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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

in vitrocomparación entre el acetato de α-

tocoferilo y el fosfato de α-tocoferilo contra las
bacterias responsables de infecciones protésicas y
articulares
Alessandro Bidosi1☯, Mónica Bortolín1☯, Marco Toscano2, Elena De Vecchi1, Carlo L.
Románo3, Roberto Mattina4, Lorenzo Dragó1,2*

1Laboratorio de Química Clínica y Microbiología, Instituto Ortopédico IRCCS Galeazzi, Milán, Italia, 2
Laboratorio de Microbiología Clínica, Departamento de Ciencias Biomédicas para la Salud, Universidad de
Milán, Milán, Italia,3Departamento de Infecciones Óseas y Articulares y Cirugía Reconstructiva, Instituto
Ortopédico IRCCS Galeazzi, Milán, Italia,4Departamento de Salud Pública, Microbiología y Virología,
a1111111111 Universidad de Milán, Milán, Italia
a1111111111
☯Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
a1111111111
* lorenzo.drago@unimi.it
a1111111111
a1111111111

Resumen
Las infecciones relacionadas con biopelículas representan un problema recurrente en el entorno ortopédico. En

ACCESO ABIERTO los últimos años, se ha dirigido un gran interés hacia la identificación de nuevas moléculas capaces de interferir

Citación:Bidossi A, Bortolin M, Toscano M, De Vecchi
E, RomanoCL, Mattina R, et al. (2017)in vitro
comparación entre el acetato de α-tocoferilo y el
fosfato de α-tocoferilo contra bacterias
responsable de infecciones protésicas y articulares. PLoS
ONE 12(7): e0182323.https://doi.org/10.1371/
journal.pone.0182323
con la adhesión de patógenos y la formación de biopelículas en las superficies de los implantes. En este estudio, se
probaron dos formas estables de α-tocoferol, el éster de acetato hidrofóbico y el éster de fosfato soluble en agua.
in vitrocomo recubrimiento para prótesis de titanio. La actividad antimicrobiana contra los microorganismos
responsables de infecciones de prótesis y articulaciones se evaluó mediante el método de microdilución en caldo.
Además, se evaluaron los ésteres de α-tocoferol tanto por su capacidad para obstaculizar la adhesión bacteriana
como por la formación de biopelículas en superficies de titanio tratadas con chorro de arena. Los resultados

Editor:Martin Rottman, Facultad de Medicina de Harvard, mostraron que solo el fosfato de α-tocoferilo mostró actividad antimicrobiana contra las cepas analizadas. Ambos
ESTADOS UNIDOS ésteres pudieron interferir significativamente con la adhesión bacteriana y prevenir la formación de biopelículas,

Recibió:24 de febrero de 2017 especialmente porestafilococo aureusyStaphylococcus epidermidis. La actividad del fosfato de α-tocoferilo fue
mayor que la del acetato de α-tocoferilo. Se han informado alteraciones en los niveles de membrana en la
Aceptado:17 de julio de 2017
literatura y es posible que sean responsables de la interferencia en la adhesión bacteriana y la formación de
Publicado:31 de julio de 2017
biopelículas que muestran los ésteres de α-tocoferol. Aunque se necesitan más estudios para investigar mejor los
Derechos de autor:©2017 Bidossi et al. Este es un
mecanismos de acción y el espectro de actividad de los ésteres de α-tocoferol, estas características, junto con el
artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos
efecto positivo sobre la cicatrización de heridas y la respuesta inmunitaria, hacen que estas moléculas sean
de la Licencia de atribución de Creative Commons , que
permite el uso, la distribución y la reproducción sin candidatas prometedoras para el recubrimiento con el fin de prevenir la implantación. infecciones asociadas.
restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite
el autor original y la fuente.

Declaración de disponibilidad de datos:Todos los datos relevantes están

dentro del documento.

