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LABORATORIO DE BIOCONVERSIONES

CURVAS DE CALIBRACIN PARA PROTENAS Y AZCARES

REDUCTORES.

INTRODUCCIN

La luz puede estudiarse como una radiacin (ondas) cuya frecuencia () y longitud
de onda () estn relacionadas por la importante expresin . = C, donde C es
la velocidad de la luz. Adems, la luz puede considerarse constituida por fotones
cuya energa (E) est dada por E=h = hc/ donde h es la constante de Planck.
La absorcin de la luz puede medirse en trminos de absrorbancia (A) o de
Transmitancia (T), que se definen como A= log(P0/P) y T= P/P0 donde P0 es la
potencia radiante de la luz que incide en una muestra y P es la potencia que
emerge del otro lado.

La principal aplicacin analtica de la espectrofotometra de absorcin deriva del


hecho de que la absorbancia es proporcional a la concentracin de la especie
absorbente en una solucin diluida (Ley de Beer): A= b c En esta ecuacin b es
el espesor de la celda, c es la concentracin, y la constante de proporcionalidad es
la absortividad molar, . Cuando una muestra no obedece la ley de Beer, ello se
debe generalmente a que una reaccin qumica modifica la concentracin del
cromforo cuando la concentracin de la misma cambia

Para que un compuesto pueda ser analizado por espectrofotometra, debe


absorber luz, y esta absorcin debe ser distinguible de otras absorciones de
especies presentes en la muestra. En vista de que la mayora de los compuestos
absorben la radiacin ultravioleta, estos resultados pueden no ser concluyentes, y
el anlisis puede restringirse al espectro visible. Sin embargo, cuando no hay
especies que interfieran, la absorbancia ultravioleta puede utilizarse sin duda


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alguna. Las soluciones de protenas normalmente se analizan en la regin del
ultravioleta a 280 nm, debido a que los grupos aromticos de los aminocidos
presentes en casi todas las protenas tienen un mximo de absorbancia a 280 nm.
(Harris J. Chem. Ed.).

Es importante sealar que los mtodos analticos estandarizados son establecido


por instituciones nacionales o internacionales que proporcionan procedimientos y
caractersticas del mtodo y que concluyen con indicadores de calidad
denominados caractersticas del desempeo analtico, que suelen incluir:
exactitud, precisin, especificidad, adems de los parmetros que se determinan a
partir de los curvas de calibracin Independientemente de la tcnica instrumental
responsable de la seal analtica , los parmetros que se determinan a partir de
las curvas de calibracin obtenidas con cualquiera de ellas son:

Linealidad
Sensibilidad
Lmite de deteccin
Lmite de cuantificacin
Intervalo analtico.

Linealidad del sistema de medicin

La linealidad de la curva de calibracin, es un requerimiento fundamental en la


prctica del anlisis qumico cuando se realizan curvas de calibracin. En general
la linealidad no se cuantifica pero se observa por simple inspeccin o mediante
pruebas significativas de no linealidad. La no linealidad se elimina mediante la
seleccin de un intervalo de operacin ms restringido. Cabe mencionar que el
intervalo lineal puede ser distinto para matrices diferentes de acuerdo al efecto de
las interferencias procedentes de la matriz. Para demostrar la linealidad se


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requieren cumplir ciertos criterios de aceptacin en la que estadsticamente se
puede justificar esa linealidad; para ello es necesario calcular:

La pendiente (m)
La ordenada al origen (b)
El coeficiente de determinacin (r2)

Como criterio de aceptacin de la linealidad a partir de la curva de calibracin


(conjunto de concentraciones que describen el intervalo en el cual se deber
cuantificar el compuesto por analizar) se considera r2 >0.98

Sensibilidad.

La sensibilidad de mtodo mide su capacidad para discriminar entre pequeas


diferencias en la concentracin del analito. Dos factores limitan la sensibilidad. la
pendiente de la curva de calibracin y la precisin del sistema de medida. Para
dos mtodos que tengan igual precisin, el que tenga la mayor pendiente ser el
ms sensible; es importante sealar que para determinar la pendiente de la curva
se considera nicamente el intervalo lineal de la misma puesto que cuando la
curva pierde su linealidad la pendiente tambin es diferente. Por otra parte, es
importante mencionar que, al igual que la linealidad, tambin la pendiente de la
curva puede ser distinta para matrices diferentes; esto significa que la pendiente
de la curva depende de todas las condiciones de medida y que stas deben ser
iguales (o al menos similares) para los estndares y la muestra problema.

Lmite de deteccin (LD).

