Parcial segunda instancia Enzimología 2019

Ejercicio 1

Se llevó a cabo la expresión recombinante de una lipasa BTL2 expresada en E. coli. Para
purificar esta enzima, se realizó una cromatografía de interacción hidrofóbica en batch.
ricuesta experimento
a) Indique cómo determinaría el % de rendimiento de la cromatografía realizada.
b) Diseñe un experimento para determinar la concentración de sustrato a la cual
debemos trabajar para estar en velocidades máximas.
c) ¿La velocidad máxima puede ser una velocidad inicial? Justifique
d) ¿La velocidad de reacción puede variar con el pH? Diseñe un experimento para
corroborar su respuesta
e) Se incubaron 3 fracciones de BTL2 a 50, 60 y 70°C durante 8 horas. Durante este
período se tomaron alícuotas de la enzima incubada en cada condición cada 30 min y se midió
la actividad de la enzima con exceso de sustrato y a 50°C.
Los resultados de este ensayo indicarán (i) o (ii)? Justificar.
i) A qué temperatura la enzima presenta mayor actividad
ii) A qué temperatura la enzima es más estable X
f) En uno de los puntos del ensayo anterior de midió la actividad monitoreando la
aparición de producto a 340 nm (ε340nm=15 mM-1cm-1) durante 5 minutos de una solución de
2 mL de buffer pH 8 que contiene exceso de sustrato con 5μL de una dilución 1 en 200 de
enzima (Stock a 0.2 mM). La pendiente obtenida en este caso fue de 0,15. Calcule las UI/mL y
la Kcat en estas condiciones.
Ds
condiciones de exceso de sustrato
,
Umais
o sea
que trabajamos a
.
1a) R: Es el rendimiento de la purificación. Me indica cuánto de la enzima que estoy purificando logro recuperar en el
último paso con respecto a lo que tenía inicialmente. El parámetro qu e me indica cuánta lipasa tengo es la Actividad
enzimática. Considerado que las fracciones de clarificado y eluído tienen volúmenes diferentes, utilizaremos la a
Actividad total. Por ejemplo, si en el clarificado tenemos 500 UI y en el eluído tenemos 250 UI totales, 500 UI es el
100%, 250 UI es el 50%. El rendimiento en este caso es de 50%. Cuanto se logra recuperar con respecto a tu
material de partida. Miramos actividad total (UI). Hacemos regla de 3. L UI eluidox100/UIclarificado= %rendimiento.

b) exceso de sustrato: cuando todos los sitios activos de la enzima están ocupados.
1) Medimos vel de la reaccion a distintas conc de sustrato.
2) graficamos vel en función de sustrato. Obtenemos hipérbola Michaeliana. Linealizamos haciendo 1/v (en y) y 1/s
(en x). b) 1/vmax. Sacas km. Del término independiente saco vmax y de la pendiente saco km.
3) obtenemos valor de km. Cuanto sustrato es exceso de sustrato? Cuando trabajamos en conc de 10km nos
aseguramos que trabajamos en exceso de sustrato. 10 km pero tomando en cuenta limitante del sustrato podemos
trabajar con km menor. 10km nos aseguramos q trabajamos en velocidades máximas.

C) la velocidad maxima es una velocidad inicial.

Una velocidad inicial es la ve3locidad en que se consumió menos del10% del sustrato.
Vmax: toda la enzima esta formando complejo9 enzima sustrato q v a a formar producto. La conc de producto q
genera por tiempo es la maxima q voy a generar. En vmax la enzima esta saturada y es la max cantidad de prod por
tiempo q puedo generar,. Para aumentar esta cantidad se debe agregar mas enzima.

La lipasa es una proteína, por lo que un cambio en el pH del medio de lavado puede alterar el grado de ionización de
grupos amino y carboxilo de la superficie de la misma. La actividad enzimática se verá afectada si este cambio se
produce en residuos de aminoácidos implicados en la estabilidad de la enzima, en la unión del sustrato y/o en la
catálisis. Generalmente, a pH extremo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su
inactivación. Puede definirse entonces un rango de pH donde la enzima sea activa y dentro del mismo un pH óptimo
el cual se define como el pH en el cual la conformación es la más adecuada para la actividad catalítica.

Se trabaja con exceso de sustrato porque así se sacan mas fácil kcat y nos aseguramos que todas las enzimas están
formando complejo enzima-sustrato.
 La vel de la reacción puede variar con el pH.
1) mido velocidad de la reaccion a diferentes pH. Fijamos temperatura, conc de enzima y conc de sustrato.
(10km q sabemos que nuestra enzima no se inhibe).