Fondos:Los autores no recibieron financiación específica para

este trabajo. Introducción

Conflicto de intereses:Los autores han declarado El término vitamina E se refiere a un grupo de tocoferoles y tocotrienoles, de los cuales el α-tocoferol (α-
que no compita existen intereses. T) tiene la mayor actividad biológica [1 ]. Es comúnmente conocido como un poderoso liposoluble

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 in vitroactividad antimicrobiana del acetato de α-tocoferilo y el fosfato de α-tocoferilo

antioxidante que es conocido por su capacidad para reducir el estrés oxidativo apagando los radicales
libres formados en la fase lipídica de las membranas o lipoproteínas, afectando el desarrollo de
enfermedades cardiovasculares, cánceres y enfermedades neurológicas [2 ] e influir positivamente en la
cicatrización de heridas [3 ]. Además, se dirige un gran interés hacia su posible papel en la regulación
génica y la señalización celular.3 ,4 ].
El acetato de α-tocoferilo (acetato de vitamina E, α-T-Ac) es el éster acético de α-T, un aceite viscoso altamente
hidrofóbico con una mejor estabilidad que la forma no reducida. Esta forma se usa comúnmente para tratar la
dermatitis atópica y otras enfermedades de la piel, donde se ha encontrado que el grupo acetato se hidroliza,
recuperando así la actividad redox.5 ].
Recientemente, se ha propuesto el uso de vitamina E en las superficies de los implantes para reducir la
extensión de la adhesión microbiana cambiando la superficie del sustrato y afectando el proceso de adhesión
microbiana. en unin vitroexperimento, se ha demostrado que la α-T-Ac incrustada en ácido poliláctico altera la
adhesividad bacteriana y la formación de biopelículas de manera similar a la forma α-T sin éster [6 ].

Además, se ha demostrado que la vitamina E incrustada en polietileno reduce la adhesión de los

biofilmsStaphylococcus epidermidis,estafilococo aureus,Escherichia coli, y Candida albicansaislado
de infecciones asociadas a biomateriales [7 –10 ], pero las diferencias intraespecies [10 ] y se han
reportado resultados contrastantes [11 ]. Un estudio anterior también ha demostrado que la
vitamina E provoca una reducción significativa de la hidrofobicidad demi.coli, pudiendo evitar la
adhesión de este microorganismo a la nitrocelulosa [12 ].
La adhesión bacteriana a la superficie del implante que ocurre con el tiempo durante la implantación quirúrgica está

determinada por interacciones específicas y no específicas entre los microorganismos y la superficie del material. El

proceso de adhesión que se produce en las primeras horas y la posterior formación de biopelículas en las superficies de

los implantes depende principalmente de las interacciones fisicoquímicas entre el sustrato y los microorganismos y está

fuertemente influenciado por las propiedades físicas de la superficie (rugosidad, hidrofobicidad, carga electrostática,

recubrimiento) [13 ]. Por lo tanto, se están realizando grandes esfuerzos para descubrir estrategias nuevas y confiables

para evitar la unión de patógenos a los implantes.

En los últimos años, una forma soluble en agua de α-T, fosfato de α-tocoferilo (fosfato de vitamina E, α-
TP), se ha detectado en bajas cantidades en tejidos y plasma humanos y animales.14 ]. Dado que el grupo
hidroxilo responsable de la actividad antioxidante está fosforilado en α-TP, esta molécula no debería tener
actividad antioxidante.per se. Rezky otros. ha propuesto que esta molécula actúa como una provitamina,
aún manteniendo una actividad antioxidante muy fuerte y exhibiendo algunas actividades reguladoras
novedosas en las células [15,dieciséis]. Hasta donde sabemos, no se han realizado estudios para evaluar la
actividad antibacteriana de α-TP hasta el momento.
El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar lain vitroactividad antimicrobiana y eficacia en la prevención de
la adhesión y formación de biopelículas de α-T-Ac y α-TP contra microorganismos responsables de infecciones de
prótesis y articulaciones.

