Ut 2 cultivos

celulares
Se puede definir el cultivo celular como el conjunto de
procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de
organismos pluricelulares, tejidos u órganos in vitro, preservando al
máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y genéticas,
creciendo en un medio artificial.

El laboratorio en el que tiene lugar la propagación o crecimiento de

células de organismos pluricelulares en medios de cultivo artificiales
y en condiciones controladas es el laboratorio de cultivos celulares
TIPOS DE CULTIVOS CELULARES

Según la definición de cultivos celulares,

se pueden diferenciar 3 tipos de
cultivos:

Cultivo de órganos
Cultivo de explantes
Cultivo de células
VAMOS A
CONOCER MÁS
SOBRE ELLOS
Cultivo de órganos
El cultivo de órganos consiste en mantener un órgano
entero o parte de él en la interfase entre un medio de
cultivo artificial y una atmósfera controlada.
En estos cultivos se mantienen los diferentes tipos
celulares presentes en el órgano, así como la estructura
histológica y la arquitectura del mismo durante un
tiempo limitado

Estos tipos celulares no proliferan, tan solo se produce el crecimiento de algunos tipos
celulares indiferenciados, presentes fundamentalmente en la zona periférica que no
conserva la estructura tisular propia del órgano.

Se utilizan para el estudio de las relaciones intercelulares y

respuestas a estímulos y sustancias
Cultivo de explantes
Un explante es una pequeña porción de tejido
u órgano que se adhiere a una superficie y en
el que, generalmente, crecen las células de la
periferia.
El fragmento de tejido se adhiere a un frasco
de cultivo o placa petri y se nutre con medio
de cultivo. En estas condiciones, las células de Tejido vivo separado de su
órgano propio y transferido a un
la periferia se multiplican y proliferan, medio artificial de crecimiento
ocupando toda la superficie del soporte.

Es útil en pequeñas muestras de tejido ( pe. Biopsias de piel)

Cultivo de células
El cultivo de células se realizar a partir de suspensiones celulares, que se
introducen en un recipiente adecuado junto con un medio de cultivo que les
proporciona los nutrientes y condiciones de vida necesarias y se incuban en las
condiciones óptimas para que las células proliferen
El cultivo de células es el tipo de cultivo más habitual y se realiza a partir de muestras de
cualquier tipo de tejido, líquido amniótico, sangre periférica, células hematopoyéticas,
células madre…
Las células que forman parte del cultivo celular son aquellas capaces de superar el proceso
de disgregación, adherirse al sustrato y proliferar en monocapa o en suspensión .
En todo tejido existe una fracción de células que es capaz de crecer en suspensión; se cree
que estas son células madre.
Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células pueden ser
primarios o secundarios:
• Cultivo celular primario: la suspensión celular para el cultivo se obtiene disgregando las células
de un tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta forma se obtiene una mezcla celular
compleja, formada por los distintos tipos celulares presentes en el tejido.
El cultivo primario se puede realizar a partir de esta mezcla o seleccionando un tipo celular
concreto.
• Cultivo celular secundario: la suspensión celular se obtiene a partir de un cultivo primario o de
otro secundario, mediante un subcultivo o pase. También se pueden obtener a partir de una
línea celular mantenida en congelación. En cualquier caso, este cultivo proviene de una fase
previa de crecimiento in vitro.
Los cultivos celulares nos permiten aumentar la masa celular del tejido que queremos estudiar. Un
claro inconveniente es que, si partimos de masas celulares heterogéneas, esta heterogeneidad se
puede perder debido a la uniformidad de la población de células debido a que las poblaciones
predominantes manifiesten mayor tasa de crecimiento.
Las células se multiplican en el medio de cultivo. Cuando el recipiente de cultivo se llena de
células es el momento de hacer un subcultivo
Las líneas celulares obtenidas a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario se
denominan líneas celulares primarias

Una línea celular cumple ciertas características:

- Aumenta el número de células obtenidas. A partir del 3er pase se estabiliza.

- Predomina 1 o dos tipos celulares con mayor tasa de crecimiento
- La población celular se hace uniforme y homogénea
- Sus características se conservan durante las sucesivas generaciones

La gran mayoría de células de los vertebrados dejan de dividirse después de un número de

divisiones en un medio de cultivo esto se conoce como senescencia celular (envejecimiento
celular)

¿a qué es debido? ¿cómo puede evitarse ?

