Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.
com
Eur J Clin Microbiol Infect Dis DOI
10.1007/s10096-014-2137-4
ARTÍCULO
Cultivo aeróbico de bacterias anaeróbicas utilizando antioxidantes:
un informe preliminar
B. La Escola&S. Khelaifia&J.-C. Lagier&D. Raoult
Recibido: 16 enero 2014 / Aceptado: 23 abril 2014
# Springer-Verlag Berlín Heidelberg 2014
ResumenSe ha demostrado que los antioxidantes ayudan al
crecimiento de bacterias anaeróbicas. Pudimos cultivar seis
especies anaerobias (incluyendoFusobacterium necrophorumy
Ruminococcus graveus)y siete especies aeróbicas, todas
aeróbicamente en tubos de agar Schaedler y placas de agar con
altas dosis de ácido ascórbico y/o glutatión. Esto puede cambiar
profundamente las estrategias para cultivar bacterias.
Introducción
Las bacterias anaerobias son los microbios más comunes en el
microbioma humano, especialmente en los tractos respiratorio y
digestivo.1]. Además, son críticos en infecciones transmitidas por
alimentos, abscesos cerebrales e infecciones pulmonares. Sin
embargo, el cultivo de estos organismos es difícil dados los
requisitos técnicos y la oxigenación de las muestras durante el
transporte que pueden matar bacterias extremadamente sensibles
al oxígeno [2]. Finalmente, paradójicamente, menos laboratorios
están equipados para cultivar bacterias anaerobias ahora que
antes, a pesar de las técnicas moleculares actuales, y MALDI-TOF
MS ha simplificado su identificación.3–7]. Culturomics presenta una
visión más clara de las bacterias asociadas con la mayoría de los
humanos, y se estima que aproximadamente 2000 especies
bacterianas, muchas de las cuales son anaeróbicas, se han aislado
al menos una vez en humanos.8]. Por lo tanto, buscamos optimizar
técnicas para cultivos anaerobios para mejorar la documentación
de infecciones multimicrobianas que incluyen anaerobios y para
cultivar bacterias no cultivadas que fueron
B. La Escola:S. Khelaifia:J.<C. Lagier:D. Raoult (*) Unité de Recherche
sur les Maladies Infectieuses et Tropicales Emergentes (URMITE),
UM63, CNRS 7278, IRD 198, Inserm 1095, Faculté de médecine, Aix
Marseille Universite, 27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille,
Cedex 05, Francia
correo electrónico: didier.raoult@gmail.com
identificado mediante técnicas moleculares a partir de
muestras humanas [9]. Un problema crítico en el cultivo
anaeróbico es evitar la toxicidad del oxígeno, lo que puede
lograrse agotando el oxígeno de la atmósfera y del medio
de cultivo o usando moléculas antioxidantes. En este
trabajo preliminar, evaluamos la eficacia de las moléculas
antioxidantes ácido ascórbico y glutatión para permitir el
cultivo de bacterias anaerobias estrictas y microaerófilas en
presencia de oxígeno.
Materiales y métodos
Para este estudio, utilizamos seis cepas anaerobias clínicas
aisladas e identificadas por nuestro laboratorio. Los
métodos utilizados para el cultivo, el aislamiento y la
identificación de estas cepas se detallan en otra parte [6,7].
losFusobacterium necrophorum, Finegoldia magna,
Prevotella nigrescens, Solobactreium moorei, Atopobium
vaginaeyRuminococcus gnavusSe utilizaron cepas. El
subcultivo de rutina de estas cepas se realizó utilizando
agar sangre de oveja Columbia (Biomerieux, Marcy l'étoile,
Francia) en atmósfera anaerobia utilizando un sistema de
gaspack (Biomerieux) a 37 °C. Las bacterias anaeróbicas se
cultivaron en caldo Schaedler con agar al 0,2 %
(Biomerieux), pendiente de agar Schaedler con agar al 1,5 %
(Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Francia) y placas de
Petri (55 mm) (Dominique Dutscher, Brumath, Francia) que
contenían agar Schaedler (Sigma-Aldrich) preparado según
recomendación del proveedor; el pH se ajustó a 7,2. Los
tubos de caldo Schaedler se descongelaron en un baño de
agua caliente para lograr la disolución completa del agar y
luego se mantuvieron a temperatura ambiente. Cuando la
temperatura de estos tubos alcanzó aproximadamente los
50 °C, añadimos 150 ml de solución maestra para obtener
una concentración final en el tubo de 0.
 Eur J Clin Microbiol Infect Dis