Materiales y métodos
reactivos
Se utilizaron los siguientes reactivos: acetato de α-tocoferilo (Alfa Aesar, Heysham, Reino Unido)
y fosfato de α-tocoferilo (sal disódica de fosfato de α-tocoferol; Sigma-Aldrich, Milán, Italia). Las
soluciones madre se prepararon disolviendo α-T-Ac en etanol (500 mg/mL) y α-TP en agua
destilada estéril (250 mg/mL).

Cepas bacterianas
En este estudio se utilizaron cepas clínicamente relevantes aisladas de pacientes con infecciones de
prótesis articulares en el Laboratorio del Instituto Ortopédico IRCCS Galeazzi. cinco cepas cada unaS.

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epidermis,S.aureo,Pseudomonas aeruginosayPropionibacterium acnesfueron incluidos en el estudio. La

identificación de las cepas se realizó con el Vitek12 Sistema compacto (bio-Mérieux, Marcy l'Etoile, Francia), que
asienta tarjetas de reactivos colorimétricos que se incuban e interpretan automáticamente. Las tarjetas tienen 64
pocillos, cada uno de los cuales contiene un sustrato de prueba individual para medir diversas actividades
metabólicas (p. ej., acidificación, alcalinización, hidrólisis enzimática y crecimiento en presencia de sustancias
inhibidoras). En particular, Vitek1Tarjeta de identificación GN, Vitek1Tarjeta de identificación GP y Vitek1La tarjeta de
identificación ANC se utilizó para la identificación microbiana mientras que las pruebas de susceptibilidad
antimicrobiana de estafilococos yPAGS.aeruginosase llevó a cabo en Vitek1Tarjetas AST 632 y 202,
respectivamente.
La identificación de la tinción se confirmó aún más mediante la secuenciación del ADN de aproximadamente
80 pb de las regiones variables V1 y V3 del gen 16S rRNA mediante pirosecuenciación (PSQ96RA, Diatech, Jesi,
Italia), como se informó anteriormente. Las secuencias obtenidas se pegaron en BLAST para realizar la
identificación (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ).
Las cepas se almacenaron a -80 °C en caldos apropiados enriquecidos con glicerol al 10 % (VWR Chemicals, Lovaina,

Bélgica) hasta el momento de la prueba.

Actividad antimicrobiana por microdilución en caldo

Las actividades bacteriostáticas y bactericidas de α-T-Ac y α-TP se evaluaron frente a las cepas bacterianas
antes mencionadas evaluando la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la concentración mínima
bactericida (MBC). La CIM, definida como la concentración más baja capaz de inhibir el crecimiento
bacteriano, se determinó mediante el método de microdilución en caldo, de acuerdo con las directrices de
EUCAST [17 ] excepto por el uso del caldo Brain Heart Infusion (BHI; Biomérieux, Marci l'Etoile, Francia) en
lugar del caldo Mueller Hinton. Brevemente, para cada cepa una suspensión con una densidad igual a 0,5
McFarland (1,5×108CFU/mL) se preparó en BHI. Para apoyar el crecimiento dePAGS.acnes, el caldo se
complementó con sangre de oveja desfibrinada al 5% (Liofilchem, Roseto degli Abruzzi, Italia). Después de
diluciones apropiadas, una alícuota de cada suspensión (105CFU/ml) se inoculó en una placa de
microtitulación de 96 pocillos que contenía diluciones en serie de 2 veces de α-T-Ac y α-TP. Debido a los
límites de solubilidad, la concentración máxima utilizada para ambas formulaciones fue de 200 mg/mL. Los
controles de crecimiento se realizaron inoculando suspensiones bacterianas en BHI solo. Los valores de
MIC se leyeron después de 24 h de incubación en condiciones adecuadas (excepto paraPAGS.acnesque se
incubó durante 48 h). El MBC se determinó sembrando 10 μL de cada pocillo que no mostraba turbidez en
placas de agar de soja tríptico (TSA; Merck, Darmstadt, Alemania) o placas de agar sangre Schaedler (SCH;
bioMérieux, Marcy l'Etoile, Francia) en el caso de P acnés TSA se incubó en aerobiosis a 37 C̊ durante 24
horas, mientras que SCH se incubó a 37̊ durante 48 horas en anaerobiosis. La atmósfera anaeróbica se
creó en frascos mediante sobres generadores de gas anaeróbico (OxoidTM AnaeroGenTM 2.5L, Thermo
Scientific). Después de la incubación en las condiciones adecuadas, se leyó MBC como la concentración
más baja capaz de matar el 99,9 % del inóculo inicial.