LA SENESCENCIA CELULAR
ES DEBIDA AL
ACORTAMIENTO
PROGRESIVO DE LOS
TELÓMEROS EN CADA
DIVISIÓN CELULAR
https://www.fitnessrevolucionario.com/2017/06/1
0/telomeros-que-son-y-como-alargarlos/

Información complementaria extra:

Explicación telómeros y telomerasa (no web
Científica)

Telomerasa . Enzima de las células que les ayuda a mantenerse vivas al agregar
ADN a los telómeros (extremos de los cromosomas). Cada vez que una célula
se multiplica, los telómeros pierden una cantidad pequeña de ADN y se acortan.
Con el transcurso del tiempo, los cromosomas se dañan y las células mueren.
La telomerasa ayuda a evitar que esto ocurra. Habitualmente, las células
cancerosas tienen más telomerasa que la mayoría de las células normales.
 SE PUEDE EVITAR INCORPORANDO EL GEN
DE LA TELOMERASA DE FORMA ACTIVA. DE
MODO QUE REPARE LA PERDIDA DE LOS
TELÓMEROS QUE SE PRODUCE EN CADA
DIVISIÓN. (deforma fisiológica se encuentra
inactivo en las células somáticas) ASI LAS
CELULAS PODRÁN PROLIFERAR DE FORMA
INDEFINIDA. ESTO SE PUEDE HACER EN
ALGUNAS CELULAS SOMATICAS
SI NO SE PUEDE AÑADIR, SE PUEDEN
UTILIZAR ONCOGENES PARA INACTIVAR LOS
PUNTOS DE CONTROL.
Comportamiento vital tras sucesivos pases ( repetimos)
Las líneas celulares obtenidas a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario
se denominan líneas celulares primarias. Estos cultivos se mantienen mediante pases
seriados durante un tiempo limitado. La población celular aumenta en cada pase y
normalmente a partir del tercer pase se estabiliza. Esto significa que las población de
células se hace uniforme y homogénea, manteniendo las características morfológicas y
fisiológicas en generaciones posteriores.
Por tanto a partir de un cultivo primario podemos obtener: Cultivo primario

- Las líneas celulares secundarias o

subcultivos
- Las líneas celulares continuas
Línea celular primaria o
subcultivo o cultivo Línea celular continua
secundario
-Las líneas celulares primarias tienen una vida finita, se mantienen en crecimiento durante un
número determinado de generaciones o pases, que será característico de cada tipo celular.
Pasado este tiempo entra en fase de senescencia, una etapa donde las células van perdiendo
la capacidad de dividirse y el cultivo acaba muriendo. Esto es debido a que con las sucesivas
divisiones los telómeros se acortan y las células van acumulando anomalías genéticas y
perdiendo funciones. Por este motivo es muy importante anotar el número de pases que se
han realizado a cada cultivo.
-Las líneas celulares continuas aparecen espontáneamente en algunos cultivos y se
mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases seriados.
Esto se debe a la aparición de células “inmortales” que tienen la capacidad de originar líneas
estables y permanentes como consecuencia de un fenómeno de transformación celular,
relacionado con la perdida de los mecanismos de control celular.
Líneas celulares continuas
Estas células tienen unas características especiales:
o Crecen indefinidamente en cultivo (son inmortales)
o Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden crecer en
suspensión.
o Pierden la inhibición por contacto.
o Pueden invadir tejidos y producir tumores.
o Acumulan anomalías genéticas. Normalmente son aneuploides (Número anormal de
cromosomas).
La aparición de estas líneas celulares continuas se puede inducir por:
• Métodos físicos: irradiación del cultivo.
• Métodos químicos: tratamiento con productos químicos carcinogénicos.
• Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN, …
POR LO TANTO

Tenemos 3 tipos de cultivos celulares:

• Primario : iniciados a partir de células, tejidos u órganos obtenidos
directamente del organismo
• Cultivo secundario : se origina a partir de un cultivo primario (Cultivo
celular que tiene alta capacidad de multiplicarse in vitro, establecido a
partir del primer subcultivo de un cultivo primario y que tiene las
mismas características que el tejido de origen.)
• Línea celular continua: “células inmortales.”