Ap

İ
tx

vel
BH
A
-

B
grófica
L

C
L

iCual es el
pl optimo

?
Me
figdeo donde
tengo
el valor mors
-
s
alto actividad última
en esto
groifica

.
e) a q temperatura la enzima es más estable. Voy a ver como varia la actividad en distintos tiempos. Factor tiempo.

Dejas el mismo sustrato y la misma enzima, y cambias el pH. Y ahi se mide en el espectrofotómetro.

Al incubar 30 min podes ver la actividad en cada temperatura

de
y ver qué tan estable es la enzima en el tiempo. Esto
es parte de la estabilidad. estabilidad
fautor
.
100
ho
sulmL p X
t
0o
-

Ast

puzezz
Act thk
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A

Lirıısreoso
.
100%
-2
si faradcepbe
.
..
Parametro vida media cuando al de la actividad Cuanto la relocidad media
llegors
50% scor mos
mayor
:
.
,
estable actividad
tardo mors tiempo in perder d 50% de la
you que
,
2 perdiente es

fl umdlesImin
a
.x
umoles
la misma
340 1000 0,005
p
enzima
nm
mL
ml
f
E cm X
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z
xO ImL
5mpq."
"
I ds

umoles 2,005 mL GUIImL X 200 ( 3

11200.
¥
FD)
n enzimotica
o

Loo medida se mizo an

generadosx Actividad

min
5
j
min
.
civi
Ej C 15 0,01 mIT volumenenlacubeta
=
-cfuf
:
an
=D,
Dortos lij min
O MM of
-JUL=
.001
:
.2005UL
buffer
}
aml of : 2, 4 =[
vensayo
M
:
Eo)
x10-4m
ğuL enzima 2 t 005- 2,005 dilucion 11200 de enzima 0,2%

} 200 0,00 1 onM

0
ml
7
P dilucion 1120 Stock 0,2 M
o
=0,15
m
:
Abs de una dil 11200 de enzima Keort Vmas 3
0,01 mM lmin
."BuL
=EC.l
.
{
"

C Abs g
L D 95 g MMY x
1000: ( 0,2 m M LEr 2, 4 4 90 m
=
=
UM
)
1"
stock
)
,
E l lo lo cubetor Imi de buffer min min 1.
5mMcm
Kaort: 60
"
min min con
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puse
4166
.l
"
.
Do
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velocidad s Keort
- ^
"
s
:
dereacción

pend
.
E
:
Ejercicio 2

Se cuenta con una fracción de tripsina en el laboratorio que ha sido almacenada congelada por
15 meses. Se cuantifica la concentración de proteína presente en la muestra (10 mM) y se
quiere saber cuánta de esa proteína sigue activa. Para esto, se llevó a cabo el estudio de
velocidad de reacción con diferentes concentraciones de esta tripsina en presencia de 2 nM de
aprotinina (BPTI). Los resultados se presentan en la figura debajo.
si todo dela cnzzine estó
11

o09d
a
activo empiczo vero

rpunidtinon
,
h

6xer
BPTJ

ecuación de la recta: y= estorecź

6.1*10-5x – 2.44*10-4
la gritica Glxea und

-y-s,
amp
.no
sino
inhibidor X =

2, 44 x -4 Li
Trubiera
.
10
=

Gi X

1D-5
1
2 tripsina inhibida lactival

nin
2 " inhibida linactival

no
.
nM
forme claces
no 41 0 % 100% 10
covalenter
ICEST

mM
De
Z 50 % enzima 50% x

î sewrze
a

eltima libre
,
activa
p * a TESJ X 5
a) ¿Qué tipo de inhibidor es el BPTI? Reversible compsetitivo de alta

=
jmM
afinidad
b) ¿Cuál es la concentración de enzima activa en la fracción que se descongeló?
.
c) A continuación, se observan 2 geles del estudio realizado en clase donde se incubó una
solución de BSA (indicada con una flecha en el gel) con 10 nM de tripsina. Los geles
corresponden al análisis en el tiempo de los ensayos sin inhibidor y con 35 nM de BPTI.
Indique qué gel corresponde a qué condición. Justifique.