Propiedades antiadherentes sobre titanio arenado

La actividad antiadherente de la vitamina E se evaluó frente a una cepa representativa de cada especie.
PAGS.acnesno se incluyó en estos experimentos porque ninguno de los aislamientos probados pudo
adherirse o formar biopelículas en nuestroin vitroajuste. Se utilizaron como sustrato para la adhesión
bacteriana discos estériles de titanio arenado con un diámetro de 25 mm y un espesor de 5 mm (Adler
Ortho, Cormano, Italia). Los discos se recubrieron esparciendo uniformemente la cantidad adecuada de α-
T-Ac o α-TP en la superficie superior del disco para lograr una concentración final de 5 mg/cm2. Se usaron
discos sin recubrir como controles. Posteriormente, se resuspendió un cultivo bacteriano durante la noche
en BHI a una densidad de 1,0 × 107UFC/mL y 400 μL de suspensión microbiana

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se inoculó en discos recubiertos y no recubiertos. La prueba se realizó por triplicado para cada cepa. Después de
30, 60 y 120 min de incubación, los discos se enjuagaron dos veces sumergiéndolos en 5 ml de solución salina
estéril para eliminar las bacterias no adherentes. Luego, los discos se sumergieron en 5 ml de una solución de
ditiotreitol al 0,1 % p/v (DTT; Sigma-Aldrich, Milán, Italia) y se agitaron mecánicamente durante 15 min a
temperatura ambiente para separar las bacterias adheridas a los discos [18 ]. Las diluciones adecuadas de los
fluidos obtenidos se sembraron en TSA y se incubaron a 37 °C en atmósfera aeróbica durante 24 h para el
recuento de UFC.

Prevención de la formación de biopelículas en titanio pulido con chorro de arena

La capacidad de α-T-Ac o α-TP para prevenir el desarrollo de biopelículas se evaluó después del desprendimiento
químico de las células bacterianas seguido del recuento en placa convencional (método CFU). Para evaluar el
efecto barrera de los dos compuestos, se recubrieron discos de titanio con 5 mg/cm2de α-T-Ac o α-TP, como se
describe anteriormente, y luego se usa como sustrato para la formación de biopelículas. Se usaron discos sin
recubrir como controles. Se resuspendió un cultivo bacteriano durante la noche en BHI a una densidad de 1,5 × 10
8CFU/mL, y se inocularon 200 μL de suspensión microbiana en placas de poliestireno estériles de 6 pocillos que
contenían discos recubiertos y sin recubrir sumergidos en 4,8 mL de BHI. Las placas se incubaron a 37°C en
atmósfera aeróbica durante 24 y 48 h. La prueba se realizó por triplicado para cada cepa. Al final de la incubación,
los discos se lavaron con solución salina normal estéril y luego se trataron con DTT como se describe
anteriormente. Las células desprendidas de la biopelícula se sembraron en TSA y se incubaron a 37 °C en
atmósfera aeróbica durante 24 h para el recuento de UFC.

análisis estadístico
Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar (DE). La evaluación de la normalidad se realizó
mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Las comparaciones se realizaron mediante ANOVA de dos vías
seguido de pruebas post-hoc de Tukey. Un valor de P igual o inferior a 0,05 se utilizó como umbral para las
diferencias estadísticamente significativas.

