Universidad del Magdalena

Laboratorio espectrofotometría

Bioquímica Grupo: 1

Presentado Por:
Natalia Uribe (2019211033)
Jesús romero
Jhonatan Alonso (2016213050)

Trabajo a presentar a:
Edith Gordon Cancio

Santa Marta / Colombia

2021-II

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 OBJETIVOS

 Adquiere destreza en el manejo de implementos de laboratorio para dicha

práctica. 
 Utiliza con eficacia materiales y espacio en el laboratorio. 
 Determinar la concentración de una solución por espectrofotometría. 
 Establecer la relación entre la absorbancia y la tramitancia con la concentración de
una solución. 

RESUMEN

La espectrofotometría se refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por

una muestra, en función de la longitud de onda. Cada componente de la solución tiene
su patrón de absorción de luz característico. Comparando la longitud de onda y la
intensidad del máximo de absorción de luz de una muestra versus soluciones standard, es
posible determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en la
muestra (solución incógnita).

Un espectrómetro típico posee cuatro componentes básicos: una fuente de radiación que

tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre un compartimiento
para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del
resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que
mide cuantitativamente la radiación que pasa por la muestra. En general,
los espectrómetros miden en % de transmitancia (T) y absorbancia (A). El porciento
de transmitancia se refiere a la cantidad de radiación que pasa a través de la muestra y
alcanza el detector. Una solución límpida, no absorbente, mostrara una lectura de 100%
de transmitancia en un espectrofotómetro calibrado. Las unidades de absorbancia van de
0 a 2. La absorbancia se relaciona con la transmitancia como

A= 2 – log T%

Palabras clave: espectrofotometría, Tramitancia y absorbancia.

ABSTRAC

Spectrophotometry refers to the measurement of relative amounts of light absorbed by a

sample, as a function of wavelength. Each component of the solution has its characteristic
light absorption pattern. By comparing the wavelength and intensity of the maximum light
absorption of a sample versus standard solutions, it is possible to determine the identity
and concentration of dissolved components in the sample (unknown solution). A typical
spectrometer has four basic components: a radiation source that has constant intensity in
the wavelength range that covers a compartment for the sample, a monochromator that
separates the desired wavelength band from the rest of the spectrum and scatters it to the
sample compartment, and a photodetector, which quantitatively measures the radiation
passing through the sample. In general, spectrometers measure in % transmittance (T)
and absorbance (A). The transmittance percentage refers to the amount of radiation that

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passes through the sample and reaches the detector. A clear, non-absorbent solution will
show a reading of 100% transmittance on a calibrated spectrophotometer. Absorbance
units range from 0 to 2. Absorbance is related to transmittance as

A= 2 – log T%

Keywords: spectrophotometry, Processing and absorbance

INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es un método de análisis que hace uso entre la materia y la energía
radiante la cual se refiere a cómo las ondas electromagnéticas se propagan y transportan
sin interferencia de materia.

La absorbancia es una medida cuantitativa útil y está relacionada con la concentración a

través de la ley de Beer-Lambert, la cual establece lo siguiente:
A = εCl

Donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda dada, ε es el coeficiente

de extinción del

Compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (M∙cm)-1, c es la concentración

molar de la especie que absorbe, y l es la longitud de paso de la celda que contiene la
solución donde se realiza la medición y está dada en cm. Así, si el coeficiente de extinción
es conocido, la absorbancia de la solución puede ser usada para calcular la concentración
de la especie en solución (asumiendo que la única especie que absorbe es el compuesto
de interés).
La explicación anterior de por qué medimos la absorbancia no explica lo que significa la
absorbancia en sí.

Los espectrofotómetros tienen entonces la habilidad de medir absorbancia a valores

específicos de longitud de onda. El método usado más comúnmente involucra un
monocromador que permite
Descomponer la luz incidente en sus componentes con diferentes longitudes de onda y de
esta forma escoger una longitud de onda a la cual una muestra dada absorbe con mayor
intensidad. La habilidad para medir la absorbancia a diferentes longitudes de onda es muy
útil porque el coeficiente de extinción varía al variar la longitud de onda. Además, el
espectro de absorbancia puede variar dependiendo de la composición química del
compuesto y el ambiente (solvente) alrededor de este.
El estudio se realizó en el laboratorio de Química orgánica y bioquímica del bloque V,
segundo piso de la CD principal de la Universidad Del Magdalena, localizada en la capital
del departamento. Santa Marta, Magdalena Dirección: Cl. 32 #22-08.

