GENÉTICA GENERAL

INTRODUCCIÓN
REPLICACIÓN
PARTE I: REPLICACIÓN PROCARIOTAS

Fabio Vazquez
IBT-Departamento Biología
Departamento Ingeniería Agronómica
GENÉTICA: POSICIÓN DENTRO DE LA CIENCIAS BIOLÓGICAS
Algunas
Relaciones
Interdisciplinares

Citología, Fisiología, Bioquímica, Botánica, Zoología, Medicina, Agrotecnia, Zootecnia

•Genética Molecular
•Genética del Desarrollo
¿Definición?:
Estudio
Ciencia que estudia el
•Citogenética material
material hereditario bajo genético en sí
•Genética Bioquímica
cualquier nivel o
•Genética de Poblaciones
dimensión
•Genética Evolutiva Estudio de la
expresión del
material
Genética de Organismos:
genético
Virus
Estudio del destino del
Bacterias
material genético en el
Hongos tiempo y el espacio
Humana
Escherichia coli (MODELO PROCARIONTE)

Fagos (virus bacterianos)

Ciclo de Vida
Saccharomyces cerevisiae
Caenorhabditis elegans (gusano
nemátodo)
Drosophila melanogaster

Mus musculus
(ratón domestico)
Pisum sativum
Arabidopsis thaliana
- Es un verdadero diploide con
un ciclo de vida muy corto (6-8
sem), fecundación autógama, y
produce numerosas semillas

- Compacto genoma con escasas

secuencias repetidas y un bajo
contenido en DNA (≈ 70 Mpb por
núcleo haploide, 25 veces el
tamaño del genoma de E. coli): la
planta superior de genoma más
pequeño conocido →un sistema
ideal para estudios genéticos y
moleculares.

- Puede ser transformada

por Agrobacterium tumefaciens y
mediante el plásmido Ti es posible
introducir genes de interés y
mantenerlos de forma estable
Términos
para
acordar
en
Genética
DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
REPLICACIÓN

UNA ESTRUCTURA
TAN BONITA
TENÍA, POR
FUERZA, QUE
EXISTIR

J. WATSON
12
Estructura DNA
25 de Abril 1953

It has not escaped our notice that the specific pairing

we have postulated immediately suggests a possible
copying mechanism for the genetic material.

Tema 6: Estructura y replicación del

14
material genético
Posibles modelos de replicación
Experimento
de Meselson y
Sthal

Técnica analítica de
centrifugación en
gradiente de cloruro de
cesio.

Este compuesto permite

separar las moléculas de
ADN con
densidades de flotación muy
cercanas. Se obtiene
diferencias de
densidad leves cuando el
ADN se enriquece con
átomos del
isótopo estable y pesado del
nitrógeno: 15N en vez de con
el isótopo más común 14N
Replicación DNA
 Replicación ADN

Requerimientos para Replicación

DNA:

1- Planilla o molde
2- Mg2+
3- Los 4 desoxirribonucleótidos
(A, C, T, G)
4- Enzima: DNA polimerasa
 Para la replicación del ADN,
Enzimas se necesita una maquinaria
enzimática

• ADN polimerasas: desempeñan funciones de replicación y

reparación

• En procariotas:
Polimerasas I Reparación y asistencia en replicación
Polimerasas II Reparación
Polimerasa III Replicación (+++)

En eucariotas:
ADN polimarasa alfa: Síntesis de ADN nuclear, y participa en
la reparación del ADN
ADN polimerasa delta: Síntesis de ADN nuclear, actividad
correctora
ADN polimerasa gamma: Síntesis de ADN mitocondrial
ADN polimerasa epsilon: Participa en la reparación del ADN,
actividad correctora
ADN polimerasa beta: Participa en la reparación del ADN
Todas las ADN
polimerasas añaden un
desoxirribonucleósido
5´-trifosfato al grupo
3´hidroxilo de una
cadena de ADN
creciente (hebra
cebadora)
Las ADN polimerasas :
Catalizan la elongación de las cadenas
de ADN usando como sustratos
nucleótidos trifosfato, se forma un
enlace fosfodiéster y a medida que se
incorporan a la cadena recién
formada, liberan 2 grupos fosfatos
terminales
Las características de la proteína que da lugar a al polimerización,
llamada ADN polimerasa, son las siguientes:

1) Esta proteína requiere la presencia de una matriz de cadena

simple que ella copia según la regla de complementariedad
clásica.

2) Requiere la presencia de una fragmento (de ADN o de ARN) ya

asociado a la matriz mediante puentes de hidrógeno; este cebo
presenta un extremo 3`OH libre, nivel en el cual se inicia la
replicación.

3) Tiene como sustratos exclusivos los cuatro dNTP que aportan la

energía necesaria para la reacción de enlace en forma de
enlaces ricos en fosfodiésteres,

4) La enzima polimeriza una cadena de nucleótidos a partir del

pedazo inicial (cebador) únicamente en el sentido 5’ 3’,
porque los nuevos nucleótidos se unen siempre sobre el grupo
3’OH libre del último nucleótido que entra; de este modo, se
trata de un proceso orientado
 Replicación DNA: OTRAS ENZIMAS

Topoisomerasas: rompen en forma reversible las cadenas de ADN.