Resultados

Evaluación de la actividad antimicrobiana

Los datos completos de MIC y MBC se muestran entabla 1 . Solo el α-TP mostró actividad antimicrobiana
contra las cepas probadas, mientras que la forma de acetato no fue efectiva en las concentraciones
probadas.PAGS. acnesparecía ser el microorganismo más susceptible a la α-TP, con valores de CIM que
oscilaban entre 0,20 y 1,60 mg/ml. valores MIC paraS.epidermisyS.aureofueron más variables (3.20–100
mg/mL y 25–100 mg/mL, respectivamente).PAGS.aeruginosafue la especie menos susceptible entre los
microorganismos probados, con valores de MIC que variaron de 100 a 200 mg/mL. También se encontró
que el α-TP es bactericida contraPAGS.acnes,S.epidermisyS.aureo, pero no contraPAGS.aeruginosa.
ExcluyendoPAGS.aeruginosa, el 53 % de los aislamientos mostró CBM iguales a las CIM, mientras que el
resto se caracterizó por CMB de 2 a 8 veces superiores a la CIM correspondiente.

Evaluación de la actividad antiadherente

Los resultados de la actividad antiadherente de los dos compuestos probados se muestran enFigura 1 .
α-T-Ac causó una disminución significativa en la adhesión deS.epidermisa los 60 min y 120 min. S.aureola
adhesión se redujo significativamente sólo después de 30 min, mientras que la capacidad dePAGS.aeruginosa
adherirse a los discos de titanio no se vio afectada por el tratamiento con α-T-Ac.
Para todas las cepas probadas, α-TP provocó una mayor disminución en la cantidad de células adheridas que
α-T-Ac. Se observaron efectos importantes contraS.epidermis, donde la adherencia fue casi total

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Tabla 1. Valores de MIC y MBC de fosfato de α-tocoferilo y acetato de α-tocoferilo.

fosfato de α-tocoferilo Acetato de α-tocoferilo Resistencia a los antibióticos convencionales

MICRÓFONO CMB MICRÓFONO CMB

S.aureo
Cepa 1 25 25 > 200 > 200 -
Cepa 2 25 25 > 200 > 200 -
cepa 3 100 100 > 200 > 200 meticilina
cepa 4 100 100 > 200 > 200 meticilina
cepa 5 100 200 > 200 > 200 meticilina,
teicoplanina (MIC = 4)
S.epidermis
Cepa 1 3.20 25 > 200 > 200 meticilina
Cepa 2 25 100 > 200 > 200 meticilina
cepa 3 50 100 > 200 > 200 meticilina
cepa 4 100 100 > 200 > 200 meticilina
cepa 5 100 100 > 200 > 200 meticilina
PAGS.aeruginosa

Cepa 1 100 > 200 > 200 > 200 Ceftazidima (MIC = 16), Ciprofloxacina (MIC 4)
Cepa 2 200 > 200 > 200 > 200 -
cepa 3 200 > 200 > 200 > 200 Ceftazidima (MIC 64), Ciprofloxacino (MIC 4)
cepa 4 200 > 200 > 200 > 200 Ceftazidima (MIC = 16), Ciprofloxacina (MIC 4)
cepa 5 200 > 200 > 200 > 200 -
PAGS.acnes

Cepa 1 0.20 0.20 > 200 > 200 -

Cepa 2 0.20 0.20 > 200 > 200 -
cepa 3 0.20 0.80 > 200 > 200 -
cepa 4 0.40 0.80 > 200 > 200 -
cepa 5 1.60 3.20 > 200 > 200 -

Los valores se expresan en mg/ml.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0182323.t001

inhibida (84-95% respecto al control), yS.aureo(60-78%). En el caso dePAGS.aeruginosa, α-TP fue capaz de
reducir la adherencia en los puntos de tiempo anteriores (7-65% de reducción).
Al comparar los dos ésteres, la forma de fosfato fue significativamente más efectiva que la de acetato
para reducir la adhesión deS.aureoen todos los puntos de tiempo. También se observaron diferencias
significativas entre las dos formulaciones paraS.epidermisa los 60 y 120 min yPAGS. aeruginosaa los 30 y
60 min.

