celulares

Un cultivo celular es el conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos
pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Existen tres tipos:
A) Cultivo de órganos. Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo
artificial y una atmosfera controlada.
• En estos cultivos (de ganglios, fragmentos hepáticos, piel, médula ósea…), los distintos tipos celulares tienen un
tiempo limitado de vida, así como su estructura histológica y arquitectura.
• Estos cultivos no pueden propagarse, ya que la mayor parte de los tipos celulares no proliferan; únicamente se
produce crecimiento de algunas células indiferenciadas o embrionarias de la zona periférica, que no conservan la
estructura tisular típica del órgano.
• Se usan para estudiar relaciones intercelulares, respuestas a estímulos y sustancias, estudios regenerativos…
B) Cultivo de explantes. Consiste en adherir un fragmento de tejido (vellosidades coriónicas, tejido epitelial…) a una
superficie (placa o tubo) y nutrirlo con un medio de cultivo. En estas condiciones, las células periféricas se multiplican
y proliferan, migrando por la superficie del soporte.
C) Cultivo de células. Se realiza a partir de suspensiones celulares que se introducen en un recipiente adecuado
junto con un medio de cultivo y se incuban en las condiciones óptimas de crecimiento. Las células pueden ser de
cualquier tejido, restos ovulares, líquido amniótico, sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre… Según
la procedencia de la suspensión celular de partida, os cultivos de células pueden ser:
• Cultivo celular primario. La suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células de un tejido.
• Cultivo celular secundario. La suspensión celular de partida se obtiene a partir de otro cultivo, mediante un pase;
también se puede obtener a partir de una línea celular mantenida en congelación.

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones:

A) Investigación básica. Permiten estudiar cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular (ciclo celular,
diferenciación, flujos intracelulares…) y las interacciones celulares (entre células, matriz extracelular y medioambiente).
B) Investigación aplicada. Son una importante herramienta biotecnológica con importantes aplicaciones industriales:
para la producción de anticuerpos monoclonales (inmunología), vacunas (virología) y fármacos (farmacología) y para
estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis (toxicología).
C) Últimas tendencias. Se usa en la ingeniería de tejidos (cultivos histotípicos y organotípicos) para su uso en injertos
y trasplantes; y en estudios con células madre enfocados a la terapia celular.

La curva de crecimiento representa la dinámica de crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células/día.

Tiene forma de curve sigmoide en la que se diferencian tres fases:
9
CURVA DE CRECIMIENTO EN CRECIMIENTO EN confluencia
DÍAS
CRECIMIENTO MONOCAPA SUSPENSION 8
Adaptación al medio de
Fase de adhesión a una 7
0-1 cultivo y a las condiciones
latencia. superficie.
de cultivo. 6
Fase de
Proliferación y 5
1-7 crecimiento Proliferación.
formación de colonias.
exponencial.
4
Inhibición por contacto. Inhibición por densidad
Fase
7-… Las células se parecen (poco medio y 3
estacionaria.
más a las originales. nutrientes).
2
El crecimiento en monocapa consiste en que las células (dependientes de
1
anclaje) crecen adheridas sobre una superficie sólida.
El crecimiento en suspensión consiste en que las células crecen dispersas en el 0
seno del medio de cultivo. Este tipo de células (sanguíneas, células madre, 0 5 10
turorales…) no necesitan pegarse a una superficie para crecer.
Al terminar la fase exponencial, se hace un pase para que el crecimiento se reanude. Los sucesivos pases a partir del
cultivo primario dan origen a:
A) Línea celular primaria. Se obtiene a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario. Se mantiene en
cultivo mediante pases seriados durante un tiempo limitado.
• La población celular aumenta en cada pase y, normalmente, a partir del tercer pase se estabiliza, es decir, las
células se hacen uniformes y homogéneas, manteniéndose las características morfológicas y fisiológicas estables
durante las sucesivas generaciones.
• Cuando el cultivo primario se realiza a partir de una mezcla celular compleja, el tipo celular con mayor tasa de
crecimiento acaba desplazando a los demás.
• A partir de un numero característico de pases (20-100) las líneas celulares primarias entran en fase de senescencia,
una etapa vital en la que pierden su capacidad de dividirse y el cultivo acaba muriendo. Es debido a que, con las
sucesivas divisiones, los telómeros se acortan y las células van acumulando anomalías genéticas y perdiendo
funciones. Para conservar la línea celular, se congelan las células anotando el número de pase del que procede.
B) Línea celular continua. Se obtiene a partir de un cultivo primario. Se mantiene en cultivo mediante pases seriados
por un tiempo ilimitado. Aparecen espontáneamente debido a la aparición de células inmortales, capaces de originar
líneas estables y permanentes. También se puede inducir
con métodos físicos (irradiación), químicos (productos
carcinogénicos) o biológicos (virus, transfección de ADN).
Estas células surgen tras un fenómeno de trasformación de
las células normales, relacionado con la pérdida del
mecanismo de control celular; cumplen una serie de
características:
• Crecen indefinidamente en cultivo.
• Pierden la depende del anclaje para crecer, por lo que
pueden crecer en suspension.
• Pierden la inhibición por contacto.
• Pueden invadir tejidos y producir tumores.
• Acumulan anomalias géneticas: normalmente son
aneuploides, con mltiples aberraciones cromosomicas.