Topoisomerasa I: rompe solo una cadena de ADN
Topoisomerasa II:. rompe en forma simultánea ambas cadenas

Helicasas: desenrollan las 2 cadenas de ADN y se ubican en la cabeza de la

horquilla de replicación

Primasas: sintetizan los iniciadores de ARN que se necesitan para iniciar la

replicación

Ligasas: cataliza la formación de enlaces covalentes entre los fragmentos de

Okazaki en la síntesis de la cadena de ADN retrasada, y entre los
segmentos viejos y nuevos formados durante la reparación del ADN

Proteinas de unión al ADN monocatenario: estabilizan la cadena molde de

ADN desenrrollada manteniéndola en un estado de cadena única para ser
copiada por la polimerasas
 Topoisomerasa
• Enzimas capaces de actuar sobre la topología del ADN, ya
sea enredándolo para permitir que se almacene de manera
más compacta o desenredándolo para que controle la
síntesis de proteínas y para facilitar la replicación del
mismo. Son necesarias debido a los inherentes problemas
causados por la configuración estructural del ADN
 Helicasa
• Enzima vital en los seres vivos ya que participa en los
procesos de transcripción, recombinación,
reparación del ADN, y de biogénesis de ribosomas. Su
misión es romper los puentes de hidrógeno que unen
las bases nitrogenadas, haciendo así posible que otras
enzimas puedan copiar la secuencia de la hebra molde
•
Las polimerasas ¿Por qué no hay una
enzima que polimerice en
conocidas añaden la dirección 3´-> 5?
nucleótidos No funcionaría la corrección
solamente en la de errores por falta de un
trifosfato que suministre la
dirección 5’ → 3’ energía de enlace covalente
azúcar-fosfato
Propiedades de las DNA polimerasas procariotas
 Polimerasa I de Escherichia coli

Copia 5’ 3’(solo agrega bases

en el extremo – OH)

Repara

Corrige errores mediante actividad

exonucleasa 3’→5’

Polimerasa II de E. Coli

Similar en estructura a polimerasa I, pero sin

actividad exonucleasa
Estructura
La pol I puede digerirse mediante proteasa en un fragmento pequeño
de 36 kd con la actividad exonucleasa 5’ → 3’ original y un fragmento
grande de 67 Kd (fragmento Klenow) que conserva la actividad
polimerasa y la actividad exonucleasa 3’ → 5’.
 Polimerasa III de E. coli

Copia 5’ 3’

8 ≥ 10 Subunidades
8 Todas importantes

Importante:

• Replicación  la coordinación de mas de 20 enzimas

• De hecho, la P III sintetiza la mayoría del DNA

• P I borra el primer y llena espacios vacíos

• P II → corrigiendo daños causados por agentes físicos

El holoenzima DNA plimerasa III

Este complejo multienzimático se caracteriza por una elevada

progresividad, efectividad catalítica y fidelidad. El holoenzima está
formado por 10 cadenas polipeptídicas diferentes
Arquitectura propuesta para la DNA polimerasa III
Coordinación en la síntesis
de la hebra guía y la hebra
retardada del ADN
Coordinación en la
síntesis de la hebra guía
y la hebra retardada de
ADN
PINZAS Y CARGADORES DE PINZA: PROCESIVIDAD
La replicación del DNA es un proceso
muy eficaz. E coli replica la totalidad de
su cromosoma en 40 minutos, con sólo
dos horquillas de replicación →dos
moléculas de DNA polimerasa III
Para que se complete el ciclo de
replicación, la DNA polimerasa
debe permanecer unida a su
molde, es decir, debe actuar con
procesividad

La pinza β es la proteína accesoria de la polimerasa directamente responsable de

potenciar la procesividad y el complejo γ como el cargador de la pinza en E. coli

En eucariótas, una proteína con varias subunidades, denominada factor

C de replicación o RF-C, es el cargador de la pinza; y la PCNA, o
antígeno nuclear de proliferación celular, es la pinza deslizante
Proteínas en el origen de replicación de Escherichia coli
Enzimas en la horquilla de replicación de Escherichia coli
Iniciación de la
Replicación en
E. coli
DNA helicasa
La separación de las dos
cadenas del cromosoma de E.
coli es mediada por el producto
del “locus” dnaB (la forma
funcional es un hexámero),
una helicasa esencial para la
replicación del DNA.

Las helicasas son

una clase de enzimas capaces
de desplazarse a lo largo de un
DNA duplex utilizando la
energía de
hidrólisis del ATP para separar
las cadenas.

La dnaB se mueve a lo largo de

una monocadena de DNA a la que
está unida en dirección hacia su
extremo 3’ libre. Su actuación es
procesiva
Proteínas de unión al DNA de
cadena sencilla (SSB) MODELO T4
Las proteínas de unión al DNA
de cadena sencilla son
esenciales en la replicación,
reparación y
recombinación del DNA,
debido a su capacidad para
mantener el molde en la
conformación óptima
para la desnaturalización y
renaturalización del DNA

En E. coli se une también cooperativamente

al DNA de cadena sencilla, pero
por un mecanismo diferente al de T4: DNA se
enrolla alrededor de la proteína SSB
tetramérica. La proteína se une de maneras
diferentes según participe en la replicación,
la reparación o larecombinación.
El funcionamiento biológico normal del DNA sólo se produce si éste se
encuentra en el estado topológico correcto. El superenrollamiento del
DNA está controlado por un grupo de enzimas conocidos como
topoisomerasas. Se denominan así porque alteran el estado
topológico ,número de enlace, del DNA circular

Existen dos clases de topoisomerasas:

topoisomerasas tipo I y topoisomerasas tipo II
La ligasa acopla la hidrólisis de un ATP para hacer
más favorable la reacción de unión entre el fosfato y el
hidroxilo libre, liberando al final un AMP.
Esquema simplificado replicación
Mecanismo
Replicación
Separación Cromosoma E. coli I
Separación
Cromosoma
E. coli II
 GENÉTICA GENERAL

INTRODUCCIÓN
REPLICACIÓN
PARTE I: REPLICACIÓN PROCARIOTAS

Fabio Vazquez
IBT-Departamento Biología
Departamento Ingeniería Agronómica