Prevención de la formación de biopelículas

Tanto α-T-Ac como α-TP mostraron un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de biopelículas en discos de titanio alS
.epidermisyS.aureo(Figura 2 ). En particular, ambos ésteres causaron una reducción significativa de la formación
de biopelículas porS.epidermis, que fue estadísticamente significativo a las 24 y 48 h: 92-97% para α-TP y 44-70%
para α-T-Ac. Formación de biopelículas porS.aureofue inhibida a las 24 h por ambas formulaciones (100 % de
reducción frente al control para α-TP, 55 % para α-T-Ac), pero solo por α-TP a las 48 h (85 % de reducción). En el
caso dePAGS.aeruginosa, no se observó ningún efecto en el punto de tiempo anterior, mientras que la formación
de biopelículas se redujo significativamente después de 48 h solo con éster de fosfato (49 %).
Cuando se comparó la actividad inhibitoria sobre la formación de biopelículas por parte de los dos
compuestos, se observó una diferencia significativa a las 48 h para todas las cepas probadas, siendo el éster de
fosfato el más eficiente.

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Figura 1. A nti- actividadve

adhesiva de acetato de α-tocoferilo y fosfato de α-tocoferilo.Barras azules = control; acetato de
barras rojas = tocoferilo (5 mg/cm2); barras verdes = fosfato de α-tocoferilo (5 mg/cm2). Los resultados son tan medios±DAKOTA DEL
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r Alabama.una.0182323 jul y 31, 2017 6 / 12
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Fig. 2. Prevención de la formación de biopelículas por acetato de α-tocoferilo y fosfato de α-tocoferilo.Barras azules =
control; barras rojas = acetato de tocoferilo (5 mg/cm2); barras verdes = fosfato de α-tocoferilo (5 mg/cm2). Los resultados se
expresan como media±DAKOTA DEL SUR. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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PLOS ENCENDIDO mi |h ttpDakota deloi.org/10.137

Sur 1/joturnal.p o 018 232331 de julio de 2017
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Discusión
Las infecciones relacionadas con los implantes representan un problema recurrente después de las cirugías. El destino de

los biomateriales implantados puede verse como una "carrera por la superficie" entre la integración del tejido y la

formación de biopelículas.19 ]. Las fases iniciales del desarrollo de biopelículas en dispositivos biomédicos son las más

críticas, ya que una vez que se ha establecido una biopelícula en la superficie, es difícil erradicarla, porque las bacterias que

residen en la biopelícula están protegidas del sistema inmunitario del huésped y de los antibióticos. Las medidas

preventivas deben apuntar principalmente a desalentar la formación de biopelículas mediante el acabado de las

superficies del material del implante con revestimientos repelentes. Por lo tanto, en los últimos años, se ha dirigido un

gran interés a la identificación de nuevas moléculas y compuestos, compatibles con el cuerpo humano y los materiales de

los implantes, capaces de interferir con la fijación de patógenos a las superficies.20 ].

La vitamina E es un grupo de compuestos estructuralmente relacionados con actividad biológica beneficiosa

en animales y humanos. La α-T es la forma predominante de vitamina E en la mayoría de los tejidos humanos y
animales, incluido el plasma.21,22], y tiene la mayor actividad de vitamina E para animales y humanos [1 ].