En general este trmino se define como la mnima concentracin del analito


detectable por el mtodo. Su determinacin es importante (particularmente en
anlisis de trazas) pero los problemas asociados con ella son diversos; estos

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problemas han sido estadsticamente estudiados y varios criterios de decisin han
sido propuestos. Aunque ninguno es universal uno de los ms aceptables es el de
la concentracin que correspondera a la medida del promedio del blanco+ 3s. El
blanco es la seal emitida por el instrumento con una disolucin que contiene las
mismas especies que la muestra problema (pero sin el analito). Para fines de
validacin se considera que deben hacerse 10 mediciones de blancos
independientes El valor de 3s se refiere a tres veces la desviacin estndar al
realizar la medicin de estos blancos.

Lmite de cuantificacin (LC).

Llamado tambin lmite de determinacin, se define como la ms pequea


concentracin del analito que puede ser determinada con un nivel de exactitud y
precisin aceptables. Dependiendo del convenio utilizado se considera como la
concentracin de analito que corresponde al valor del promedio del blanco mas 5,
6 o 10 veces la desviacin estndar del mismo (esta ltima es la ms comn). Es
importante hacer notar que ni LD ni el LC representan niveles a los cuales sea
imposible la cuantificacin del analito; el significado es que el LC representa la
mnima concentracin del analito que puede ser determinada con un aceptable
nivel de incertidumbre.

Intervalo analtico.

Est definido como el intervalo de concentracin en que el analito puede ser


determinado mediante la utilizacin de la curva de calibracin; se considera que es
el comprendido entre el lmite de cuantificacin hasta la concentracin en la cual
se pierde la linealidad de la curva


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Un procedimiento analtico muy utilizado en anlisis cuantitativo es el llamado de


calibracin que implica la construccin de una curva de calibracin. Una curva de
calibracin es la representacin grfica de una seal que se mide en funcin de la
concentracin de un analito. La calibracin incluye la seleccin de un modelo para
estimar los parmetros que permitan determinar la linealidad de esa curva. y, en
consecuencia, la capacidad de un mtodo analtico para obtener resultados que
sean directamente proporcionales a la concentracin de un compuesto en una
muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se
compara una propiedad del analito con la de estndares de concentracin
conocida del mismo analito (o de algn otro con propiedades muy similares a
ste). Para realizar la comparacin se requiere utilizar mtodos y equipos
apropiados para la resolucin del problema de acuerdo al analito que se desee
determinar. (Alcntara Pineda. Gua de validacin de mtodos analticos).

Existen dos facetas de calibracin en el anlisis cuantitativo, la calibracin


instrumental y la calibracin metodolgica. La calibracin instrumental se realiza
con estndares que no contienen el analito y se utiliza para asegurar el
funcionamiento del instrumento empleado. La calibracin metodolgica se
realiza con estndares que contienen el analito para establecer una relacin entre
las caractersticas fisicoqumicas del analito y las seales del instrumento. En un
proceso analtico se relaciona la seal y caractersticas del analito, de modo que
la calibracin se realiza al obtener la seal de respuesta como funcin de la
concentracin conocida del analito. Se representan los datos obtenidos y se
obtiene la grfica de la seal corregida frente a la concentracin del analito. Lo
normal es que la grfica tienda a una lnea recta, donde a medida que aumenta la
concentracin (Fig.1), la seal de respuesta es mayor (pendiente positiva). En el


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modelo de curva de calibracin lineal, la pendiente vendr dada por la ecuacin
matemtica:

y = mx + b

Siendo m la pendiente, x la concentracin e y la seal de respuesta. La


sensibilidad de calibracin es la pendiente de la curva de calibrado. Por tanto en
una curva de calibrado lineal la sensibilidad es siempre la misma y no va a
depender de la concentracin, ya que para que se cumpla y = mx + b, las
concentraciones deben tener una incertidumbre insignificante.

Exactitud

Es el grado de concordancia entre el resultado de una determinacin o la


media de n resultados y el valor verdadero del analito en la muestra en
cuestin. Toda medida tiene un fallo, por lo que el valor verdadero no lo
conocemos, pero nos podemos aproximar a l utilizando los siguientes materiales:

Material de referencia: material o sustancia, en el cual una o ms de


sus propiedades estn suficientemente bien establecidas para que sea
usado en la calibracin, la estimacin de un mtodo de medicin o para
asignar valores a los materiales.
Material de referencia certificado (MRC): material en el que los
valores de una o ms de sus propiedades estn certificados por un
procedimiento tcnicamente validado.