antioxidante como control. Los tubos se mezclaron suavemente y luego se

mantuvieron a temperatura ambiente antes de la inoculación. Para cada cepa, 107

las bacterias se diluyeron en 1 ml de agua que se mezcló

en los tubos. Se inocularon aeróbicamente 107bacterias/
ml y 100 μl de esta solución, respectivamente, de cada
cepa ensayada. Los tubos y las placas se incubaron en
atmósfera ambiente a 37 °C y se examinaron
diariamente para determinar el crecimiento. Tres
experimentos separados usando las seis cepas en tubos
de agar Schaedler y tres experimentos usando
F. necrophorumSe realizaron pendientes con agar y placas de Petri.
Para probar el efecto del ácido ascórbico sobre bacterias aerobias
estrictas y facultativas, inoculamos 100 μl de una suspensión de
siete especies diferentes a una concentración de 107bacterias/ml en
medio de agar Schaedler enriquecido con ácido ascórbico a una
concentración final de 1 mg/ml. Las especies probadas fueron
Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
aureus, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae,
Escherichia coliyEnterococcus faecalis.En todos los casos, la
identidad de las colonias que crecían en placas de agar se probó
usando MALDI-TOF como se informó anteriormente [10].

Resultados

Se observó un crecimiento en los tubos de control que carecían de

antioxidantes desde el fondo del tubo hasta 0,5–1,5 cm por debajo de la
superficie para los seis anaerobios evaluados, según la tolerancia al
oxígeno de la cepa como de costumbre. Las cepas más sensibles al
oxígeno, que crecieron a 1,5 cm por debajo de la superficie, fueron
F. necrophorumyR. gnavus (Higo.1). Para todos los tubos que contenían
antioxidantes, se observó crecimiento dentro de los 0,3 cm de la
superficie, incluso para las cepas más sensibles al oxígeno (Fig.1). El
crecimiento fue más rápido en tubos (incluso en condiciones
anaeróbicas) con antioxidante en las primeras 24 h; sin embargo,
después de 48 h, todos los tubos crecieron de manera similar. El
crecimiento en los tubos de pendiente de agar Schaedler y las placas de
Petri incubados aeróbicamente se observó solo en presencia de 1 mg/ml
de ácido ascórbico; las condiciones sin ácido ascórbico permanecieron
en cultivo negativo. Se observó un rápido crecimiento aeróbico y la
identificación fue concordante con las especies inoculadas.
El crecimiento obtenido para bacterias anaerobias no estrictas en
agar Schaedler ácido ascórbico fue idéntico al crecimiento observado en
medio no enriquecido.
Discusión
Figura 1aCrecimiento diferencial deF. necrophorumen tubos de medio Schaedler
incubados al aire y enriquecidos (izquierda)O no (Correcto)con 1 mg/ml de ácido
ascórbico.BCrecimiento deF. necrophorumincubado en agar Schaedler en una placa
de Petri durante 48 h sin enriquecimiento (Correcto)o con 1 mg de ácido ascórbico/
ml (izquierda)
0,5 mg/ml con 0,5 mg/ml de glutatión permite el crecimiento de
especies bacterianas que normalmente se consideran anaerobias.
El uso de antioxidantes para promover el cultivo anaeróbico se ha
propuesto antes pero no con tal concentración y con resultados tan
comparables.2]. La diferencia observada podría estar relacionada
con las altas concentraciones utilizadas en el presente estudio en
comparación con trabajos previos. Este trabajo es preliminar ya que
probamos solo seis especies anaeróbicas y siete especies aeróbicas
estrictas o facultativas, pero los resultados sugieren que en el
futuro sería posible usar un solo medio con una incubadora regular
en atmósfera aeróbica para cultivar bacterias aeróbicas y
anaeróbicas. . Por lo tanto, creemos que el uso de dicho medio
enriquecido ayudará a revivir el cultivo anaeróbico y contribuirá al
resurgimiento del uso del cultivo bacteriano.