Aquí probamos dos formas estables de α-T, el éster de acetato viscoso y altamente hidrofóbico y el éster de
fosfato soluble en agua, como recubrimientos para prótesis de titanio. Hasta donde sabemos, este es el primer
estudio que evalúa la actividad antimicrobiana de α-TP. En este trabajo, el α-TP mostró una buena actividad
antimicrobiana frente a todas las manchas ensayadas, aunque a concentraciones variables según la especie
microbiana. En nuestros entornos microbiológicos, esta actividad antimicrobiana siempre fue mayor en
comparación con la de α-T-Ac, por lo que se puede plantear la hipótesis de que la alta hidrofobicidad de α-T-Ac
podría limitar su solubilidad en el medio de cultivo.
En este trabajo, se evaluó la capacidad de α-TP y α-T-Ac para dificultar la adhesión bacteriana y la formación de
biopelículas por parte de los microorganismos responsables de infecciones de prótesis y articulaciones, comoS.
aureo,S.epidermisyPAGS.aeruginosa.PAGS.acneslas cepas fueron necesariamente excluidas de estas evaluaciones
porque las cepas de nuestra colección mostraron una baja eficiencia para adherirse y formar biopelículas. La
cantidad de vitamina en la superficie de los discos de titanio se eligió para obtener idealmente una concentración
subinhibitoria para todas las bacterias probadas.
La adhesión bacteriana al sustrato representa el primer paso crucial hacia la infección y generalmente ocurre
durante las primeras horas después de la invasión de los tejidos del huésped. Los dos ésteres de vitamina E, en
particular el de fosfato, han demostrado una notable capacidad antiadherente frente a las cepas ensayadas deS.
epidermisyS.aureo. Por el contrario, la capacidad dePAGS.aeruginosaadherirse a los discos de titanio solo se vio
afectado parcialmente por α-TP, mientras que α-T-Ac fue ineficaz.
La adhesión bacteriana generalmente es seguida por la producción de biopelícula para establecer la infección.
Por esta razón, evaluamos si las bacterias podían desarrollar una biopelícula madura sobre sustratos tratados con
vitaminas. La cantidad de biopelícula producida en discos recubiertos y no recubiertos se evaluó mediante el
método de conteo de CFU, como se describe en otra parte [23,24]. Dicho método permite una evaluación indirecta
de la biopelícula mediante la estimación del número de células viables incrustadas en la biopelícula. Para evaluar
la matriz del biofilm, no pudimos adoptar el ensayo colorimétrico tradicional [25 ], porque el α-TP recubierto sobre
sustratos de titanio se une fuertemente al cristal violeta, lo que interfiere con las lecturas espectrofotométricas.

Ambos recubrimientos α-T-Ac y α-TP mostraron un efecto inhibidor contra el desarrollo de biopelículas en
discos de titanio alS.epidermisyS.aureo. Como se observó en el ensayo de adhesión, también en este caso la
actividad de α-TP fue mayor que la observada para α-T-Ac. Curiosamente, el α-TP provocó una reducción en la
cantidad de estafilococos incrustados en la biopelícula de más del 90 %, por lo que se puede plantear la hipótesis
de que la tasa de células persistentes/tolerantes podría ser muy baja después del tratamiento y la posterior
producción de biopelícula por parte de estas células muy afectadas. . Evaluar si los efectos antiadhesivo y anti-
biofilm se ejercen directamente sobre la superficie de los discos de titanio o debido

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 in vitroactividad antimicrobiana del acetato de α-tocoferilo y el fosfato de α-tocoferilo

a la vitamina E disuelta en el medio, se midieron las concentraciones de α-TP y α-T-Ac en el caldo mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), en todas las condiciones ensayadas (Tabla S1 ). Ambas
formas de α-tocoferol se encontraron en cantidades muy bajas en el medio sin diferencias significativas
entre las dos formas de vitamina E, lo que significa que ambas formulaciones permanecieron absorbidas
constantemente en el sustrato y no se difundieron en el medio.
Nuestros datos confirmaron los hallazgos de trabajos previos que evaluaron las propiedades antiadhesivas de
los biomateriales que contienen α-T y α-T-Ac [6,8,10], incluso si se observaron resultados contrastantes y
diferencias intraespecies relevantes en estos estudios.
Aunque la vitamina E es conocida principalmente por sus propiedades antioxidantes y por limitar el daño de las
ROS en el tejido en proceso de curación, muchos estudios se centraron en sus capacidades inmunomoduladoras y la
estimulación de la proliferación celular que influye en la actividad transcripcional y la señalización celular.