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Determinacin de protenas y azcares reductores

Existen diversos mtodos que permiten cuantificar la concentracin de


protena presente en las muestras biolgicas, basados en las propiedades que
muestran las protenas en solucin.
Los mtodos ms usuales son:
Reaccin de Biuret.
Mtodo de Lowry.
Mtodo de Bradford.
Mtodo del cido Bicinconnico (BCA).
Absorcin en el ultravioleta.
Mtodos inmunolgicos.

Siendo uno de los ms utilizados el mtodo Bradforf por ser un mtodo


rpido, reproducible y sensible.


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Para la determinacin de azcares segn el mtodo Miller, los azcares
reductores pueden reducir al cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) bajo determinadas
condiciones. Cuando el cido 3,5-dinitrosa- liclico es reducido en presencia de
calor, por los azcares reductores que entran en contacto con l, se desarrolla un
cambio de color parecido al caf (con variaciones de amarillo hasta caf). El
cambio de coloracin puede entonces determinarse por lecturas de densidad
ptica, ledas por espectrofotometra a una determinada longitud de onda. La
concentracin de los azcares reductores totales liberados en la muestra se
determina haciendo una interpolacin en la curva patrn del azcar utilizado,
graficando la absorbancia en funcin de la concentracin.

OBJETIVO GENERAL

El alumno desarrollar una tcnica espectrofotomtrica, con el fin de obtener un


modelo matemtico que relacione la concentracin del analto (Variable de control)
con la absorbancia (Variable de respuesta), a efecto de poder analizar y dar
seguimiento al bioproceso de obtencin de enzimas.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Obtener una curva de calibracin para azcares reductores


Obtener una curva de calibracin para protena por el mtodo
Bradford

MATERIALES Y EQUIPO

Micropipetas de 1000, 200 y 20 L


Puntas para micropipeta azules y amarillas
Tubos eppendorf
Gradillas para eppendorf


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Vasos de pp de 1 litro
Vasos de pp de 250 mL
Reactivo DNS
Reactivo Bradford
Parrilla de calentamiento
Espectrofotmetro con celdas
Vortex

DESARROLLO EXPERIMENTAL Y TERICA.


Antes de comenzar con el desarrollo experimental es importante tomar en
cuenta las siguientes recomendaciones:
La micropipeta debe de mantenerse siempre en posicin vertical durante todo el
proceso de pipeteo, nunca inclinada. Todas las micropipetas tienen dos topes:
1) Primer tope para tomar el volumen calibrado.
2) Segundo tope para expulsar de forma ms eficiente el volumen tomado yse usa
solo cuando se est expulsando el contenido. .
Procedimientos para medir correctamente un volumen con una
micropipeta
1. Seleccionar la micropipeta adecuada para medir el volumen deseado (que est
dentro del intervalo establecido para la micropipeta).
2. El volumen requerido se fija girando el mbolo. Se debe girar suavemente
(evitar estar cambiando constantemente los volmenes, para evitar descalibrar las
micropipetas).
3. Colocar una punta desechable en el vstago de la micropipeta; asegurando que
est bien sujeta, ejerciendo un ligero movimiento de torsin y presionando. Tener


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cuidado de no presionar mucho porque esto hace que la punta quede atorada
fuertemente dificultando retirarla.
4. Tomar la muestra presionando suavemente el mbolo con el pulgar hasta el
primer tope.
5. Introducir la punta de la micropipeta en la muestra no ms de 3 mm de la
superficie de lquido, manteniendo la micropipeta en posicin vertical.
6. Succionar el lquido, relajando suavemente y controlando la presin con el dedo
pulgar, sin permitir que el mbolo suba por s solo. Se espera un par de segundos
con la punta introducida en el lquido.
7. Retirar la punta de la muestra.
8. Introducir la punta de la micropipeta en el tubo o frasco donde se va a verter,
colocando la punta contra la pared del tubo, sin sumergirla en la solucin.
9. Presionar el mbolo lentamente, llevndolo hasta el primer tope, continuando
inmediatamente hasta el segundo tope, para expulsar la totalidad del lquido que
est en la punta.
10. Con el mbolo totalmente presionado se retira cuidadosamente la micropipeta,
deslizando la punta a lo largo de la pared del tubo.
11. Llevar el mbolo a la posicin inicial, controlando con el dedo (sin permitir que
el mbolo suba por s solo).
12. Sacar la punta de la micropipeta, presionando el expulsor de puntas o tirando
de ella. En algunos casos se puede usar la misma punta, para homogenizar la
mezcla, una vez adicionado el volumen, se introduce la punta en la mezcla y se
baja y sube el embolo repetidamente sin llegar al primer tope.

Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de bioconversiones y


obtencin de las curvas de calibracin.