Para obtener un cultivo primario: se aísla el tejido de interés. Se realiza

disección mecánica o enzimática, se realiza una suspensión, se siembra

Para mantener líneas celulares: se realiza un pasaje para crear el

subcultivo o bien se congelan (criopreservación)
 APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES

Los cultivos celulares tienen múltiples aplicaciones, tanto en investigación básica, como en
investigación aplicada.
En investigación básica permiten estudiar:
• Cualquier aspecto relacionado con el metabolismo celular: ciclo celular, rutas metabólicas, flujos
intracelulares, diferenciación, transformación, etc.
• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular, con el medio ambiente.

En investigación aplicada:
• Inmunología, para producción de anticuerpos monoclonales.
• Virología, para producción de vacunas.
• Farmacología, para producción de fármacos.
• Toxicología, para estudios de citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis.
Dos aplicaciones relativamente modernas y muy interesantes son:
• La ingeniería de tejidos que pretende conseguir la producción in vitro de tejidos (cultivos
histotípicos o de un solo tipo celular) y órganos (cultivos organotípicos o de varios tipos
celulares) funcionales para su uso en injertos y trasplantes.
¿qué se está
• Estudios con células madre o stem celIs, enfocados a la terapia celular. haciendo en la
actualidad?
En la actualidad, el foco está puesto en la terapia celular y la medicina regenerativa.
➢ La terapia celular consiste en la introducción de células madre, ocasionalmente
modificadas, para la reparación de tejidos dañados o la restitución de procesos biológicos
que han resultado dañados por la enfermedad. Por ejemplo: células productoras de insulina en pacientes
diabéticos.
➢ La medicina regenerativa pretende conseguir tejidos y órganos in vitro para su uso en
injertos y trasplantes. Por ejemplo: cartílago artificial con propiedades mecánicas similares al tejido natural para
su uso en prótesis de rodilla.
 CURVA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO
Una curva de crecimiento es la representación gráfica de la dinámica de
crecimiento de un cultivo, es decir, la concentración de células por los días de
evolución del cultivo.
La curva de crecimiento presenta una forma sigmoidea, en forma de S, en la
que diferenciamos 4 fases:
En un cultivo celular podrían distinguirse cuatro etapas o fases:
1. Fase de latencia (período lag). Se define como El período de fijación al
sustrato e inicio del ciclo celular.
2. Fase de crecimiento exponencial. Durante esta fase el número de células se
duplica aproximadamente cada 24 horas.
3. Fase de confluencia o estacionaria. Esta fase ocurre cuando las células del
cultivo, que se ha saturado, dejan de dividirse (monocapa: inhibición por
contacto; suspensión: inhibición por densidad). Es un tramo recto de
pendiente nula. Se produce a partir de los 6-7 días de evolución del cultivo. Es
la fase en la que el número de células permanece constante.
4. Fase de muerte. Cuando el cultivo se prolonga durante demasiado tiempo,
las células entran en una fase de senescencia que termina con la muerte de las
células en cultivo
CURVA DE
CRECIMIENTO DEL
CULTIVO

• En la fase de confluencia los

cultivos expresan sus aspectos
mas característicos.
• Por ello, antes de la fase en la
que el cultivo llega a la fase de
confluencia, es el momento
adecuado para realizar el
subcultivo o pase, al final de la
fase exponencial.
 FORMAS DE CRECIMIENTO DE CULTIVOS CELULARES PRIMARIOS

➢ Crecimiento en monocapa
El crecimiento en monocapa consiste en que las células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico o vidrio).
Este tipo de células se dice que son dependientes de anclaje, es decir, necesitan adherirse a una superficie sólida para
poder crecer. Es el método utilizado para el cultivo de la mayoría de las células ( excepto las hematopoyéticas). En el
crecimiento en monocapa se pueden distinguir diferentes momentos o etapas de desarrollo:
1. Adhesión a una superficie. Corresponde al periodo durante el cual las células se van adhiriendo al soporte. Coincide con
el periodo de latencia de la curva de crecimiento.
2. Proliferación y formación de colonias. Una vez que las células se han pegado a la pared del frasco de cultivo, empiezan
a proliferar, expandiéndose por toda la superficie y formando colonias celulares. Esta etapa de crecimiento se corresponde
con la fase exponencial de la curva de crecimiento.
3. Inhibición por contacto. Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la superficie disponible y entran en
confluencia, estableciendo contactos entre ellas. En este momento se produce un fenómeno denominado inhibición por
contacto y las células detienen su crecimiento, aunque se mantienen vivas.

Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o «pase» de parte de las células a un nuevo frasco de cultivo.
El momento idóneo para realizarlo es el final de la fase exponencial.
 Cultivo de HeLa en superficie Células de cultivo de fibroblastos en conflluencia

Un tipo celular será mas fácil de cultivar cuanto mas indiferenciadas sean sus células.
Es decir, cuanto mayor sea la capacidad de dividirse y diferenciarse en otras células
➢ Crecimiento en suspensión:
En el crecimiento en suspensión las células no necesitan adherirse a una superficie para
crecer, por lo que se mantienen dispersas y proliferando en la totalidad del cultivo. Este tipo
de crecimiento es el típico de las células sanguíneas circulantes, células hematopoyéticas,
células madre y algunas líneas tumorales.
En el crecimiento en suspensión también distinguimos diferentes momentos o etapas de
desarrollo:
• Adaptación al medio de cultivo: Es un período relativamente corto, en el que las células se adaptan a las
condiciones de cultivo, antes de iniciar la proliferación. Corresponde con la fase de latencia de la curva de
crecimiento.
• Proliferación en suspensión: En el momento las células se han adaptado, comienzan a proliferar dispersas en
el medio de cultivo. Corresponde con la fase de crecimiento exponencial.
• Inhibición por densidad: Se alcanza cuando el cultivo llega a un número crítico de células en relación con el
volumen de medio de cultivo y los nutrientes disponibles. En ese punto se produce el fenómeno de inhibición
por densidad y las células dejan de crecer y dividirse, pero siguen vivas.
Al igual que ocurre en los cultivos en monocapa, es necesario hacer un pase para que el crecimiento se reanude
 Células HeLa

Las células del tumor de Henrietta

Lacks se habían vuelto inmortales.
En el medio adecuado, eran
capaces de crecer y dividirse sin
límites, sin morir por apoptosis
El hecho de que las células HeLa
sean inmortales implica que
podrán seguir creciendo y
Podría decirse que ya no siguen las mismas
dividiéndose indefinidamente.
reglas que el resto de células. Las células HeLa
Esto ocurre porque las células
en concreto poseen unos 80 cromosomas en
HeLa tienen una
comparación con los 46 que tiene una célula
enzima telomerasa extremadam
normal, y muchos de estos 80 cromosomas
ente activa, que va
presentan numerosas mutaciones.
reconstruyendo los telómeros
después de cada división

Se obtienen de una muestra recién obtenida
100% cariotipo original
Formado por células indiferenciadas que se
diferenciarán de forma similar al tejido que
le dio origen
Su duración es aprox. 7 días.
1 solo pasaje
CONTINUAS
Provienen de un Cultivo Primario que ha sido
cometido a procesos que le conferirán
capacidad ilimitada de multiplicación o
tienen origen tumoral
Aneuploides
Están formadas por células que se
diferencian genética y morfológicamente de
las células de las cuales se originaron
Proliferan de forma ilimitada
Varios pasajes
 FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL CULTIVO
El cultivo de células implica extraerlas de su entorno tisular fisiológico, introducirlas en el
interior de un recipiente adecuado que las aísla del exterior, inmersas o bañadas por un
medio de cultivo artificial y, finalmente, colocar este conjunto en el interior de un
incubador que proporciona unas condiciones ambientales adecuadas.

Los factores que influencian el cultivo son:

• El soporte físico en el que van a crecer las células.

• La composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo.
• La atmósfera gaseosa.
• Las condiciones de incubación
➢Materiales para cultivo

El material con que se fabrican recipientes destinados a cultivos celulares debe permitir:
la adhesión de las células, ser fácilmente esterilizable y tener una mínima calidad
óptica para poder visualizar el cultivo con un microscopio invertido. Los más utilizados
son el vidrio y los plásticos, pero hay otros materiales para situaciones particulares:

Vidrio. Es reutilizable, fácil de limpiar y de esterilizar por calor en autoclave.

Además, tiene muy buena calidad óptica para observaciones microscópicas.

