1.

1 OBJETIVO GENERAL
Conocer las partes principales y el manejo de un Espectrofotómetro UV-Vis,
así como
verificar las condiciones del equipo.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Determinar la concentración de sustancias orgánicas en muestras
problemas por medio de una curva de calibración,
 Determinar el coeficiente de absorción de aplicando la Ley de Beer.

MARCO TEÓRICO
El análisis está basado en la Ley de Lambert – Beer que establece que la cantidad
de luz absorbida por la muestra, aumenta a medida que se incrementa la cantidad
de dicha muestra conforme es mayor el camino óptico de la radiación a través de la
misma.
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y
su aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas,
etc) y estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos
de la espectrofotometría son relativamente sencillos.
La espectrometría es una técnica analítica que se utiliza en el ensayo cualitativo y
cuantitativo de una sustancia química. En otras palabras, puede usarse en la
evaluación espectroscópica de una sustancia de muestra, es decir, para investigar
el espectro de composición de esa muestra en particular. En pocas palabras, le dice
a un químico o físico sobre los componentes reales presentes en una muestra de
prueba y también sobre la concentración de cada uno de los componentes. La
espectrometría de masas es el procedimiento espectrométrico más importante
prácticamente utilizado en un laboratorio.
La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas
absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz
absorbida depende de forma lineal de la concentración. Para hacer este tipo de
medidas se emplea un espectrofotómetro, en el que se puede seleccionar la longitud
de onda de la luz que pasa por una solución y medir la cantidad de luz absorbida
por la misma.
Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) es uno de las más populares técnicas
analíticas porque es muy versátil y capaz de detectar casi cualquier molécula. Con
espectroscopia UV-Vis, la luz de UV-Vis se pasa a través de una muestra y se mide
la transmitancia de la luz por una muestra. De la transmitancia (T), la absorbancia
se puede calcular como A =-log (T). Un espectro de absorbancia se obtiene que
muestra la absorbancia de un compuesto en diferentes longitudes de onda. La
cantidad de la absorbancia a cualquier longitud de onda es debido a la estructura
química de la molécula.
TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA
Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide
perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe
luz o cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (Ia) y
dejará pasar el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It
La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad
de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, It, y
la cantidad de luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto
por ciento: % T = It/Io x 100 La transmitancia nos da una medida física de la relación
de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T
y la concentración no es lineal, pero asume una relación logarítmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que
nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo
de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad
incidente y transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica
que la muestra no absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale
log 1 = 0. La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la
luz a través de la solución del cromóforo y de la concentración de éste
LEY DE LAMBERT-BEER
Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud
de onda fija) y concentración de un cromóforo en solución:
A = log I/Io = ε·c·l
La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –
a mayor número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también
depende de la distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración,
cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará-
; y por último, depende de ε, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extinción- que es específica de cada cromóforo. Como A es
adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l. La segunda magnitud
(l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace, siempre que sea
posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este
coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un
submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando,
por desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se
expresa en otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε
resultan ser distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se
denomina coeficiente de extinción específico (εs).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos,
ε varía con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz,
agregación de moléculas, cambios del medio, etc.
Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:
espectrofotómetro UV-visible
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos
llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los
espectrofotómetros constan, según se indica en la figura, de:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud
de onda: filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos)
que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para
medir en UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no
transmite la radiación UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en
señales eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.
DESARROLLO EXPERIMENTAL

TABLA DE DATOS EXPERIMENTALES

C(ppm) Absorbancia Transmitancia
2 0.356 44.1
4 0.687 21.0
6 0.952 11.1
8 1.622 2.4
10 1358 4.4
Muestra 1 1.135 7.3
Muestra 2 1.122 7.6
RESULTADOS (TABLAS, GRÁFICOS, CÁLCULOS O CUESTIONARIO SEGÚN
APLIQUE).

Para el cálculo de los resultados nos vamos en las ecuaciones de concentración es

la siguiente

C1V1=C2V2

Donde despejaremos la concentración C1

V1=C2V2/C1

Donde usaremos el primero parte de esta deriva es para sacar el volumen de Azul
de metileno
Después de conocer la muestra original de nuestra concentración debemos calcular
cuanto de muestra estándar de la concentración original debemos usar para el
experimento.

∗
V1 = 25mL de muestra de Azul de metileno

Donde antes usarles solo los 25mL de una muestra

Las siguientes cantidades son de concentraciones (C2) en la cuales debe hacer el

experimento 2ppM, 4 ppM, 6 ppM, 8 ppM y 10 ppM2

Con los siguientes datos se debe usar la misma ecuación anterior sustituyendo con
los datos proporcionados.
Contracciones Ecuación Muestra

∗
V1
C2= 2
V1= 0.4

C2= 4 V1
∗

V1= 0.8

C2= 6 V1
∗

V1= 1.2

C2= 8 V1
∗

V1= 1.6

C2 ∗
V1

V1= 2.0
Ya después de que sacamos los volúmenes de azul de metileno debemos usar los
matraces aforados y con lo que mezclaremos con agua destilada para después
poder realizar lo siguientes partes de la práctica

Después de mezclar agua destilada con azul de metileno debemos usar el tubo de
ensayo para poder realizar las en análisis de Absorción y de transmitancia con
equipo de laboratorio. Espectrofotómetro.