Para que el cultivo se desarrolle adecuadamente es necesario controlar una serie de factores o condiciones.

Se deben tener en cuenta tres aspectos relativos a los recipientes:

MATERIAL O SUSTRATO
El material con el que se fabrican los recipientes debe permitir la adhesión de las células, ser fácilmente esterilizable y
tener una mínima calidad óptica para poder visualizar el cultivo con un microscopio invertido.
• Vidrio. Es reutilizable, fácil de esterilizar (autoclave) y tiene muy buena calidad óptica.
• Plástico desechable. No es reutilizable (menor riesgo de contaminación), es fácil de esterilizar (irradiación) y tiene
buena calidad óptica. Destaca por su bajo coste y permite el ahorro de personal y tiempo de trabajo.
• Matrices tridimensionales. Se consiguen con materiales que forman estructuras tridimensionales porosas (geles de
colágeno o esponjas de celulosa). Se utilizan para cultivar células que se introducen en su interior y crecen organizándose
de manera más parecida a como lo hacen en su tejido de procedencia.
• Microesferas de sephadex, poliacrilamida o plástico desechable. Las células crecen adheridas a estas
microesferas, que se mantienen en suspensión en el seno de cultivo; así, se cultivan células dependientes de anclaje
como si fuera un cultivo en suspensión, aumentándose notablemente la superficie de crecimiento.
• Metales. Se pueden utilizar sustratos metálicos específicos de paladio o acero para algunas aplicaciones muy concretas,
como el cultivo de células de la glía.
DISEÑO O FORMA
El parámetro más importante que caracteriza cada tipo de recipiente es la superficie útil de cultivo (para calcular la
cantidad de células a sembrar y a recoger). Entre los más habituales están:
A) Placas multipocillo.
• Entre 6-96 pocillos (8-53 mm Ø) de fondo plano.
• Tapa no hermética.
• Superficie de cultivo: 0,5-10cm2.
• Se usa en experimentos puntuales simultáneos con distintas líneas celulares o diferentes
condiciones de cultivo.
• Mala estanqueidad y mayor riesgo de contaminación (no se aconsejan para el mantenimiento de líneas celulares).
• Un tipo especial es la placa Transwell, dotada con cámaras individuales que encajan en los pocillos y cuyo fondo
consiste en una membrana porosa. Cuando se encajan las cámaras, el conjunto presenta un compartimiento
inferior y otro superior separados por la membrana porosa, donde crecen las células. Son especialmente útiles para
el cultivo de células epiteliales polarizadas y para estudios de migración e invasión.
B) Placa de Petri. Placas de cultivo circulares con tapa. Miden 3,5-10 cm de diámetro (10-78 cm2).
C) Frascos o botellas Roux.
• Frascos planos con tapón de rosa.
• Se caracterizan por su superficie de crecimiento (25-75 cm2 normalmente,
aunque hay hasta de 225 cm2).
• Son idóneos para el mantenimiento de líneas celulares (monocapa y en
suspensión).
• Se pueden realizar cultivos cerrados o abiertos (enroscando parcialmente el tapón) para permitir el intercambio
gaseoso, al tiempo que se previene la contaminación. Otros llevan una membrana en el tapón (cultivos ventilados
cerrándolo completamente).
• Un tipo especial es aquel en el que la superficie de crecimiento es un portaobjetos. Una vez finalizado el cultivo, se
retira el medio de cultivo y el resto del frasco se despega del portaobjetos.
D) Botellas para incubadores tipo roller. Son botellas cilíndricas, de distintos tamaños (con una gran superficie de
crecimiento).
A) Tratamiento de las superficies. Para mejorar la adhesión, estas se pueden tratar con proteínas de la matriz
extracelular como colágeno, laminina, fibronectina, vitronectina… Y algunas sintéticas como la gelatina o la polilisa. El
tratamiento puede hacerse antes del cultivo con una solución estéril de la proteína o añadiéndola al medio de cultivo.