Plástico desechable. Actualmente es el material más utilizado por su bajo

coste, su facilidad de esterilización por irradiación y su buena calidad óptica,
además de por el ahorro de personal y tiempo de trabajo que supone no
tener que reutilizarlo. Además, al reducirse el número de tareas y
manipulaciones, es menor el riesgo de contaminación.
Matrices tridimensionales. Se consiguen con materiales que forman estructuras
tridimensionales porosas como los geles de colágeno o las esponjas de celulosa,
recubiertas o no por colágeno. Se utilizan para cultivar algunos tipos celulares que se
introducen en el interior de la red tridimensional y crecen organizándose de manera más
parecida a como lo hacen en su tejido de procedencia.

Microesferas de sephadex o poliacrilamida. Las células pueden crecer adheridas a estas

microesferas, que se mantienen en suspensión en el seno del medio de cultivo. De esta
manera se cultivan células dependientes de anclaje como si fuese un cultivo en
suspensión, aumentándose notablemente la superficie de crecimiento disponible. Las
microesferas pueden fabricarse también con plástico desechable.

Metales. Para algunas aplicaciones muy concretas, como el cultivo de células de la glía,
se pueden utilizar sustratos metálicos específicos de paladio o acero.
Obtenido de
https://prezi.com
/upn9hmt6aj8o/
publicaciones-
relacionadas-a-
cultivos-3d/

Enlace
complementario
➢ Características y tipos de recipientes de cultivo:
Actualmente hay una amplia variedad de recipientes para cultivo. El
parámetro más importante es la superficie útil de cultivo, porque es en base
a este se calcula la cantidad de células que se siembran y se estima la
confluencia.
Placas multipocillo: son placas con un número variable de pocillos (entre 6 y
96), con fondo normalmente plano, cubiertas por una tapa no hermética.
Son útiles para realizar experimentos puntuales simultáneos, con diferentes
líneas celulares o diferentes condiciones de cultivo. No se aconsejan para el
mantenimiento de las líneas, no son estancas y existe riesgo de
contaminación.
Placas de Petri: son las placas clásicas de cultivo, circulares y con tapa.
Tienen la misma utilidad y las mismas limitaciones que las placas
multipocillo.
Frascos o botellas Roux: son frascos planos con tapón de rosca,
disponibles en muchos tamaños.
Sirven tanto para cultivo en monocapa como en suspensión.
El tapón de estos frascos puede tener una membrana que posibilita
el intercambio de gases. Si el tapón no dispone de esta membrana,
se debe desenroscar un poco para que el cultivo pueda realizar el
intercambio de gases durante la incubación, aunque esto suponga
un riesgo de contaminación

Botellas para incubadores de tipo roller: Son botellas cilíndricas

que se incuban sobre rodillos. EL cultivo crece sobre las paredes
interiores de estas botellas, logrando una gran superficie de
cultivo.
VIDEO ROLLER https://www.youtube.com/watch?v=CYCLHkXWrnA
Composición del medio de cultivo