Preparacin de reactivos

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a) Reactivo de Bradford

Disolver 10 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 5 mL de etanol al


95%. A esta solucin se le aaden 10 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La
solucin resultante se diluye a un volumen final de 100 mL. Las concentraciones
finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G- 250, 4.7%
(w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico.

Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si
tiene un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar
nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario, conservar en frasco mbar
bajo refrigeracin hasta su uso.

b) Reactivo del cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS)

1. Preparar una solucin de 100 mL que contenga 2 g de NaOH disuelto.


2. Agregar 2g de cido 3,5-Dinitrosaliclico con agitacin constante
3. Agregar 40g de Tartrato sdico-potasio tetrahidratado.
4. Agregar 0.4 g de fenol.
5. Agregar 0.1g de Sulfito de sodio.
6. Aforar a 200 mL con agua destilada.
7. Guardar en obscuridad y en frasco mbar. Dejar reposar 15 min, en caso de
uso inmediato. ES IMPORTANTE tener cuidado con los volmenes que se
manejan, por que el volumen final no debe ser mayor a 200 mL.

OBTENCIN DE LAS CURVAS DE CALIBRACIN.

a) Azcares Reductores

1. Para la obtencin de la curva de calibracin de azcares reductores se


utilizar como estndar la Glucosa para ello se realiza la curva patrn de

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Glucosa (o el azcar reductor ms adecuado en funcin de lo que se vaya a
determinar) en un rango de concentracin de 0 a 1.0 g/L.
2. Las diluciones se prepararn, por duplicado, de acuerdo a la Tabla 1.
3. Una vez que se preparan las diluciones se debe realizar el procedimiento
para azcares reductores.

*Con el blanco se ajusta a cero de absorbancia el espectrofotmetro.


CUANTIFICACIN DE AZCARES REDUCTORES TOTALES POR EL
MTODO DE DNS
4. Agregar 100 L de la solucin problema (solucin de glucosa a 1 mg/mL o
de sacarosa a 6 mg/mL ya digerida, tabla 1) .
5. Agregar 300 L del reactivo de DNS preparado.
6. Ebullir 5 minutos y dejar enfriar (10 minutos aproximadamente).
7. Agregar 600 L de agua destilada.
8. Agitar en vrtex a temperatura ambiente.
9. Leer la absorbancia registrada en el espectro de UV-Visible a 540 nm
(cuidar que no pase ms de 30 min para su lectura).


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10. Elaborar la curva patrn en donde se grafique en el eje de las ordenas
(ejey) promedio de la absorbancia determinada a 540 nm y en el eje de
las abscisas (ejex) el promedio de la concentracin de Glucosa
determinada en g/L.
11. Determina la ecuacin de la lnea recta que relaciona a los dos parmetros:

y = mx + b

En donde y representa la absorbancia determinada a 540 nm. x representa la


concentracin de maltosa determinada en g/L.

La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una R2 mayor o igual


a

0.98, con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.

DIGESTIN CIDA PARA LLEVAR A CABO LA CUANTIFICACIN DE


AZCARES NO REDUSCTORES

1. Tomar 200 L de la muestra correspondiente a cada tubo.


2. Agregar 200 L de HCl (Preparado con dilucin 1:2).
3. Agitar en vrtex para homogenizar
4. Ebullir 10 minutos y enfriar en hielo.
5. Agregar 200 L de NaOH (Preparado al 25%).
6. Agregar 60 L de HCl (Preparado al 5%).
7. Seguir con la metodologa de cuantificacin de azcares reductores.

b) Determinacin de Protena.


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1. La determinacin de protena de una solucin enzimtica con el mtodo de
Bradford, se determina por medio de una curva tipo con albmina de huevo (AH) y
el reactivo de Bradford.

2. Curva tipo: preparar diferentes concentraciones de AH de 0 a 200 g/mL, a


partir de una solucin de 200 g/mL, (Tabla 2).

3. Agregar en un tubo eppendorf limpio la cantidad de solucin de AH y agua que


se indica para obtener un volumen final de 0.25 mL de muestra.

4. Posteriormente adicionar 0.75 mL de reactivo de Bradford, y dejar en reposo


EXACTAMENTE 5 minutos, inmediatamente despus leer la absorbancia a 595
nm, ajustando el equipo con el blanco de reactivos o agua (el que no contiene
protena).

INFORME

1. Generar las grficas correspondientes para las curvas de calibracin de

azcares reductores por el mtodo DNS.

2. Generar las grficas correspondientes para las curvas de calibracin de


protenas por el mtodo de Bradford.


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3. Discutir los resultados obtenidos.

REFERENCIAS

Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72:248-254.
Miller G., 1959. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of
Reducing Sugar. Anal.


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