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Deteccin de residuos de antibacterianos en carne. Tcnica del bacillus subtilis B.G.

A
Erika Gesche R.1

Introduccin
Desde hace algunos aos existe inters por la deteccin de quimioterpicos en alimentos de origen animal. Generalmente,
se trata de residuos de antibiticos, sulfonamidas y otras substancias antibacterianas conocidas genricamente como
inhibidores.
En los pases europeos, la inquietud por la deteccin de inhibidores bacterianos se basa en la necesidad de controlar el
cumplimiento de las propias disposiciones legales destinadas a evitar la presencia de residuos en los alimentos y en la
necesidad de control de alimentos importados de pases ajenos a la Comunidad Europea (Levetzow, 1980).
Los antibiticos, sulfonamidas y otros inhibidores, se emplean con xito en tratamientos teraputicos o profilcticos de
animales domsticos y tambin se ha difundido su uso como promotores del crecimiento de reses de abasto (Levetzow,
1980; Gedek und Hofmann, 1983).
Meyer, Jones et al. (1978) sealan que en Estados Unidos de N.A. prcticamente la totalidad de los animales destinados a
carne, reciben productos quimioterpicos de algn tipo, notndose una tendencia franca a aumentar a travs de los aos.
Sin desconocer las caractersticas positivas de los quimioterpicos que desde su descubrimiento han tenido una decisiva
participacin en el tratamiento de enfermedades infecciosas tanto del hombre como de los animales, se han detectado
algunos efectos negativos que parcialmente se presentan en pacientes tratados, pero ejercen esta accin en mucho mayor
grado, cuando se encuentran como residuos en los alimentos. Esta ingesta incontrolada de inhibidores ha causado graves
daos a la salud del hombre.
El paulatino aumento de bacterias resistentes a antibiticos presentes en el hombre, los animales y la naturaleza, se pueden
atribuir en gran medida al uso indebido de antibiticos en tratamientos, o como promotores del crecimiento en
alimentacin animal.
La presencia de residuos de antibiticos en ciertos alimentos, causa graves daos tecnolgicos en la elaboracin de
productos fermentados tales como yoghurt y salame, al inhibir la flora cido lctica en cuyo desarrollo se basa la
obtencin del producto. Por este concepto se producen grandes prdidas en la industria de alimentos (Meyer, Jones et al.
1978).
La alergia e hipersensibilidad de aproximadamente un 10% de la poblacin a las penicilinas, que va desde una reaccin
cutnea al shock anafilctico, se ve favorecida por la ingesta de bajas dosis de este frmaco a travs de los alimentos.
Tambin las tetraciclinas provocan problemas al absorberse y unirse firmemente al Ca de los dientes y estructuras
esquelticas, inhibiendo el desarrollo de estos rganos. El cloramfenicol es conocido por provocar una anemia aplstica y
granulocitopenia adems de afeccin heptica, neuritis ptica y el llamado 'sndrome gris' de los recin nacidos (Meyer,
Jones et al, 1978; Hapke, 1983).
Estos hechos han promovido la dictacin de normas sobre el uso de inhibidores bacterianos en animales de carne,
instaurando los 'tiempos de deplesin', vale decir fijando el lapso mnimo que debe transcurrir entre la aplicacin del
quimioterpico y la eliminacin total del frmaco del organismo (Meyer Jones et al., 1978; Levetzow, 1980). Para poder
controlar el cumplimiento de estas normas, surge la necesidad de desarrollar pruebas rpidas que permitan comprobar la
inocuidad del alimento que se destina al consumo de la poblacin.
Existe consenso sobre las bondades de las pruebas microbiolgicas, basadas en la confrontacin de una cepa sensible con
la muestra problema, como prueba cualitativa de aproximacin (screening-test). En el ao 1973, aparece en Holanda la
prueba del rin en que emplean Micrococcus luteus como cepa sensible. Al ao siguiente comienzan a probar, en
Alemania Federal, las ventajas de una cepa de Bacillus subtilis que denominaron B.G.A. Este microorganismo denota
gran sensibilidad frente a un amplio nmero de antibiticos. Surge paralelamente en varios pases europeos la inquietud de
adoptar y perfeccionar el mtodo a fin de ampliar su espectro a una detencin de niveles ms bajos de Sulfonamidas y
Cloranfenicol, que los logrados a la poca, proponiendo el sistema de las cuatro placas que adems del empleo de
Micrococcus luteus y Bacillus subtilis B.G.A. incluye una cepa sensible de E. coli y dos niveles de pH (Levetzow, 1978;
Nouws, 1981; Korkeala et al. 1982; Lindsay, 1983).

Sin embargo, considerando la conveniencia de hacer menos laborioso el mtodo, continuaron las investigaciones en torno
a Bacillus subtilis B.G.A. como cepa nica a diferentes niveles de pH, para aumentar el espectro de captacin de
antibiticos y la adicin de Trimetoprim para potenciar la accin de Sulfonamidas a fin de detectar niveles ms bajos de
estas substancias (Ebrecht, 1982; Hildebrandt et al. 1984).
En el ao 1983, Alemania Federal fij una tcnica oficial para la deteccin de antibiticos en carne
(Bundesgesundheitsamt, 1983) en que se concilian aspectos de aplicacin prctica y seguridad diagnstica y es probable
que la misma se haga extensiva en el resto de los pases de la Comunidad Europea.

