Comercializadora de Lcteos y

Derivados S.A. de C.V.

PROCEDIMIENTO
Ttulo:
Fosfatasa residual Mtodo oficial de Sanders y
Sager A.O.A.C

Pgina:
1 de 3

No. de Rev.
Primera

Fecha de revisin:
Mayo 2008

Departamento:
Aseguramiento de Calidad
Clave:
TZ-ACC-029-FQ
Fecha de elaboracin:
Enero 2005

1. FUNDAMENTO.En la leche se encuentran presentes muchas enzimas, entre ellas se encuentra la fosfatasa
alcalina, cuyo papel es acelerar la descomposicin de los esteres del cido fosfrico liberando
fosfatos.
Esta prueba se basa en el hecho de que la enzima fosfatasa se destruye cuando la
pasteurizacin es correcta, adicionalmente los microorganismos patgenos son eliminados con
mayor rapidez que la fosfatasa, por lo cual esta enzima constituye un buen indicador para
demostrar una pasteurizacin eficiente (tiempo y temperaturas correctas, 62 C por 15-20 min. o
72 C por 15-20 seg., temperaturas a las cuales se destruye tambin el Bacillus tuberculosis).
La determinacin consiste en hacer actuar la enzima sobre un sustrato amortiguador
(buffer) que contiene fenilfosfato disdico.
Cuando la leche es cruda o bien no ha sido pasteurizada correctamente, est presente la
fosfatasa, la cual al actuar sobre el ester fenilfosfrico libera el fenol, este ltimo se determina
colormtricamente con N2 6 tricoloro 6 pe-benzoquinoneimida con la que da un color azl; sin
embargo, la prueba no es muy exacta debido al fenmeno de reactivacin de la enzima.
2. ALCANCE.Leche pasteurizada
3. MATERIALES Y EQUIPO.

Tubos de ensaye graduados de 5 y 10 mL

Tubos de ensaye con tapn libre de fenol
Pipeta serolgica de 2 mL
Bao Mara de temperatura de 37 a 38 C
Vasos de precipitados de 500 y 1000 mL
Embudo de vidrio de 8 cm. de dimetro
Papel filtro Whatnab No. 4
Fotocolorimetro a 610 nm (opcional)
Potencimetro

4. REACTIVOS.

Solucin buffer de hidrxido de bario-borato

Solucin buffer metaborato de sodio para desarrollo del color pH 9.8
Solucin buffer de metaborato de sodio para dilucin del color
Sustrato amortiguador de fenilfosfato disdico (0.1% en solucin buffer de dixido de barioborato)
Reactivo precipitante para protenas de zinc-cobre
Reactivo CQC (N,2,6 tricoloro-p.-benzoquineimida)
Solucin de sulfato de cobre al 0.5%

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Fosfatasa residual Mtodo oficial de Sanders y

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Primera

Fecha de revisin:
Mayo 2008

Fecha de elaboracin:
Enero 2005

Alcohol N-butilico
Solucin stock de fenol (1g/l)
Soluciones estndar de fenol

5. PROCEDIMIENTO.5.1.

Mtodo I
5.1.1.Se miden alicuotas de 1 mL de muestra en 3 tubos (un tubo es necesario como testigo y los
otros para hacer la determinacin por duplicado).
5.1.2.Calentar el testigo 1 minuto en bao de agua hirviendo (la temperatura de la muestra debe
ser de 85-90 C, enfriar a temperatura ambiente. De este paso en adelante, tanto el testigo
como la determinacin se tratarn de la misma manera.
5.1.3.Adicionar 10ml de solucin buffer de fenilfosfato disdico, tapar los tubos y mezclarlos
invirtiendo varias veces. El pH de la mezcla debe ser de 10.0 0.15.
5.1.4.Inmediatamente despus, incubar en bao de agua a 37-38 C durante 1 hora, agitando
ocasionalmente.
5.1.5.Calentar en bao de agua hirviendo por un minuto, enfriar a temperatura ambiente en un
bao de agua fra.
5.1.6.Adicionar 1 mL de solucin precipitante de protenas (Zn-Cu).
5.1.7.Filtrar en papel Whatman No. 42. Recibir el filtrado en un tubo graduado de 5 y 10 ml.
5.1.8.Adicionar 4 gotas de reactivo CQC, mezclar y reposar 30 minutos a temperatura ambiente
para desarrollar el color.
5.1.9.Determinar la intensidad del color azul, ya sea con fotocolorimtrico o por comparacin
visual contra los estndares.
5.1.10. Si la determinacin se hace colorimtricamente:
5.1.10.1. Preparar una curva estndar, diluyendo 10L de solucin stock de fenol con agua y
aforando a 1 litro (1 mL = 10 unidades o ug de fenol). Diluir en matraces
volumtricos para tener: 0.0, 0.5, 1.0, 3.0 y 5.0 unidades de fenol. Mantener estos
estndares en refrigeracin.
Elabor:

Revis:

Autoriz:

Aseguramiento de Calidad

L. Q. Ma. Concepcin Elizalde

Jefe Aseguramiento de Calidad

Ing. Diana Tovar G.

Coordinador HACCP

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Departamento:
Aseguramiento de Calidad
Clave:
TZ-ACC-029-FQ
Fecha de elaboracin:
Enero 2005

5.1.10.2. Tratar cono a las muestras y leer la absorbancia a 610 nm. Trazar una curva
estndar restando de cada valor el dato del blanco y graficando absorbancia VS
unidades de fenol. Interpolar los colores de las muestras.
5.1.10.3. Si la determinacin se hace visualmente, preparar una curva estndar como se
indic y comparar las muestras directamente.
6. CALCULOS.
Cuando se usa 1 mL de muestra y se aaden 11 mL de reactivos (volumen total 12 mL de los
cuales se emplean 5mL de filtrado), multiplicar el valor de la lectura por 2.4 para convertir a
equivalentes de fenol por mL de muestra.
Equivalentes de fenol mayores de 4 unidades o ug/mL indican pasteurizacin reciente.
NOTA: Un mtodo que facilita esta determinacin y que puede usarse para fines prcticos, es el uso de
los reactivos de SIGMA (Lactozyma 1 y 11). Esta es una prueba cualitativa rpida y se propone
como mtodo alternativo de rutina.
7. REFERENCIAS.Elaboracin de Mtodos de Anlisis y Calibracin TZ- PCC 007
Methods of Analysis of the A.O.A.C.
12 eh Ed. Pg. 259 Mtodo 16.101
SIGMA
Instructivo de uso del Kit Lactozyma para fosfatasa en leche.
Santos moreno armando.
Bioqumica de la leche y sus productos
1982
Pg. 90