD (k’)

6.0 mmID x 150 mmL. (1.0 mL/min)

10 min (t1)
k' = 4
2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1) k' = 2

4 min (t0)
EFECTO DE LA CONCENTRACION
DE METANOL SOBRE LA RESOLUCION

48
FACTOR de CAPACIDAD (k’)

4.6 mmID x 250 mmL. (1.2 mL/min)

6 min (t1) k' = 2

2 min (t0)

4.6 mmID x 250 mmL. (0.6 mL/min)

12 min (t1) k' = 2

4 min (t0)
 RESOLUCION

 Mejoras en la resolución pueden lograrse

ajustando el caudal a un nivel óptimo;

 O ajustando la temperatura pero incrementar la

temperatura acorta la vida útil de la columna.
 GANAR RESOLUCION:
EFICIENCIA, SELECTIVIDAD
Y FACTOR DE CAPACIDAD

• Relacionando las ecuaciones de R, N, Wt2 y Vr se obtiene una

ecuación que relaciona estos parámetros:

R  n     1   k' 
 4     
a: es un término de EFICIENCIA de la columna.       k '1 
b: es un termino de la SELECTIVIDAD de la columna. a b c
c: es el factor de CAPACIDAD de la columna.
• Las separaciones pueden mejorarse ajustando cualquiera de los 3 términos.

51
 MODOS DE HPLC

Modo Fase Normal

Modo Fase Reversa
Modo Fase Reversa Par Iónico
Modo Intercambio Iónico
Modo SEC ( GPC / GFC )
Modo Separación Quiral
RELLENOS
PARA COLUMNAS

53
MODO FASE NORMAL

Eter Petróleo
Cromatograma

Clorofila Color

CaCO3

Primer desarrollo
por M.S. Tswett.
 MODO FASE NORMAL

Primer uso
CaCO como columna de separación
3
Eter de Petróleo como Solvente.
Definimos esta combinación como
Modo Fase Normal
Columna : característica polar
Solvente : característica no polar
COLUMNAS DE HPLC
PARA FASE NORMAL.

 Tipo Silica gel : uso general

 Tipo Ciano : uso general
 Tipo Amino : análisis de azúcares

 Tipo Diol : análisis proteínas

-Si-CH2CH2CH2 CN
-Si-CH2CH2CH2 NH2
Si -Si-CH2CH2CH2OCH (OH) -CH2(OH)
Si
Silica gel Si modificada
QUE ES LA INTERACCIÓN?

Unión Hidrogeno
No-polar

Silica gel (polar)

MECANISMO DE
LAFASE REVERSA
• Involucra una interacción entre un hidrocarburo
saturado, químicamente unido a una partícula de sílica,
y la porción no polar de la molécula de soluto.
• El compuesto “fuerte” de la fase móvil es el compuesto
orgánico. El compuesto “débil” en este caso es el AGUA.
• Al incrementar el componente “fuerte”, se reducen los
valores de k’.
• Como el compuesto a determinar es menos polar que la
fase móvil, una porción de ésta (agua), empuja al
compuesto hacia la fase menos polar (metanol).

58
 MECANISMO DE
LA FASE REVERSA.
• Por este medio el compuesto es retenido en la superficie de la fase estacionaria. Para los compuestos con un caracter
menos polar, se deben esperar obtener altos valores de k’

• Los materiales polares eluyen a bajos k’.

59
COLUMNAS DE HPLC
PARA FASE REVERSA

 Tipo C18 (ODS)

 Tipo C8 (octil) Carácter No-polar
 Tipo C4 (butil) -Si-C18H35
 Tipo Fenil
 Tipo TMS Si
 Tipo Ciano
RELLENOS OCTADECILO,
POLIMERICOS vs MONOMERICOS

1) Los rellenos octadecilo poliméricos son más usados para

compuestos NO POLARES, tales como alquenos y aromáticos
polinucleares.

2) Los rellenos octadecilo monoméricos están hechos para

propósitos generales, son utilizados para compuestos
POLARES y NO POLARES.

61
 QUE ES LA INTERACCIÓN?

Interacción
Hidrofóbica Solvente polar

No-polar
 HIDROFOBICIDAD

 Si la muestra tiene
 CH3CH2CH2--- : Cadena Carbonada Hidrofobicidad es
 : Grupo Aromático
FUERTE.