Los medios de cultivo son medios nutritivos que sustituyen al medio natural en el que se encuentra la célula
fisiologicamente. Deben aportarla nutrientes y otros tipos de sustancias, generar unas condiciones microambientales
adecuadas y permitir acumular temporalmente productos de desecho.
COMPOSICIÓN
La composicion basica de los medios de cultivo celular incluye:
• Sales minerales. Es la base del medio de cultivo: en la solucion salina se disuelven el resto de componentes. Las sales
que forman parte habitual de los medios de cultivo son los cloruros (NaCl, KCl, CaCl, MgCl2), fosfatos sodicos (NaxPO4)
y bicarbonato de sodio ([NaHCO3] es especialmente imporante por su papel como tampón).
• Tampón. Destaca el bicarbonato y el tampón HEPES (10-20 mM); este ultimo
proporciona mayor capacidad de tamponamienton cuando el cultivo celular H+ + HCO3- ↔ H2CO3 ↔ H2O + CO2
requiere largos epriodos de manipulacion fuera de una incubadura de CO2. HCO3- + Na+ ↔ NaHCO3
• Indicador de pH. El más utilizado es el rojo fenol. Como desventaja, imita la
accion de algunas hormonas esteroideas e interfiere en la citometria de flujo, 6,5 7,0 7,4 7,8
por lo que en estudios de tejido mamario se utilizan otros indicadores.
• Glucosa. Es la fuente de energía, ya sea como componente único o juntos con otros glúcidos.
• Aminoácidos. Como mínimo lo aminoacidos esenciales: fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
treotina, triptófano y valina. Tmabién pueden incluir arginia, cisteina y tirosina.
• Vitaminas. La composicion en vitaminas depende de la concentracion de suero que se utilice y del tipo celular. Destacan
las vitaminas del grupo B que estimulan el crecimiento.
• Suplementos organicos de bajo peso molecular. Se encuentran en el suero y son ácidos grasos esenciales y otros
lipidos, nucleosidos, piruvatos…
• Hormonas y factores de crecimiento. Su proporción es muy dificil de estandarizar, por lo que en la mayor parte
(cultivos no definidos) se añade el cultivo con suero animal (normalmente un 10%).
• Suero. El suero es una mezcla compleja de diferentes elementos, proporciona nutrientes, minerales, oligoelementos,
vitaminas liposolubles (A,D,E y K), factores de crecimiento y hormonas, proteinas de unión (albumina, transferrina),
factores de extensión, fibronectina y inhibidores de proteasas. Existen dos tipos fundamentales (además del humano y
del equino):
× Suero de ternera. Según estudios de inhibicion por contacto, promueve
SUERO DESCOPLEMENTADO
menos el crecimiento. Los medios normales suelen contener 2-10% de
Para evitar la lisis celular
suero.
× Suero fetal bovino (SFB). Es una fuente rica en factores de crecimiento • Descongelar suero comercial en
por lo que se usa en experimentos de clonacion celular y crecimiento de un baño a 37ºC.
celulas mas delicadas. • Aumentar la temperatura a 65ºC
Además, el suero aumenta la viscosidad del medio (protege las células del durante 45’.
daño mecanico durante la agitación de cultivos en suspensión) y actua como • Enfriar.
buffer, manteniendo el pH. • Alicuotar (15-50ml).
• Congelar a 20ºC.
Pese a ello, tiene una serie de desventajas, como la falta de uniformidad de
• Descongelar alícuota para
su composición y que requiere una evaluación de calidad de cada lote previo
complementar el medio.
a su uso; también aumenta el riesgo de contaminación y su presencia puede
interferir con la purificación y el aislamiento de productos del cultivo celular.
 MEDIOS DE CULTIVO NO DEFINIDOS
Medio Medio RPMI 1640
basal de minimo Medio MEM modificado (roswell Park
Medio F-10 de Ham
Eagle esencial de por Dulbeco (DMEM) Memorial
(BME) Eagle (MEM) Institute)
fibroblastos Muy utilizado cél. primarias de ratón y Linfoblastos, cél. Cél. humanas, incluidas las
de ratón en una amplia pollo y hibridomas (células Linfoides células amnióticas. También
gama de líneas tumorales de mieloma + estimuladas y cél. cél. diploides y leucocitos
célulares de linfocitos B = anticuerpos leucémicas para analisis cromosomal.
mamiferos monoclonales)
aa esenciales más aa y [aa]x4 y vitaminas Suplementos Hierro y oligoelementos
mayor [aa] específicos