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 Imagen 1. ubicación geográfica de la
universidad (goole maps)

MATERIALES Y MÉTODOS
Para el desarrollo de este laboratorio se utilizó rojo fenol, agua destilada, HCl, papel
absorbente, tubos de ensayo, pipeteador, pipeta, gradilla, espectrofotómetro y los
implementos de bioseguridad dentro de un laboratorio. El experimento se dividió en dos
procesos, el primer procedimiento, era la detección de la mejor longitud de onda que
presentase mejor absorbancia en una solución de rojo fenol, agua y HCl. Para llevar a
cabo este proceso, se prepararon dos soluciones, una, era nuestra muestra base, esta,
contenía solamente 10ml de agua destilada y 0.1ml de HCl (de aquí en adelante, se
llamará Blanco a esta muestra); por otro lado, la segunda muestra contenía 5ml de rojo
fenol, 5ml de agua destilada y los mismos 0.1ml que el Blanco. Ambas muestras se
realizaron con ayuda de tubos de ensayo, pipeteadores y pipetas; una vez terminada y
mezclada las dos soluciones, se llevaron al espectrofotómetro, en donde se colocaron en
el lugar correspondiente y se utilizaron varias longitudes de ondas para ver cuál
presentaba la mejor Absorbancia, para esto, se midió la transmitancia que presentaba la
muestra con fenol, y, usando la ecuación de la ecuación 1 se pudo hallar la absorbancia,
una vez hallada la absorbancia que presentaba la muestra en cada longitud de onda, se
eligió la que presentaba el mayor número real y con esto, se dio paso al segundo paso.

La segunda parte del experimento consistía en realizar tres muestras, dichas muestras,
contenían diferentes concentraciones de rojo fenol, agua destilada y HCl, una vez
realizadas, se utilizó el blanco anteriormente creado y se realizó el procedimiento
anteriormente mencionado con el espectrofotómetro.

Determinación del espectro de absorción para un colorante 

RESULTADOS
Formula.1 A=2−log (%T ) %T =¿ Tramitancia A=¿Absorbancia 

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Tabla.1 valores obtenidos de la primera parte del laboratorio.
 
Longitud de onda Absorbancia Tramitancia %
λ A T
380 0,090 81,2%
400 0,122 75,4%
420 0,148 71%
440 0,153 70,3%
460 0,129 74,2%
480 0,102 78,9%
500 0,101 79,2%
520 0,055 88%

Se utilizo la formula.1 para hallar absorbancia y con esos valores realizar Grafica.1 

Grafica.1 longitud de onda vs Absorbancia.

¿Qué longitudes de ondas esperaría usted registren en este rango una

buena absorbancia tanto para el azul como para el naranja?
 
La longitud de onda que mejor se comporta es 440, dado que presenta mejor
absorbancia para naranja.

Curva de calibración para un colorante de Ley de Beer– Lambert 

 
Numero de tubo M1 M2 M3 Blanco  
s 10 5 1 0  
fenol
n
(ml)
H O
1ml 2 destilada 0 5 9 10
HCL 0,1M 0,1 0,1 0,1 0,1
(ml)
Volumen final 10,1 10,1 10,1 10,1
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Tabla.2 describe los volúmenes de las muestras con distintas concentraciones

 
λ T A
M1 440 69,3% 0,15

M2 440 84,1% 0,075

M3 440 96,2% 0,016
MP 440 77,9% 0,10

Tabla.3 Tramitancia y absorbancia de las 3 muestras más la muestra problema

Concentraciones
Formula.2=C i∗V i=C f ∗V f
M1

C i=0,0025 C f =? ( 0,0025 ) ( 10 )=C f ( 10,1 )

V i=10 ml V f =10,1ml 0,0025∗10

Cf = =0,0024 ppm
10,1
M2

C i=0,0024 C f =? ( 0,0024 )( 5 ) =C f (10,1 )

V i=5 ml V f =10,1ml 0,0024∗5

Cf = =0,00118 ppm
10,1

M3

C i=0,00118 C f =? ( 0,00118 ) ( 1 )=C f ( 10,1 )

V =1 ml V =10,1 ml 0,00118∗1
Coni la formula.2
f C f =muestra y así
se halló la concentración de cada =0,00116
obtenerppm
la grafica.2
10,1

Pá gina 6
 

Grafica.2 muestra la relación entre absorbancia y concentración.

Con esta fórmula.3 se halló la recta de la gráfica.2

y− y1 =m(x−x 1)

y se obtuvo como resultado la siguiente ecuación:

y=61,47 x +0,0025

Se obtuvieron los resultados de la muestra problema mostrado en la tabla.3 y se despejo

la x de la formula.3 para hallar la concentración esto porque esa variable es la que
representa la concentración en la gráfica.2 y como resultado se obtuvo la siguiente
grafica.

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 Y=61.47x + 0,0025

CUESTIONARIO 

1 ¿Qué es la absortividad y absortividad molar?

Absortividad: Es la cantidad de luz que ésta es capaz de absorber. También es la

relación entre su absorbancia y la concentración de la solución por la longitud de la celda
en la cual se halla dicha solución, ya que ésta es la trayectoria que la luz debe atravesar.

De acuerdo con la Ley de Beer-Lambert, la absortividad es proporcional a la

concentración del soluto absorbente.