El espectrofotómetro es un instrumento que fue diseñado para medir el espectro de

transmitancia o reflectancia de un objeto. El objetivo de estos aparatos es el de
comparar la radiación para cada longitud de onda a la salida del objeto con el
incidente. La energía radiante emitida por la fuente pasa a través del sistema óptico
que conecta la fuente con el monocromador. El monocromador dispersa la radiación
y la transmite como una estrecha banda de longitudes de onda a través de la rendija
de salida que está comunicada ópticamente con la cámara de iluminación y visión
que contiene el objeto que se desea medir y, en el caso de medir reflectancia o
transmitancia, un estándar de reflectancia o transmitancia.

Donde se nos muerta que cual son los resultados de las muestras de
concentraciones y las absorciones además de la transmitancia de cada una de estas

Una vez tomado un parte de las muestras de contracciones el espectrofotómetro

tomar lecturas de la muestra no nos arrojara los datos que necesitamos.
Tomando en cuenta lo anterior la siguiente tabla son valores dado por el
espectrofotómetro

C (ppm) Absorción Transmitancia

2 0.356 44.1

4 0.687 21.0

6 0.952 11.1

8 1.622 2.4

10 1.388 4.4

Muestra 1 1.135 7.3

Muestra 2 1.122 7.6

CÁLCULO DE LAS CONCENTRACIONES DESCONOCIDAS A PARTIR DE LA
ECUACIÓN DE ABSORTIVIDAD DE LAS MUESTRAS DESCONOCIDAS

CONCENTRACIÓN TRANSMITANCIA ABSORBANCIA

7.3 1.135
7.6 1.122

Fórmula de la absortividad

A=a*b*c

a=A/b*c

0.356 0.687 0.952

= = 0.178 = = 0.3435 = = 0.476
1(2) 1(4) 1(6)

1.222 1.358
= = 0.611 = = 0.679
1(8) 1(10)

0.178 + 0.3435 + 0.476 + 0.611 + 0.679

= = 0.4575
5

CONCENTRACIÓN DE DOS MUESTRAS DESCONOCIDAS

1.135
= = 2.48087431694
1(0.4575)

1.122
= = 2.45245901639
1(0.4575)
La siguiente grafica te ayuda a distinguir como es que aumenta la absorbancia con
respecto a a la concentración de un compuesto que es de forma lineal.

CURVA DE CALIBRACIÓN DE AZUL DE METILENO

1.6
1.4
1.2
ABSORBANCIA

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 2 4 6 8 10 12
CONCENTRACIÓN

CONCLUSIONES

La gran mayoría de los compuestos, naturales o sintéticos se encuentran puros o

no todos tiene una particulada que se pueden analizar en su resonancia magnética
nuclear, en este caso Azul de metileno

En esta práctica tendremos del manejo de un instrumento de medición que es el

espectrofotómetro. Desde un inicio todo comienza fácil donde sabremos que el uso
de materiales ya conocidos como son el Matraz Aforado, pipetas graduadas etc.
Donde está la dificultas es poder calcular con exactitud las cantidades de muestras
de nuestro analito y su disolvente.

Sin embargo, la práctica fue un éxito desde en puntos de vista que para manejar
algo no peligro y saber cómo usar estos materiales.

Al final de cuenta es que la practica tuvo sus objetivos de manejo que la muestra de
nuestro componente y el uso adecuado de nuestros materiales y del equipo.
BIBLIOGRAFÍA
 Nieves Abril Díaz1 , J. Antonio Bárcena Ruiz1 , Emilio Fernández Reyes1 ,
Aurora Galván Cejudo1 , Jesús Jorrín Novo1 , José Peinado Peinado1 ,
Fermín Toribio Meléndez-Valdés1 , Isaac Túnez Fiñana2 . (2012).
Espectrometria. 13/06/2021, de Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular, 1 Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa,
14071-Córdoba, 2 Facultad de Medicina, Avda. Menéndez Pidal s/n, 14004-
Córdoba. Sitio web: https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf
 Skoog,D..A.,& West, D.M.(2015).Fundamentos de la Química Analitica.
México, D.F:CENGAGE Learning.
 Daniel Hernandez (2020, 11 junio). Espectrometría; mecanismo, tipos y usos.
Expectrometros. https://espectrometria.com.mx/espectrometria-mecanismo-
tipos-y-usos/