CARACTERISTICAS FISICOQUÍMICAS
En el medio de cultivo hay que controlar:
• pH. El pH óptimo para la mayoria de celulas es de 7,4 (rango 7,2-7,6).
• Osmolaridad. Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramenrte hipotónicos respecto de las células.
• Viscosidad. La viscosidad no es un parametro que limite el crecimiento celular, de hecho, la viscosidad debe ser
ligeramente elevada para que ejerza un efecto protector durante la tripsinizacion y la agitación del cultivo. Cuando se
usan medios sin suero, se pueden usar sustancias inertes que aumenten la viscosidad, como carboximetil-celulosa,
polivinilpirrolidona (PVP).
• Tensión superficial. Debe ser baja para eviar espuma. Unicamente surgen problemas cuando se burbujea CO 2 en
cultivos en suspensión; se añade entoces antiespumantes.

La atmosfera gaseosa es la mezcla de gases (O2 y CO2) y se controla con el incubador de CO2. El oxígeno, por su parte,
es necesario para todas las células, pero con su concentración atmosférica es suficiente; si bien es cierto que algunos
cultivos de órganos, con mala difusión, requieren una concentración del 95%. El dióxido de carbono, en cambio, se
encuentra disuelto en el medio en equilibrio con el ion bicarbonato, por lo que los niveles de CO2 influyen en el pH cuando
el medio está taponado con un tapón bicarbonato; la concentración recomendada es entre 2 y 8%.

El incubador controla la temperatura, que influye en la tasa de crecimiento celular, por lo que la recomendada es la
fisiológica (37ºC para mamíferos y 28ºC para insectos); y la humedad, que debe de ser suficientemente elevada para
evitar la evaporación del medio (lo que aumentaría la [componentes] y la osmolaridad, y produciría cambios en el pH).
Los incubadores tienen dispositivos que inyectan agua estéril para conseguir humedades del 95%.

En cada paso se deben mantener las condiciones de asepsia y esterilidad.

Cuando se quieren cultivar células de un tejido, se debe obtener el tipo celular en cuestión en suspensión, para lo que es
necesario separar las células entre sí y de la matriz.
MÉTODOS DE DISGREGACIÓN CELULAR
Aunque lo normal es una combinación de ambos, la disgregación puede hacerse por dos métodos distintos:
A) Métodos mecánicos. Se basan en cortar, picar e incluso triturar fragmentos de tejido colocados en una placa de
Petri con tapón o medio de cultivo, para filtrar los restos de tejido y obtener las células disgregadas. Destaca el cribado
de células, una técnica en la que se pican los trozos de tejido y se colocan sobre una criba de nailon o metálica (filtro
de 40, 70, 100µm), se aplasta suavemente y la criba se acopla a un tubo falcon o se coloca sobre una placa de Petri;
finalmente se lava con tapón o medio de cultivo. Las células desprendidas pasan al tubo o placa.
B) Métodos enzimáticos. Se basan en el tratamiento del tejido con enzimas proteolíticas que digieren las proteínas
de la matriz extracelular, liberando así las células englobadas en ella. Destacan la tripsina, la colagenasa, la
hialuronidasa (disuelve proteoglicanos), ADNasas (disuelven agregados de ADN de células dañadas), la dispasa, la
papaína, la elastasa y la pronasa... Todas ellas se pueden combinar con EDTA que retira los cationes de Ca2+ que
estabilizan las uniones entre las proteínas de matriz y las células. En el caso de que se vayan a combinar varias enzimas,
primero se echa la tripsina y el EDTA y luego el resto.
SELECCIÓN DE CÉLULAS
Tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla de células en suspensión que se puede utilizar directamente para
iniciar un cultivo primario. Otras veces en cambio interesa seleccionar un tipo celular concreto para cultivarlo, se basa en
las propiedades específicas de las células y en métodos inmunológicos.
A) Propiedades específicas. Se pueden separar células por su tamaño, centrifugándolas; y según su capacidad de
adherencia a sustratos naturales, como el colágeno, o artificiales, como la lana de vidrio o el plástico. La suspensión
celular se hace pasar por columnas o filtros con estos sustratos, de manera que las células de interés quedan retenidas
en ellos; posteriormente se eluyen con un tampón adecuado que disminuya la adhesión.
B) Métodos inmunológicos. Se basan en el uso de anticuerpos específicos anclados a un soporte sólido que reconocen
las células de interés. Hay varias posibilidades:
• Recubrir pocillos de una placa multipocillos con el anticuerpo específico para incubar en ellos la mezcla de células,
de manera que las células de interés quedan retenidas y el resto se eliminan mediante lavados.
• Recubrir esferas de material inerte e introducirlas en la suspensión, de
manera que las células de interés quedan retenidas sobre la superficie de las
esferas. La solución se filtra después para eliminar el resto de células.
• Recubrir esferas magnéticas e introducirlas en la suspensión, de manera que
las células de interés quedan ancladas a las esferas magnéticas por la acción
de un imán y el resto se eliminan con lavados.
Las células se separan del soporte variando el pH o digiriendo los Ac con enzimas.