Gel A Gel B

de dx

sin inhibidor la banda de con 35 niq de BPPI

.
cantidad de inhibidor
,
BSAva
disminuyendo de
cantidad
tamaño
de
mayor
que de tripsina
xq tengo menos trip
innivaa
Hoda la
.
protcina entera Como inhibidor la
no
hay actuor sobre
.
,
la BSA se va o hidrolizar debido
a la
tripsina
BSA
).
.
 Parcial Enzimología 2018

Ejercicio 1

Se llevó a cabo la expresión recombinantes de una lipasa CalB. Para purificar esta enzima, se
realizó una cromatografía de interacción hidrofóbica. Para cada fracción se midió la actividad
con un sustrato sintético, p-nitrofenil palmitato (épsilon de p-NP 16 mM-1cm-1) y se
cuantificaron las proteínas por el método de Bradford. Los resultados se observan en la
siguiente tabla.

Fracción Concentración Actividad Volumen

(mg/mL) (UI/mL) (mL)
Clarificado 20 300 10
Percolado 17 100 10
Eluido 6 300 5

A) Calcular el % de Rendimiento y factor de purificación del proceso.

B) Describa una estrategia para perder menos lipasa en el percolado.
C) ¿Qué puede decir acerca del grado de pureza de la enzima eluida?
D) Se contaba con una alícuota congelada de CalB de una purificación previa y se quiere
comparar la actividad con esta nueva fracción obtenida. Para ello, se mide la
absorbancia a 340 nm durante 2 minutos de una solución de 4 mL de buffer pH 8 que
contiene exceso de p-NPP con 20μL de una dilución 1 en 50 de enzima (Stock 0.2 mM).
La pendiente obtenida en este caso fue de 0,18. Calcule las UI/mL de esta fracción.
E) Si en la condición D nos encontramos en velocidades máximas, calcule la Kcat para el
stock de enzima que se tenía congelada.
F) Si la medida en (D) se repite a pH6, ¿cree que podría obtener resultados diferentes?
Justifique
G) Diseñe una metodología para estudiar si esta enzima es más estable a 10°C que a 25°C.
340 -2
Ec
.lY
0.18
AbS
. Abs :
0.18 =

D D 1 m M x 1
min
mm
,
A % de rendimiento 16 mig1cm"
Sc 4
min

stock O
:
:
o
mL
).
2min
actividad total zOuldilución 81:50
Para socar 20:50:
de entima lo 220,004
:
O,4uL
mL
,o0srmL)
actividad enzimatica
Se multiplica x vol
Diseña metodogio
.
:
Clarificado ACTIVIDAD TOTAL
:
Paso
:
30001/ paso
mL=3000
10 x vi a
.
m2
Eluido ACTIVIDAB TOTAL
cued vaa se testable
:
:
30001/
MLx 10
lo
mt:00w
que as
que
3000 100%

tengo
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o
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X 60%
.
1800 1
=
U
Foctor de purificación
:
Ç de purificación
15
boulling
Forctor
Act esp del eluido
u1ling:6s
.
g
.
.
Act esp
del clarificado
.
.
Act
esplulm Ungtotoles Mg
totoles clarificado EJVolumonlma
x mglant
:
.
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.
" :
-zo0ng
aClarificado -
euling
:
bonglaty
zoomg cluido sut 2000
-son
:
uI
Eluido 180001
Ullng
* =60
:
z
0mg
Ejercicio 2

Se quiere estudiar el efecto del inhibidor BPTI sobre la tripsina. Para ello se diseña un ensayo
donde se incuba tripsina con BSA y se toman alícuotas cada 15 minutos hasta llegar a una hora.
Por otro lado, se incuba tripsina con BSA con 10 veces más inhibidor que enzima.

a) Completar la siguiente tabla para la condición de 10 veces más inhibidor.

Concentración Concentración Volumen a

del stock final en la agregar en el
reacción ensayo (mL)
Tripsina 40 μM 10 μM
BSA 20 mg/mL 0.5 mg/mL
BPTI 1 mM 100 μM
Buffer de reacción para completar 0.5 mL
TOTAL 0.5

b) ¿En qué orden agregaría los reactivos? Justifique

c) Se analizan las muestras por SDS-PAGE. En A se observa el patrón obtenido para el
estudio en ausencia de inhibidor. La BSA se indica con una flecha. Dibuje lo que espera
ver en B con 10 veces más inhibidor que tripsina. Justifique su respuesta.
A B

Carriles: 1 Marcador de peso molecular, 2 tiempo 0, 3-6 tiempo 15, 30, 45 y 60 min.
 parcial 1:

1 ¿

llarificado?
aluler

l
-
sBM del lisado

2). fracción no unida de la

de
cromatografia interacción
hidrofóbica ¿ Percolado

?
aclarificandro

a) Se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica la cual es un método de separación y

análisis que separa de acuerdo a diferencias en propiedades específicas tales como: carga,
hidrofobicidad, tamaño, polaridad, bioespecificidad. Consiste en un conjunto de técnicas que involucra
una fase móvil (en este caso el clarificado) que carrea los solutos a analizar a través de una fase
estacionaria (octyl-agarosa).

b) Se corrió la electroforesis para visualizar las proteínas en cada fracción y tener una idea de la pureza
de la fracción del eluído final.

c) Se realizó el lisado celular ya que se debían romper las células porque las lipasas son proteínas
intracelulares. CONSULTAR SI ES CORRECTO O FALTA MÁS.

d) el rendimiento no se calcula con actividad total????? Los datos que nos dan son de actividad
enzimática.

Como tenemos distintas volimenes de clarificado y eluido (20 10 ml respectivamente

y
),
para calcular e loR lo hocemos socando la actividad total ( s
actividad enzimática ( vollmi
UlmUx
u)
)
Act total lisado (0): 20
10 rend
mL-200
UImIx U to 2000 100%
.
:
15 UImL
"" dluidolu

lomLiI 1500 1500 x 75%

):
x
:
 d) sí concuerda con lo observado en el gel, ya que se obtuvo un rendimiento alto de la purificación
(75%) y en el gel a la altura de los 134 kDa se encuentra una banda tanto en el lisado como en el eluido
que se supone que corresponde a la lipasa. A su vez en el carril del eluido no se observan otras
bandas, por lo que se puede concluir que la purificación sí fue de alto rendimiento.

el protrica del
somglm
eluido

:
,
nol ( totoler
Act
especifica Lulig Act total x
:

ing

:
JnglaL
.
.
)
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totales dluido comtr
x soong
songlat

.Im11
-
Act
especifica ( : =0.5
Ulmng
UImg)
1500
.
.
z
00mng
a) El BPTI (Aprotinina) es un inhibidor reversible competitivo de alta afinidad. El PMSF es un inhibidor
irreversible.

b) Medir actividad enzimática por duplicado de la tripsina (enzima) con el sustrato (p-NPB?) utilizando
buffers con distintos pH pero con la misma fuerza iónica. Por ejemplo: pH 4.5, 7, 8 y 10. Lo que va a
variar en las medidas es únicamente el pH, la concentración de enzima y sustrato y la temperatura se
mantienen constantes. Se tomarán las muestras a temperatura ambiente. Se va a medir la absorbancia
en el tiempo mientras se forma producto.

Las pendientes obtenidas (Abs/min) se convierten en concentración en el tiempo, utilizando la Ley de

Lambert Beer, ya que: Abs = C x l x epsilon. C = Abs/epsilon. Calculamos la actividad enzimática (Ul/
mL) y la graficamos en función del pH. Donde la tripsina presente mayor actividad, será su pH óptimo.

P 8
WIml
o
to

W
pliy

* J
PH

c) Se hará el estudio de la cinética de la hidrólisis de BSA (proteína modelo) en ausencia y presencia de

BPTI. Para esto se utilizará un método de determinación discontinuo, es decir, se iniciará la reacción de
interés y la detendremos a diferentes tiempos.
Se realizarán 3 incubaciones:
1) sin inhibidor: buffer, tripsina y BSA
2) con [inhibidor < [enzima : buffer, tripsina, BSA y BPTI
3) con [inhibidor > [enzima : buffer, tripsina, BSA y BPTI
Tomar alícuotas a distintos tiempos (0, 15, 30, 60 y 120).
 c) Luego de tomar las alícuotas, detener la reacción con el agregado de PMSF (inhibidor irreversible).
Almacenar a -20°C.
Correr las muestras en un gel de poliacrilamida y observar los resultados.
Se espera que en el primer experimento se observe la BSA sin hidrolizar, ya que no había presencia de
inhibidor de tripsina, quien se encarga de esto. En el segundo caso se espera ver inhibición y en el
tercero una más acentuada aún.