 Si la muestra tiene
 -COOH : Grupo Carboxilo
 -NH2 : Grupo Amino Hidrofobicidad es
 -OH : Grupo Hidroxilo DEBIL.
TIEMPO DE RETENCION
e HIDROFOBICIDAD
OH

C18 (ODS)
Débil

Fuerte
OH
EFECTO DE LA
FASE ESTACIONARIA

C8

C18 (ODS) Medio

muestra
Fuerte C4
muestra
Débil

muestra
 FASE NORMAL vs.
FASE REVERSA

 Fase Normal
buena separación para estereoisómero
(Vitamina E, etc...)
tiempo de retención cambiante
 Fase Reversa
 buena repetibilidad del tiempo de retención.
 fase estacionaria resistente.
 PARTES DE UN
SISTEMADE HPLC

detector

columna
inyector horno
bomba

Reservorio
Solvente
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
1. RESERVORIO PARA SOLVENTES
Contenedor para solvente.
Filtro succión para enviar solvente a la
bomba.
El material del filtro de succión es de acero,
inoxidable, cerámica o Teflon.
Se usa una línea extra para desgasificar si se
usa un desgasificador on-line.
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
A. BOMBA JERINGA
Relleno del
solvente Este volumen es
aprox. 1 L.
Motor engranaje

Solvente
Sello
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
B. BOMBA DE PISTON RECIPROCANTE
Cabeza de la
Motor y bomba
leva
Check
valve
Pistón
Sello pistón 10-100uL
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

C. BOMA A DIAFRAGMA
Reserva aceite
SALIDA
Pistón diafragma

Sello
aceite

Aceite ENTRADA
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

 Sistema dual de cabeza micro pistón

check valve Volumen de pistonado
: 10 uL
Volumen Check valve

: 2 uL
Fluctuación de presión
cabeza de pistón
es causada por la baja
respuesta de la check
valve.
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
LC-10AT / LC-10Ai
 Pistón dual con línea de flujo
en tandem El sub pistón trabaja
como mejorador de la
respuesta de la
compensación y de la
pérdida de carga

Sub pistón (25uL)

Pistón principal (50uL)
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
 Tipo pistón simple
LC-10AS
check valve
CDQR
provee la pequeña
fluctuación de presión.

Cabeza pistón
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
VALVULA DE INYECCIÓN
Posición carga Posición inyectar
bomba columna bomba columna

Loop muestra
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

 Bomba completamente libre de pulsos

 Detector Indice Refracción
 Detector Conductividad
 Detector Electroquímico
 Sistema de Micro pistón
 Valor de caudal para el análisis semi micro.
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
LC-10AT / LC-10Ai
 Pistón dual con línea de flujo
en tandem El sub pistón trabaja
como mejorador de la
respuesta de la
compensación y de la
pérdida de carga

Sub pistón (25uL)

Pistón principal (50uL)
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

 Baja fluctuación de presión

Nuevo diseño de check valves
Sistema de Sub pistón
 Alta durabilidad y larga vida del sello
Razonable velocidad del pistón
 Escasos problemas de burbujas
Línea de flujo en tandem
 Mejoras en la exactitud del gradiente a
baja presión
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

Tipo pistón
checksimple
valve
CDQR
provee la pequeña
fluctuación de presión.

Cabeza pistón
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

 Baja fluctuación de la presión

 Fácil mantenimiento
 un pistón
 un sello de pistón
 cada uno su check valve
 Bajo precio
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS SHIMADZU

 Flujo constante/presión de bombeo constante

 Dos bombas en el modo “stand alone” capaz de
correr un programa de gradiente.
 Monitoreo del número de revoluciones de la bomba.
 Indicación cuando el sello necesita el cambio.
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
VALVULA DE INYECCIÓN

Posición carga Posición inyectar

bomba columna bomba columna

Loop muestra
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
Peak Area (x 10 5 uVS)
Peak 1 Peak 2 Peak 3
1 1.547 1.588 2.980
2 1.544 1.587 2.978
3 1.544 1.570 2.966
4 1.548 1.590 2.983
5 1.549 1.590 2.988
6 1.550 1.592 2.989
7 1.544 1.585 2.973
8 1.546 1.589 2.820
9 1.550 1.591 2.988
10 1.548 1.590 2.985
CV 0.16 0.13 0.25
PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

Inyector Manual Rheodyne

 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
HORNO PARA COLUMNAS

 Envoltura Aislada
 Baño Agua
 Envoltura cuerpo columna
 Bloque de Aluminio
 Horno columnas (calor / frío)
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
HORNO PARA COLUMNAS

 Envoltura Aislada
 Baño Agua
 Envoltura cuerpo columna
 Bloque de Aluminio
 Horno columnas (calor / frío)
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC

HORNO PARA COLUMNAS CTO-10A / 10AC

Prestaciones Básicas:
Rango de Temperatura : 4 a 80oC
• Control exactitud temperatura: 0.1oC
• Protección de temperatura máxima.
• Sensor de pérdidas, corta automáticamente, enfría
el horno cuando se detectan vapores orgánicos.
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
TIPOS DE DETECTORES PARA HPLC
 Detector Ultravioleta / Visible (UV/VIS)
 Detector por Arreglo de Fotodiodos (PDA)
 Detector de Fluorescencia (RF)
 Detector de Conductividad (CDD)
 Detector de Indice de Refracción (RID)
 Detector Electroquímico (ECD)
 Detector de Especrómetro de Masas
 Detector Evaporativo de Masas
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
DETECTOR UV
C : concentración
Celda
Ein Eout

l Ley Lambert-Beer
A= e C l = - log (Eout / Ein)
(A : absorbancia)
 PARTES DE UN
SISTEMA DE HPLC
Celda Muestra
Red
l Ein Eout Fotodiodo

Ein Ein Fotodiodo

Celda Referencia
Lámpara D2 / W
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

A= e C l = - log (Eout / Ein)

Absorbancia
1 Rango lineal

Concentración
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

DETECTORES UV SHIMADZU
Cuatro tipos disponibles:
SPD-10Ai, SPD-10A : sólo lampara deuterio,
cubre de 190-600 nm.
SPD-10AVi, SPD-10AV : lamparas deuterio y
tungsteno. Cubre de
190 to 900 nm.

Volumen de Celda: 8 ml (16 ml) , Largo : 10 mm

Tolerancia presión celda: 30 kgf/cm2 , (20 kgf/cm2)
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Otras características básicas SPD-10A / SPD-10AV

 Modo Longitud de Onda dual

 Modo Gráfico
 Modo programa de tiempo Long. de Onda.
 Modo Barrido Longitud de Onda
 Monitores de tiempo de vida de lámpara
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Modo programa de tiempo Long. de
Onda
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Modo Barrido Longitud de Onda
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Detector por Arreglo de Fotodiodos

Celda muestra Red

Cada elemento detecta
pequeño rango de
lampara D2 / W longitud de onda.

512 Elementos Arreglo Fotodiodo

 CHEMISTRY

S h u tte r
E lu a t e t o w a s t e
Len s
s y s te m

P h o t o d io d e a r r a y
D e u t e r iu m la m p

F lo w c e ll

E lu a t e in
U lt r a v io le t lig h t

H o lo g r a p h ic g r a t in g

E lu a te
in E lu a te o u t

D e te c to r

In the diode array detector light from the deuterium lamp is focused onto the flow
cell. Having passed through the cell the light is dispersed into single wavelengths
and these are focused onto a row of photosensitive diodes etched onto the surface
of a silicon chip. This allows all wavelengths across the desired range to be
monitored simultaneously. Such an arrangement does not have the same sensitivity
as more conventional (variable wavelength) ultraviolet spectrometers. This is
because the diode array detector does not measure single wavelengths at a time. A
reference measurement is taken at the beginning of the run, and is stored by the
computer.
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector Arreglo de Fotodiodos: Especificaciones

Fuente de Luz: Deuterio y tungsteno

Rango longitud de Onda: 190 - 800 nm.
Capacidad de Celda: 10 ml, Paso celda: 10 mm
Presión máxima de celda: 50 kgf/cm2
Reemplazo lámpara y celda por el frente del panel
Monitoreo tiempo real y cuantificación hasta
8 longitudes de onda.
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector Arreglo Fotodiodos: 3D cromatograma

Absorbancia Espectro
Cromatograma

a
nd
d eO
ud
it
ng
Tiempo
Lo
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector arreglo Fotodiodos

 El pico se identifica usando el espectro UV.
 El chequeo de la pureza de pico se hace:
-- 3 espectros superpuestos
-- relación de cromatogramas
-- comparación del fondo y del índice
de similitud.
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector de Fluorescencia

Longitud de Onda de Excitación

+ hn1 *
* hn2+
A* Longitud de onda de Emisión
hn1 hn2
Fluorescencia
A A
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Diseño celda detector Fluorescencia
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Detector Indice Refracción

Sistema Optico
PARTES DE UN SISTEMA HPLC
Cromatograma de azúcares
 Analytical Conditions
 Column : Shim-pack
CLC-NH2
 Mobile phase :
Acetonitrile / water
=7/3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : Ambient
 Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector Conductividad
K (conductividad) = I [A] / E [V]
V =A [cm2] / L [cm] * k
I (k : conductividad especifica)

k= (I/E)*(L/A)
A A

L electrodo
PARTES DE UN SISTEMA HPLC

Detector Conductividad
 La conductividad esta muy afectada por la
temperatura.
 Se debe mantener la temperatura de la celda muy
controlada.
Mantenimiento de un Sistema de HPLC

SISTEMAS DE INYECCION
INYECCIÓN MANUAL

Posición carga Posición inyectar

bomba columna bomba columna

Loop muestra
108
Mantenimiento de un Sistema de HPLC

Inyector manual Rheodyne 7725

109
Mantenimiento de un Sistema de HPLC

Detector
UV/VIS

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