La absortividad molar: es una propiedad química que indica cuánta luz puede absorber
una especie en solución. Este concepto es muy importante dentro de los análisis
espectroscópicos de absorción de radiación de fotones con energías en el rango de
ultravioleta y visible (Uv-vis)

El valor de la absortividad molar es directamente proporcional al grado de absorción de la

luz a una determinada longitud de onda.

2 ¿Para qué utilizaría usted la curva de calibración?

Primordialmente tenemos que tener en cuenta que las curvas de calibración se

usan para entender la respuesta instrumental a un analito y para predecir la concentración
de analito en una muestra. Una curva de calibración se crea con la primera preparación
de un conjunto de soluciones estándar con concentraciones conocidas del analito.

En conclusión, las curvas de calibración pueden utilizarse para predecir la concentración

de una muestra desconocida. Para ser totalmente exactos, las muestras estándar se
deben ejecutar en la misma matriz que la muestra desconocida. Una matriz de la muestra
es los componentes de la muestra excepto el analito de interés, incluyendo el solvente y
todas sales, proteínas, iones metálicos, etc.

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Que pueden estar presentes en la muestra. En la práctica, ejecutando las muestras de
calibración en la misma matriz que el desconocido es a veces difícil, como la muestra
desconocida se puede partir de una muestra biológica o ambiental complejo. Así, muchas
curvas de calibración se realizan en una matriz de la muestra que de cerca se aproxima a
la muestra real, como la artificial cerebral espinal líquido o artificial orina, pero puede no
ser exacta. El rango de concentraciones de la curva de calibración debe soporte en la
muestra desconocida prevista. Idealmente se miden concentraciones unas por encima y
por debajo de la muestra de concentración esperada.

3 ¿Qué limitaciones presenta la ley de Beer?

Esta ley permite establecer una relación lineal entre absorbancia y concentraciones de
una especie absorbente a una temperatura dada. La representación de absorbancia frente
a concentración es una recta que pasa por el origen. Sin embargo, se encuentran
frecuentes desviaciones con relación a la Proporcionalidad directa entre absorbancias y
concentraciones que limitan la aplicación de la ley. Las principales causas son:

 La concentración. Sólo es aplicable a disoluciones diluidas (menor 10-2 M); en

disoluciones concentradas la distancia entre partículas absorbentes es tan
pequeña que se produce una modificación en la distribución de cargas de las
mismas, lo que se traduce en una alteración en la capacidad de absorción a una
longitud de onda determinada. Este efecto se puede eliminar mediante dilución.

 La interacción entre el soluto y la radiación debida a mecanismos diferentes a la

absorción pero que producen alteraciones en la intensidad de la luz, tales como la
dispersión, reflexión, la fluorescencia, etc.

 Utilización de radiación no monocromática, puesto que la ley está definida para

radiaciones con una sola longitud de onda. Sin embargo, si la calidad del equipo
no es buena, se obtienen bandas de radiaciones con un estrecho intervalo de
longitudes de onda.

 Falta de uniformidad de la muestra o especie absorbente, o presencia de

impurezas.
 Desviaciones químicas, debidas a reacciones del absorbente con el disolvente.

4 ¿Consulte que aplicaciones de la espectrofotometría en su carrera?

La espectrofotometría1 es una técnica analítica utilizada para medir cuánta luz absorbe
una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a
través de la solución muestra, con base en la ley de Beer-Lambert. Esta medición también
puede usarse para medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.
Donde su principal objeto de uso es el espectrofotómetro.

El espectrofotómetro es un instrumento con el que se apoya la espectrofotometría para

medir la cantidad de intensidad de luz absorbida después de pasar a través de una
solución muestra.

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Un espectrofotómetro es un instrumento usado en el análisis químico que sirve para
medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud
fotométrica relativos a dos haces de radiaciones y la concentración o reacciones químicas
que se miden en una muestra. Sus aplicaciones pueden ser cualitativas y cuantitativas.
También se utiliza en laboratorios de microbiología para
la cuantificación de microorganismos.

Este puede ser de gran ayuda en las diferentes ramas de la ingeniería ya que gracias a
esto se pueden saber muchas cosas, como por ejemplo longitudes, examinación de
tejidos, saber la calidad de ciertos productos, etc.

CONCLUSIÓN

El conocer el adecuado uso del espectrofotómetro permitió obtener en el laboratorio

resultados con alta calidad analítica en las mediciones que fueron emitidas por este,
también que la absorbancia es inversamente proporcional a la Tramitancia y la
absorbancia es proporcional con la concentración como lo sustenta este informe.

WEBGRAFÍA
www.salud.gob.mx/csg/publica/pdf/medicamentos/22_soluciones.PDF
http://www.reeme.arizona.edu/materials/Liquidos%20y%20electrolitos.pdf
http://www.aeped.es/protocolos/neonatologia/alimen-parent.pdf
http://www.geocities.com/medicos76/manejoelectrolitos.html
http://www.arrakis.es/~aibarra/dietetica/Enfermeria/liquidos.htm
http://www.frlp.utn.edu.ar/materias/qcasis/mostracion2.html

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