En este trabajo encontramos que los antioxidantes tienen un efecto
dramático en el crecimiento de seis especies anaerobias que nunca se
habían reportado a tal nivel. Además, mostramos que este medio
también permite el crecimiento de bacterias aeróbicas. Adición de ácido
ascórbico a una concentración de 1 mg/ml o a una concentración de
Expresiones de gratitudAgradecemos a la Méditerranée Infection Foundation por
patrocinar esta investigación.
Conflicto de interesesHay una patente pendiente de Aix-Marseille Université
sobre el uso de altas dosis de ácido ascórbico para el crecimiento de
anaerobios.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis
Referencias
1. Gorbach SL (2005) Bacterias anaeróbicas: conceptos generales. En:
Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (eds) Principios y práctica de las
enfermedades infecciosas de Mandell, Douglas y Bennett, 6.ª ed.
Elsevier Churchill Livingstone, Filadelfia, págs. 1854–1863
2. Collins C, Petts D (2008) Métodos de cultivo para anaerobios patógenos: una
breve historia. Ciencias biomédicas 599–601
3. Bousbia S, Papazian L, Saux P, Forel JM, Auffray JP, Martin C, Raoult D,
LaScola B (2012) Repertorio de la microbiota de la neumonía en la unidad
de cuidados intensivos. PLoS UNO 7:e32486
4. Fenollar F, Roux V, Stein A, Drancourt M, Raoult D (2006) Análisis de 525
muestras para determinar la utilidad de la amplificación por PCR y la
secuenciación del gen 16S rRNA para el diagnóstico de infecciones óseas
y articulares. J Clin Microbiol 44:1018–1028
5. Al Masalma, LonjonM, Richet H, Dufour H, Roche PH, Drancourt M, Raoult D,
Fournier PE (2012) El análisis metagenómico de los abscesos cerebrales
identifica asociaciones bacterianas específicas. Clin Infect Dis 54: 202–210
6. Barreau M, Pagnier I, LaScola B (2013) Mejora de la identificación de
anaerobios en el laboratorio de microbiología clínica mediante
espectrometría de masas MALDI-TOF. Anaerobio 123:5
7. La Scola B, Fournier PE, Raoult D (2011) Carga de anaerobios
emergentes en la era de secuenciación del gen MALDI-TOF y 16S
rRNA. Anaerobio 17:106–112
8. Lagier JC, Armougom F, Million M, Hugon P, Pagnier I, Robert C, Bittar F,
Fournous G, Gimenez G, Maraninchi M, Trape JF, Koonin EV, La Scola B,
Raoult D (2012) Culturómica microbiana: cambio de paradigma en el
estudio del microbioma intestinal humano. Clin Microbiol Infección 18:
1185–1193
9. Singh S, Eldin C, Kowalczewska M, Raoult D (2012) Cultivo axénico de
bacterias fastidiosas e intracelulares. Tendencias Microbiol 21:92–99
10. Seng P, Abat C, Rolain JM, Colson P, Lagier JC, Gouriet F, Fournier PE,
Drancourt M, La Scola B, Raoult D (2013) Identificación de bacterias
patógenas raras en un laboratorio de microbiología clínica: impacto de la
matriz- Espectrometría de masas de ionización-desorción láser asistida
por tiempo de vuelo. J. Clin Microbiol 51:2182–2194