a) La BTL2 sobre el pNPB lleva a cabo una reacción de hidrólisis, que genera 2 productos: un producto
coloreado llamado p-nitrofenol (amarillo) y ácido butírico (incoloro).
b) Medimos a 400 nm porque es la longitud de onda a la que absorbe el pNPB. CONSULTAR.
c) 1. Añadir buffer fosfato de sodio 25 mM pH 7 en un falcon.
2. Agregar 4-MUB y vortexear bien. Este paso es importante para que el sustrato se resuspenda bien
en el buffer.
3. Pasar rápidamente esa mezcla a una cubeta.
4. Llevar al espectrofotómetro y hacer un blanco a 400 nm. CONSULTAR SI ES A 400NM
5. Agregar la enzima a la cubeta, tapar el tubo con el dedo (con guante), invertir 3 veces rápidamente y
volver a colocar en el espectrofotómetro.
6. Medir absorbancia a 400 nm por 2 minutos, en modo cinético.
7. Anotar la pendiente que otorga el equipo.
8. Repetir cada medida por duplicado. Los duplicados no deben diferir en más de 15% para ser
aceptados, si la diferencia es mayor, repetir el ensayo.

Ahora para obtener la velocidad de reacción, la actividad enzimática (unidades/mL), la actividad total
(unidades totales) y la actividad específica (U/mg) a partir de los datos de absorbancia, se realizó el
siguiente procesamiento de datos:

Convertimos to pendiente ( obtenidor tiempo utilizando de

Q en el
equipo
en unor E end lo
ley
.
1
Abslmin)
,
Lombert Beer
.
.
....""
de Lombert
Ley Beer Las unidades de lo () las dictor el E
-
.
:
.
X
z
1000
A Gic zC pend -
mM z
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g
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=

UMT
=A
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.
Proliento-alin
Tiempolming E b E min min E min

la variación de la C en
MMolar
3
de producto generado en el tiempo es

la rel de reacción
.
 Horcemos de
una
reglo de 3
para pasar 43 por min a
umoer totaler
generados de producto por min

.
,
umoles 1000 mL pendiente Vensayo
=

umoles totoles Se estos micromoles

generan
,

-1000-
d
g
min E mim de producto en esa subeta

-1000
.
umolestotales Vensayo umoles
do min

min
sustratorbufferzenzima
X Hx
Una umolar
I define se como umoles por litro de reaccion Es desir los umoles en 1000 Para obtener

.
)
ml
,
los umoles totales obtenidos se debe tener cuenta el volumen real del
ensayo
en

.
Horcemos de los umoles de
nuevamente uno
reglor 3
para obtener
generados por
mL enzima

.
Yau sabemos los umoles
generados en el

ensayo
en total Esto los
generaron
un
umoles Venzima
.
-
volumen de pendiente 1=
lo
1000-
enzima min -2
que agregamos
a

.
Vensayo
umoles
Calculamos umoles
mbeta
reglo de lo E
Iml miniml
con 3
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.1000-venzime
.
-
entonces Imk de minimL Esto los
genero
enzima son
.
vllmL

You conociendo la actividad enzimática total

podemos actividad sacar
,
Act Total act enzimática (
mII
:
UlmLJx
.
.
.
d Lor liposa tiene mos afinidad el
por P
)
-NPB.
e
).
Efecto de pH sobre enzimas. Relación de Km con enzimas. Cómo afecta el pH en la actividad enzimática? El pH
afecta a los residuos aminoacídicos, ya que cambia las cargas al modificar el grado de ionización. Hay
aminoácidos que son ionizables (se pueden protonar y desprotonar). Protonar si hay hidrogeniones y desprotonar
si no hay hidrogeniones. El pH es una medida directa de la cantidad de hidrogeniones presente en la solución.
Residuos aminoacídicos ionizables si hay mayor concentración de hidrogeniones más protonados. Si está o no
protonado me afecta en cómo se relaciona con los residuos aminoacídicos a su alrededor. Catálisis: generación
de producto.

Cuál es el efecto del pH en catálisis enzimática? Modificación de residuos involucrados en la generación de

producto. Se debe mirar qué residuos están siendo afectados. Km me da idea de la afinidad de la enzima por el
sustrato. Cuanto más grande Km, más fácil se disocia, tendrá menor afinidad. Km nos da idea de la disociación
de la enzima con el sustrato. Residuos afectados: los de la unión enzima - sustrato, que a veces pueden ser los
mismos que los de la catálisis o no. Km se ve afectada a distintos pH? Habría que medir la velocidad de la
reacción en función de la concentración de sustrato a otro pH. Mirar hipérbola, como varía la Km. Si cambia la
Km, cambia Vmáx? No necesariamente. Miramos los residuos aminoacídicos relacionados en la generación de
producto. El pH puede afectar la Km y no afectar Vmáx ni Kcat. O no afectar Km y sí Vmáx y Kcat. Vmáx y Kcat
varían dependiendo de la concentración de enzima.