Aunque se han reportado resultados contrastantes [3 ], se ha demostrado que α-T es capaz de estimular la
quimiotaxis de las células inmunitarias [26 ,27 ], fagocitosis [28 ], funciones inmunitarias mediadas por células T y
actividad de macrófagos [29,30], para modular la liberación de citocinas [31,32], expresión del factor de
crecimiento del tejido conectivo (CTGF) [33 ] y activación de fibroblastos [34 ]. Recientemente, se ha demostrado
que la α-TP modula las actividades celulares de manera similar o mejor que la α-T.35 ] y también se han observado
nuevas funciones como la inducción de la expresión de VEGF y un aumento de la angiogénesis in vitro [dieciséis ].
Por estas razones y porque se encontró que potencia la actividad antimicrobiana de la tigeciclina y la
daptomicina contra MRSA cuando se probóen vivoen ratones, se especuló que α-T actuaba como un potenciador
inmunológico posiblemente al modular las células NK y los leucocitos.31,36]. En el presente estudio, observamos
que α-TP muestra una mayor actividad antimicrobiana que α-T-Ac y α-T en la literatura. Es posible que las
diferencias observadas entre las formas de tocoferoles se deban a la mayor solubilidad de la forma de fosfato en
comparación con la α-T, lo que hace que la α-TP sea más adecuada para analizarse en las formas clásicas.in vitro
ensayo de microdilución. Efectivamente, Andradey otros. no pudieron determinar la MIC de α-T realizando el
mismo ensayo de microdilución. Sin embargo, la combinación de α-T con aminoglucósidos mostró una
disminución de la CMI con respecto al antibiótico solo.37 ]. Los autores sugirieron que la α-T es capaz de provocar
perturbaciones en la membrana bacteriana, alterando su fluidez y haciéndola más susceptible a la penetración de
diversas sustancias, en particular los antibióticos. Esta tesis se apoya en el trabajo de Uberosy otros., donde la
presencia de α-TP provocó una reducción de la hidrofobicidad de la superficie demi.coli, repercutiendo en la
capacidad de adherencia de la nitrocelulosa [12 ]. Estas alteraciones a nivel de membrana pueden ser
probablemente responsables de la interferencia mostrada por α-TP en la adhesión bacteriana y la formación de
biopelículas encontradas en nuestro estudio.

Conclusiones
α-TP y α-T-Ac pueden interferir significativamente con la adhesión bacteriana y prevenir la formación de
biopelículas, especialmente porS.aureoyS.epidermis, generalmente considerados los patógenos más
frecuentes responsables de infecciones de prótesis articulares. En nuestros experimentos, solo se ha visto
que el α-TP tiene un efecto antimicrobiano directo. Aunque se necesitan más estudios para investigar
mejor los mecanismos y el espectro de actividad de α-TP y α-T-Ac, estas características, junto con el efecto
positivo sobre la cicatrización de heridas y la respuesta inmunitaria, podrían convertir a estas moléculas en
candidatas prometedoras para recubrimientos. para prevenir infecciones asociadas al implante e incluso
mejorar el curso postoperatorio.

Información de soporte
Tabla S1. Concentración de fosfato de α-tocoferilo y acetato de α-tocoferilo disueltos en
el medio.α-TP = fosfato de α-tocoferilo; α-T-Ac = acetato de α-tocoferilo; ND = no detectable.

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 in vitroactividad antimicrobiana del acetato de α-tocoferilo y el fosfato de α-tocoferilo

Contribuciones de autor
Conceptualización:Lorenzo Drago.

Curación de datos:Alessandro Bidossi, Mónica Bortolin.

Análisis formal:Alessandro Bidossi, Mónica Bortolin.

Investigación:Alessandro Bidossi, Mónica Bortolin.

Metodología:Alessandro Bidossi, Monica Bortolin, Marco Toscano, Elena De Vecchi.

Administración de proyecto:Lorenzo Drago.

Recursos:Lorenzo Drago.

Supervisión:Elena De Vecchi, Lorenzo Drago.

Validación:Elena De Vecchi, Carlo L. Romanò, Roberto Mattina, Lorenzo Drago.

Visualización:Alessandro Bidossi, Mónica Bortolin. Redacción –

borrador original:Alessandro Bidossi, Mónica Bortolin.

Redacción – revisión y edición:Marco Toscano, Elena De Vecchi, Carlo L. Romanò, Roberto

Mattina, Lorenzo Drago.

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