Descripcin de la tcnica
1. Concepto. La deteccin de inhibidores con la tcnica aqu descrita puede dar un resultado: positivo, negativo o
sospechoso. No contempla la cuantificacin ni la identificacin de las substancias detectadas.
2. Resumen. Muestras de tejido muscular y renal se colocan sobre un medio de cultivo slido que contiene una
determinada cantidad de cultivo de una bacteria sensible a antibiticos. Los inhibidores difunden en el medio y provocan
una zona de inhibicin alrededor de las muestras. El tamao del halo es una medida del efecto inhibidor.
3. Reactivos, cepas y sensidiscos.
3.1 Medio de cultivo:
Para preparar el substrato se usa un medio de cultivo deshidratado de la siguiente composicin:
Peptona de carne
3,45 g
Peptona de casena
3,45 g
Na Cl
5,10 g
Agar
13,00 g
Agua destilada
1000,00 ml
El medio de cultivo se disuelve en agua destilada y se le agrega 0,1 % de KH2PO4. El pH se ajusta con HCI o NaOH y su
valor debe controlarse despus de autoclavel medio de cultivo.
Para preparar el medio de cultivo para la prueba de inhibidores, se mezclan 500 ml del medio lquido enfriado a 50C con
0,5 ml de una suspensin de esporas de la cepa, bajo agitacin regular. Al medio ajustado a pH 7,2 se agregan, adems,
0,5 ml de una solucin de Trimetoprim que se prepara segn 3.2. La mezcla se deposita en placas de Petri de modo que al
solidificar, se obtenga una capa de 2 mm de altura. Las placas preparadas se guardan en refrigeracin hasta el momento de
su uso. Se recomienda usar los medios dentro de 2 das posteriores a su preparacin.
3.2 Solucin de Trimetoprim (TMP):
10 mg de TMP se disuelven en 10 ml de etanol bajo agitacin y calentado a 50C (solucin madre). Esta solucin
almacenada en fro y oscuridad, dura varios meses. Agregando 190 ml de agua destilada estril, la solucin se lleva a una
concentracin de 50 mcg de TMP ml (solucin de uso). Esta solucin almacenada en refrigerador dura a lo menos 15 das.
3.3 Cepa bacteriana:
Como cepa bacteriana debe usarse Bacillus subtilis B.G.A. que se obtiene en el Instituto de Medicina Veterinaria (Robert
von Ostertag) del 'Bundesgesundheitsamt', 1.000 Berlin 33, Alemania Federal, o bien en el comercio especializado.
3.4. Suspensin de esporas:
Un medio de cultivo con la composicin descrita en 3.1 se ajusta a pH 7,0 0,2, se siembra abundantemente con la cepa
descrita en 3.3 y se incuba por 10 das a 30C. Luego se cosecha la cepa con solucin salina fisiolgica estril. Este
producto se centrifuga por 10 min. a 3.000 RPM, se desecha el sobrenadante y se agrega nuevamente solucin salina
estril al sedimento, volviendo a centrifugar en las condiciones antes sealadas. Despus de retirar el sobrenadante se
agrega solucin salina estril y se calienta la suspensin por 30 min. a 70C. Esta suspensin de esporas se ajusta a una
concentracin de 107 esporas/ml y se guarda en refrigeracin pudiendo durar varias semanas. La comprobacin de la
concentracin se realiza por recuento bacteriano en superficie empleando el mismo medio de cultivo mencionado en 3.1.
3.5 Sensidiscos:
Se emplean sensidiscos comerciales de Penicilina G. 0,01 U.I (medio a pH 6,0); Estreptomicina, 0,5 mcg (medio a pH 8,0)
y Sulfadimidina 0,5 mcg (medio a pH 7,2) con un dimetro de 6 mm.
4. Equipos y accesorios.

4.1 Sacabocados, pinza, tijera. 4.2 Lupa o microscopio estereoscpico con una instalacin para determinar el tamao del
halo. 4.3 Estufa de cultivo, + 30C.
5. Toma de muestra:
Para la deteccin de inhibidores se toman las siguientes muestras:
5.1 De un cuarto anterior o posterior en lo posible un msculo completo recubierto de fascias o como sustituto un cubo
muscular de aproximadamente 6 cm de lado.
5.2 Un rin.
Las muestras se toman con material estril y se someten de inmediato a refrigeracin. El eventual transporte para envo a
laboratorio tambin debe hacerse en ambiente fro.
6. Examen. De la musculatura y del rin se obtienen con sacabocados 3 trozos cilndricos de tejido con un dimetro de 8
mm. y una altura de 2 mm. Un trozo de cada tipo de tejido se coloca sobre el medio de cultivo a pH 6,0; pH 8,0 y pH 7,2
respectivamente (fig. 1). El material altamente contaminado es inadecuado para la deteccin de inhibidores.
Los medios de cultivo se incuban por 18-24 horas a 30C. Sobre un medio de cultivo de pH 6,0 se coloca un sensidisco de
0,01 U.I. de Penicilina G; sobre un medio a pH 8,0 un sensidisco con 0,5 mcg de Estreptomicina y en un medio con pH
7,2 un sensidisco con 0,5 mcg de Sulfadimidina. Estos medios se incuban simultneamente como controles.