Cuando decimos “afecta” nos referimos a que varía el grado de ionización.

Parcial 2:

endvel
.
f) La BTL2 sobre el pNPB lleva a cabo una reacción de hidrólisis, que genera 2 productos: un producto coloreado
llamado llamado p-nitrofenol (amarillo) y ácido butírico (incoloro).
g) Se mide la absorbancia.
h)
i) La velocidad inicial de una reacción se define como la velocidad en la que se consumió menos del 10% de
sustrato.
j) La lipasa tendrá mayor afinidad por el p-NPB ya que la Km para este sustrato es de 0,5 mM, mientras que para
el 4-MUB es de 1mM, y una Km más baja indica mayor afinidad.

Km: es la afinidad que tiene la enzima por un sustrato o la concentración del sustrato a la cual la velocidad de
reacción es la mitad de la velocidad máxima para que la enzima se sature en un 50%.
Km baja: alta afinidad por el sustrato. Enzima es estable, tendencia a la síntesis. Por ejemplo transferasas,
isomerasas.
Km alta: baja afinidad por el sustrato. Enzima inestable, tiende a romper enlaces. Por ejemplo: hidrolasas y liasas.
Km: Vmáx/2

La enzima tiene mayor afinidad por su sustrato a menor Km y el complejo ES es más estable. Es decir, una
enzima con baja Km indica gran afinidad por el sustrato por lo que con una mínima cantidad de sustrato se satura
la mitad o el 50% de la enzima y con un poco más de sustrato se data completamente alcanzándose la velocidad
máxima de reacción.

Vmáx Vorlor moximo al tiende lo curva experimental

que
:
Km Corresponde a la I de sustroto a lo cual lo relocidad de la reaccion es lo mitad de la Vmax
:
3
.
 sustrato
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,
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.
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.
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.
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generan estos micromoles
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Vensayo umoles
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p A aun
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:
*
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410
=E-l.c
.min
d

pesso
.
oo
Tlmin optico
)
pe
O under wooml
perd versoo
A
.
-400-
min s E Venzime
.1000-
undestotales resago
x
totales
limdes vertima

min

X ImL

umoles minumh
 I
percolado

h Actividad enzimática lulmi Volumen Iml Actividad totallul Rend (%)

).
.
)
lisordo 103 WImL 30 309 100%
Ow
mL
percolado ğWImL
Eluido con
Emidorzol 150 UImL
EluidoGF WImL zoml 1000 32,36%
w
5
O
Rend (%): 30900- 100%
.
1000 32,36%
U
x 2
 I
act la desnaturalizó
xq entima
no ver se
.
.
La baja actividad enzimática se puede deber a dos motivos: 1) el pH al que se encuentra (por
ejemplo 4.5 que cuando hicimos el ensayo obtuvimos muy baja actividad) provoca que el grado de
ionización de los residuos aminoacídicos involucrados en la catálisis no sea adecuado para la
generación de producto o 2) porque la enzima se desnaturalizó. Lo que se podría hacer es incubar la
enzima a pH 4.5 sabiendo que esta es activa a ese pH y medir la actividad a distintos pH. Nosotros
incubamos a pH 7 y a temperatura ambiente porque ya sabíamos que iba a funcionar. Si la enzima
tiene actividad, 4.5 no es adecuado para la catálisis, se descarta que sea debido a la
desnaturalización. Si no hay actividad, entonces se concluye que a pHs extremos la baja actividad es
debida a la desnaturalización.
En resumen, lo que se hace es elegir una condición en la que se sabe que la enzima es activa.
Nosotros elegimos pH 7 y temperatura ambiente. Lo que varía es cómo incubamos la enzima. En
este caso, incubando a pH 4.5 y luego midiendo la actividad, se obtendrá una idea de si no era
adecuado este pH para la catálisis o este provocaba su desnaturalización.
 Todo este experimento es un
punto da orca

:
Se hizo astordo grofice en
parómetros P
Absxmin
dejo de ser lineal no se
genera
más

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3

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0, Aca
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.

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P
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t ttt tt
0
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b

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Drx
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=
la
relocidad es la misma btx
,
lo enzima está saturada
to

todos las moleculos de enzima

están formando complejo (

Es],
lo () de
generar
se misma

producto