Partiendo de una suspensión celular obtenida por disgregación directa, selección o descongelación, el cultivo se inicia
sembrando un número determinado de células. Lo primero es elegir el tipo de recipiente, y por consiguiente establecer
el número de células que a sembrar. Para ello se hace un recuento de células viables y se calcula el volumen de suspensión
necesario. Dicho volumen se transfiere a un tubo falcon y se lava con medio de cultivo completo precalentado a
37ºC. El resultante es diluido con el volumen adecuado de medio de cultivo completo e introducido en el recipiente de
cultivo, que se introduce en un incubador.

RECUENTO Y VIABILIDAD CELULAR

Para conocer la densidad celular, para lo que es necesario
diluir las células con un colorante vital y contarlas con una
cámara de recuento.
• El colorante vital, normalmente el azul tripán, permite
distinguir las células vivas de las muertas, ya que solo
penetra en el interior de las células que tienen la
membrana rota.
• El contaje consiste en el proceso de recuento de las
células blancas y azules y se lleva a cabo en la cámara de
contaje celular o hemocitómetro (cámara de Neubauer).
Está fabricada en vidrio óptico especial de precisión y
tiene un puente central (en el que tiene grabadas redes
de conteo) y puentes exteriores rectificados planos y
pulidos.

PROTOCOLO DE CONTAJE
• Homogeneizar la suspensión por inversión del tubo.
• Diluir una alícuota (20µl) al 50% con una disolución de azul tripán al 0,4% en PBS. Si la densidad celular es muy
elevada, se puede hacer una dilución previa en PBS 1:10 hasta 1:100.
• Montar la cámara de Neubauer, colocando el cubrecámaras encima (queda a 0,1mm de la cámara).
• Cargar 10µl en cada cámara. El volumen de suspensión situado encima de un cuadrado de esquina es de:
1mm.1mm.0,1mm=0,1mm3.
• Se deja reposar unos minutos para que las células sedimenten.
• Se cuentan, observándolas al microscopio, las células presentes en las cuatro esquinas.

El mantenimiento de los cultivos consiste en procedimientos (control microscópico, cambio de medio y pases) para el
control de su viabilidad y crecimiento.
A) Control microscópico. Con periodicidad variable (1-3 días), los cultivos se examinan con un microscopio
invertido para observar la apariencia y el crecimiento de las células. Como medida de precaución al sacar el cultivo
de la incubadora, es importante cerrar el recipiente para evitar contaminaciones (especialmente en los frascos de Roux
sin membrana cuyos tapones estén ligeramente desenroscados). Para evitar el estrés celular, el proceso debe ser
rápido.
B) Cambio de medio. Cada dos o tres días, se cambia el medio de cultivo para renovar los nutrientes consumidos y
retirar los productos de desecho generados por el metabolismo celular. En caso de un viraje del indicador de pH
también se debe cambiar el medio. El cambio de medio es parcial y se deja 1/3 del volumen, ya que así se mantienen
algunas de las sustancias beneficiosas producidas por las células y secretadas al exterior. En los cultivos en monocapa,
el medio viejo se retira con una pipeta; mientras que, en los cultivos en suspensión, se centrifuga a 700 o 800
rpm y se retira el sobrenadante.
C) Subcultivo o pase. Al finalizar la fase exponencial del crecimiento, a los 6-7 días, cuando se llega a la confluencia
(en cultivos en monocapa) o a la densidad critica (en cultivos en suspensión), se hace un pase.
• En cultivos en suspensión, en primer lugar, se hace un recuento de células viables y con ello se calcula el factor
de dilución necesario para que la densidad celular sea óptima para reiniciar el cultivo (cada pase se hace en un
recipiente mayor que el anterior).
• En cultivos en monocapa, para hacer el pase es necesario despegar las células del recipiente; esto se puede hacer
por método mecánicos, con rascadores, pero lo que más se utiliza son métodos enzimáticos, añadiendo una solución
de tripsina/EDTA que disgrega las proteínas sintetizadas por las células que las unen al recipiente