Fig. 1. Sensidisco y trozos de tejidos depositados sobre el


substrato de cultivo a tres niveles de pH. M = msculo; R =
rin, p = penicilina; s = sulfadimidina; e = estreptomicina.
7. Evaluacin. Se mide el halo entre borde del tejido y lmite de crecimiento (fig. 2). En casos dudosos se recurre a la
lupa o a un microscopio.
8. Informe. Una inhibicin clara y total del crecimiento de a lo menos 2 mm, se considera positiva; una de 1-2 mm
sospechosa cuando los controles paralelos han denotado un halo de inhibicin perfecto de un tamao cercano a 6 mm. En
el informe debe sealarse el tipo de tejido y el resultado como positivo, negativo o sospechoso.

Fig. 2. Determinacin del tamao del halo de inhibicin


formado alrededor del trozo de tejido

Niveles de la tolerancia
Existen varios criterios para fijar los niveles de tolerancia de los residuos de quimioterpicos en alimentos. Uno de ellos se
basa en la determinacin del nivel de nulo efecto. Otra forma sera fijar tolerancia cero, especialmente para aquellos
productos que se emplean en terapia humana. Esta posicin que en principio puede ser la ideal, tiene por inconveniente el
hecho de que no existira tcnica capaz de detectar niveles tan bajos o iguales a cero. Por otra parte, no siempre se
justifica, puesto que existen quimioterpicos como lo son las tetraciclinas que si bien tienen la capacidad de acumularse en
el tejido seo, su presencia en msculo es muy baja adems de ser absorbida en forma incompleta a nivel de tracto
gastrointestinal (Nouws, 1981).
Los niveles de tolerancia que han sido propuestos o fijados por algunas instancias, quedan cubiertos en su mayora por la
sensibilidad de la tcnica microbiolgica del Bacillus subtilis BGA. Es por ello que Nouws (1981) sugiere fijar lmites de
tolerancia considerando la sensibilidad de esta tcnica que por sus bondades se presta para la aplicacin rutinaria.
De una sensibilidad significativamente mayor resultan las pruebas fsico-qumicas de deteccin de inhibidores de carne:
Al respecto se han descrito diversas formas de identificacin de Cloranfenicol y de Sulfonamidas, empleando de
preferencia la cromatografa en capa fina, la cromatologa de lquido de alta presin y el radioinmunoensayo (Jonas et al.
1983; Schlatterer, 1983; Petz, 1983; Arnold et al. 1984; Aghte, 1984).
Si bien como estos mtodos se pesquisan con pequeas dosis de estos inhibidores, tienen un alto costo de aplicacin,
motivo por el cual siendo muy tiles para la identificacin de los frmacos, se hace impracticable su uso en los anlisis de
rutina.

Consideraciones generales
La deteccin de residuos de antibiticos se justifica plenamente en el caso de faenamiento de animales afectados por
alguna patologa (matanza de urgencia), por las altas probabilidades que existen de haber sido tratados con
quimioterpicos.
Por otra parte, aparecen de mayor riesgo aquellos animales destinados a carne que han sido sometidos a crianza intensiva,
dado que en ellos frecuentemente se suministran quimioterpicos como promotores del crecimiento. En nuestro medio,
esta modalidad de produccin se presenta de preferencia en cerdos y aves, debido a que en bovinos y ovinos predomina el
sistema de crianza extensiva.
El criterio de decomiso frente a la presencia de residuos de antibiticos, que impera en la RFA, es el de eliminacin total
de la canal slo cuando se pesquisan halos de inhibicin en las muestras de msculo, disponindose el decomiso de los

rganos de la res, cuando el inhibidor se presenta nicamente en el tejido renal. Para el caso de aves, an no disponen de
un mtodo oficial y por ende no se han fijado los criterios de decomiso. Sin embargo parece factible aplicar la misma
tcnica, faltando por decidir sobre el tipo de tejido a obtener como muestra.
Al disponer de una tcnica de diagnstico de residuos de inhibidores en carne, se abre la posibilidad de ampliar el control
de inocuidad de los alimentos, minimizando los efectos negativos a que esto conlleva.
Una legislacin sobre el uso de antimicrobianos para diversos fines ser eficiente slo al disponer de un mecanismo que
permita controlar el cumplimiento de las normas.
Para los fines antes sealados, el mtodo microbiolgico de Bacillus subtilis BGA es una buena alternativa que concilia la
sensibilidad, con el costo y facilidad de aplicacin. Resulta, por lo tanto, ser un mtodo eficiente para aplicarlo como
control de rutina para detectar presencia o ausencia de inhibidores bacterianos.

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