Las líneas celulares continuas o inmortales se pueden mantener en el tiempo mediante pases seriados. Sin embargo, esta
estrategia consume recursos y tiempo, por lo que lo habitual para su conservación, es la congelación. Para llevarla a
cabo se procede de forma similar a como se realiza un pase: se obtiene la suspensión celular, se lava con medio de cultivo
(después de centrifuga y se elimina el sobrenadante) y se hace un recuento de viables para añadir un volumen adecuado
de suero animal con un 10% de DMSO; la densidad celular final óptima es alrededor de 106 células/ml. Esta
suspensión se alícuota en criotubos de 1ml y se congela de forma progresiva: se mantienen -20ºC durante 24h,
después a -80ºC durante otras 24h, y finalmente se llevan al tanque de nitrógeno líquido.
Para descongelar las células, necesario para empezar cultivos secundarios a partir de líneas celulares mantenidas a -
80ºC, se trabaja en una cabina de flujo laminar.
• El vial congelado se incuba en un baño a 37º y se limpia la superficie externa del vial con EtOH al 70% para evitar
contaminaciones.
• Se transfiere el contenido del vial a un tubo falcon de 15ml y se añaden 10 ml del medio de cultivo completo
(precalentar a 37º).
• Se centrifuga (4-5 min a 700-800 rpm) para eliminar el sobrenadante que contiene el medio de cultivo y el DMSO (el
agente crioprotector tóxico para las células vivas).
• Por último, se añaden 4-5 ml de medio de cultivo completo nuevo.

Uno de los mayores riesgos de alteración del cultivo celular son las contaminaciones, es decir, la presencia de
microorganismos no deseados (bacterias, levaduras, hongos, micoplasmas y virus) omnipresentes en el ambiente. Por ello
es importante trabajar en condiciones de asepsia y esterilidad.
A) Bacterias, levaduras y hongos. Como su tasa de crecimiento es mucho mayor a la de las células del cultivo, acaban
produciendo la muerte celular. Las contaminaciones por estos microorganismos se deben a una mala praxis o a que
se encuentran en el ambiente. En caso de cultivos cortos, suelen contaminarse por bacterias y levaduras; en el caso
de cultivos largos, por hongos. El uso de antibióticos y antifúngicos en los medios de cultivo, a veces no es suficiente,
por lo que es fundamental:
• Trabajar siempre en condiciones estrictas de asepsia y en cabinas de bioseguridad tipo II.
• Limpiar la superficie externa de recipientes y viales con EtOH 70%, especialmente en el caso de recipientes que se
han incubado en un baño termostático.
• Tener especial cuidado durante la manipulación del cultivo fuera de la cabina y evitarlo en la medida de lo posible.
• Cuando se trabaja con incubadores sin control de humedad, que tienen bandejas con agua en el suelo, esta debe
cambiarse regularmente desinfectando también las bandejas.
En el caso de que se descubra un cultivo contaminado, se debe separar del resto y eliminar esterilizándolo.
B) Micoplasmas. Son microorganismos procariotas sin pared celular que pueden infectar los cultivos y producir su
muerte o una alteración en el crecimiento de las células. En muchas ocasiones la contaminación procede de las propias
líneas celulares continuas, que se suministran ya contaminadas, o de los sueros animales. Su detección es difícil,
pero la observación de gránulos oscuros en el citoplasma de las células puede hacer sospechar la contaminación;
para confirmarlo se pueden teñir con orceína o DAPI (marcador fluorescente) o realizar una PCR. Para evitar que la
contaminación por micoplasmas se extienda, lo mejor es eliminar y esterilizar el cultivo, pero, en algunos casos se
puede intentar conservarlo tratándolo con antibióticos (kanamicina o quinolonas) o con suero inmune.
C) Virus. Aunque es infrecuente, las contaminaciones por virus con muy graves. La fuente de contaminación viral son
los sueros animales. La detección se basa en la observación del afecto citopático (los virus destruyen las células),
característico de cada virus. Ante la sospecha, se elimina el cultivo y se esteriliza mediante irradiación.