Un medio de cultivo es una solución o un gel que contiene los nutrientes

necesarios para permitir en condiciones favorables de pH y temperatura,
el crecimiento de las células.
Los medios de cultivo sustituyen al medio natural en el que se encuentra
la célula fisiológicamente, por tanto deben aportar todos los nutrientes y
sustancias que la célula necesita para su mantenimiento como organismo
vivo.
Así mismo deben generar las condiciones de pH y osmolaridad adecuadas
y permitir la acumulación temporal de productos de desecho sin que
estas condiciones se vean alteradas significativamente
 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Medios naturales. Consisten básicamente en fluidos naturales, que se caracterizan por su
gran adecuación para el cultivo de células, pero por el contrario son difícilmente
reproducibles por carecer de la información exacta de su composición
Medios artificiales o sintéticos. Son con diferencia los más utilizados y se preparan
agregando nutrientes, tanto orgánicos como inorgánicos: Vitaminas, sales, proteínas,
hidratos de carbono etc. Los medios de cultivo sintéticos se clasifican en cuatro grandes
grupos:
• Medios complementados con suero. El suero fetal bovino (FBS Fetal Bovine Serum) es uno de los complementos
más utilizados por su bajo coste. Aporta hormonas y factores de crecimiento
• Medios libres de suero. La presencia de FBS puede llevar a malinterpretaciones en estudios inmunológicos. Por ello
se fabrican medios libres de suero complementados con factores de crecimiento y proteínas.
• Medios químicamente definidos. En la línea de los medios libres de suero, se manufacturan medios con
ingredientes orgánicos e inorgánicos ultrapuros libres de contaminación. Su composición está totalmente definida,
como dice su nombre.
• Medios libres de proteínas. No contienen ningún componente proteico y comparado con los sueros
complementados con FBS promueven un crecimiento celular y expresión proteica superior.
La composición de los medios de cultivo depende de los requerimientos de las diferentes
líneas celulares
La composición básica de los medios de cultivo celular incluye los siguientes elementos:
Sales minerales. La base de un medio de cultivo es una solución salina equilibrada en la que
se disuelven el resto de los componentes. Entre las sales minerales que forman parte
habitual de los medios de cultivo están el cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico,
cloruro magnésico, fosfatos sódicos y bicarbonato sódico.
La concentración de bicarbonato sódico es especialmente importante por su papel en la
regulación del pH en conjunción con la concentración de CO2 ambiental.
Tampón. El medio de cultivo tiene que estar tamponado, puesto que las células son muy
sensibles a los cambios de pH. El tampón más utilizado ha sido el bicarbonato, sin embargo,
en la actualidad se aconseja el uso del tampón HEPES en concentraciones 10-20 mM,
debido a su gran poder tamponador en el rango de pH óptimo para el crecimiento celular
(7,2-7,6).
¿Qué quiere decir tamponar?
Glucosa. La glucosa se incluye en los medios de cultivo como fuente de
energía, como componente único o junto con otros hidratos de
carbono.
Aminoácidos. El medio de cultivo debe contener, como mínimo, todos
los aminoácidos esenciales. Se puede suplementar además con otros
aminoácidos, dependiendo de las necesidades de las células que se
quiere cultivar.
Vitaminas. La composición en vitaminas varía mucho de un medio a
otro y va a depender de la concentración de suero que se utilice. Las
vitaminas son necesarias porque influyen en la tasa de crecimiento y
en la supervivencia de las células.
Suplementos orgánicos de bajo peso molecular. En esta categoría se incluyen ácidos grasos
esenciales y otros lípidos, nucleósidos, piruvatos, etc.
Indicador de pH. Dado que el pH del medio es un parámetro fundamental para la supervivencia
del cultivo, en la composición del medio se incluye un indicador de pH que registre cambios
mínimos en el rango de pH óptimo para el crecimiento. El más utilizado es el rojo fenol, que es
púrpura a pH 7,8, rojo a pH 7,4, naranja a pH 7,0 y amarillo a pH 6,5.
Hormonas y factores de crecimiento. Esta categoría incluye multitud de componentes esenciales
para el crecimiento de las células pero cuya proporción en el medio de cultivo es muy difícil de
estandarizar. Por ello, la mayor parte de los medios de cultivo básicos, conocidos como medios no
definidos, solucionan este problema suplementando el cultivo con suero animal en proporción
variable (2%-50%, siendo lo más habitual 10%).
Además de hormonas y factores de crecimiento, el suero animal aporta también proteínas como
la transferrina, hierro, oligoelementos (cobre, selenio), factores de adhesión, inhibidores de
proteasas, etc.
Los más usados son el suero de ternera y el suero bovino fetal para todo tipo de cultivos y el suero
humano para cultivar líneas celulares humanas.
Antibióticos y antifúngicos. La suplementación del medio de cultivo con
antibióticos y antifúngicos es esencial para prevenir la contaminación por
bacterias, levaduras y hongos. Se pueden utilizar solos o en combinación,
pero hay que controlar muy bien la concentración final para evitar dañar las
células.
Los antibióticos más utilizados son:
• Gentamicina a una concentración de 50 μg/ml.
• Combinación de penicilina/estreptomicina a concentraciones de 100 U/ml
y 100 μg/ml, respectivamente.
El antifúngico más utilizado es la anfotericina B a una concentración de 2-5
μg/ml.
 RESUMIENDO

El medio de cultivo debe contener:

• Sales minerales- Bicarbonato de sodio

• Tampón - HEPES
• Glucosa- fuente de energía
• Aminoácidos- los esenciales como mínimo
• Vitaminas-influyen en tasa de crecim. Y supervivencia
• Suplementos orgánicos de bajo peso molecular- Ac. g
• Indicador del pH- fundamental
• Hormonas - esenciales
• Antibióticos y antifúngicos – Gentamicina,
penicilina-estreptomicina, Anfotericina B
Características fisicoquímicas del medio de cultivo
pH. Las células en cultivo suelen crecer en un margen de pH relativamente estrecho. El pH óptimo para la
mayoría de las células es de 7,4 (rango 7,2-7,6), aunque algunos tipos concretos pueden crecer mejor a otros
pH. Como ya se ha mencionado, el pH del medio se fija con tampones y se controla con un indicador de pH,
de manera que un cambio en el color del medio producido por un viraje del indicador en un cultivo en
crecimiento sería razón suficiente para cambiar el medio de cultivo.
Osmolaridad. Los medios de cultivo deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto de las células
que se cultivan . En general, las células en cultivo toleran valores de osmolaridad en el rango de 260-320
mOsm/kg.
Viscosidad. La viscosidad no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de las células. Depende
principalmente de la concentración de suero que se use. Una viscosidad ligeramente elevada tiene efecto
protector durante la tripsinización y agitación del cultivo. Cuando se usan medios libres de suero, se pueden
añadir sustancias inertes que aumentan ligeramente la viscosidad, como la carboximetilcelulosa o la
polivinilpirrolidona.
Tensión superficial. La tensión superficial debe mantenerse baja y no suele ser problema en los cultivos
tradicionales. Únicamente en ciertos cultivos especiales en suspensión en los que se burbujea CO2 puede
producirse espuma en el cultivo. Para evitarlo se añaden agentes antiespumantes.
La atmósfera gaseosa es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos; sus dos componentes
más importantes son el oxígeno y el CO2.
Los componentes de la atmósfera del cultivo son controlados y suministrados por el incubador.
Oxígeno. Todas las células requieren oxígeno para vivir. En general, la concentración de oxígeno
atmosférico es suficiente para cubrir las necesidades de cualquier cultivo celular. Solo algunos cultivos
de órganos requieren una mayor concentración de oxígeno (hasta un 95%) por la mala difusión de este
elemento al interior del órgano.
CO2. El CO2 tiene un papel muy importante en los cultivos celulares puesto que la fracción disuelta en
el medio está en equilibrio con el ion bicarbonato.
En consecuencia, los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio cuando este está tamponado con
un tampón bicarbonato y, en cualquier caso, en la concentración de bicarbonato cuando se utiliza otro
sistema tampón.
Por esta razón cada medio de cultivo tiene una concentración recomendada de CO2 en la fase gaseosa,
en función de la cantidad de bicarbonato sódico que contiene. La concentración más habitual es del
5%, con un rango entre 2% y 8%. Los incubadores llevan acopladas botellas de CO2 y un dispositivo que
permite controlar la concentración de este componente en la atmósfera de incubación.
Condiciones de incubación
El incubador es también el responsable de mantener las condiciones ambientales
óptimas para el crecimiento de las células, controlando dos parámetros: temperatura y
humedad.
Temperatura. La temperatura influye en gran medida en la tasa de crecimiento de las
células. La temperatura óptima de crecimiento suele ser la misma a la que están
sometidas fisiológicamente en los organismos de procedencia. Así, las células de
mamíferos crecen bien a 37 ºC, pero la temperatura óptima para las células de insectos
es de 28 ºC.
Humedad. La humedad ambiental es también un parámetro importante para el buen
crecimiento de las células. Debe ser suficientemente elevada para evitar la evaporación
del medio de cultivo, lo que produciría aumento de la concentración de los
componentes y de la osmolaridad, y variaciones de pH.
Los incubadores actuales tienen dispositivos que inyectan agua estéril para conseguir
humedades relativas alrededor del 95%.
 FASES DEL CULTIVO CELULAR

1.- DISGREGACIÓN CELULAR

2.- SELECCIÓN DE CÉLULAS
3.- RECUENTO Y VARIABILIDAD CELULAR
4.- DESCONGELACIÓN DE CÉLULAS
5.- INICIO DEL CULTIVO ( siembra)
6.- MANTENIMIENTO DEL CULTIVO
7.- PASE O SUBCULTIVO
8.- CONSERVACIÓN DE LAS CÉLULAS
1.- Disgregación celular
El primer paso es obtener en suspensión el tipo celular, para ello hay que
separar las células de sus uniones entre sí y de la matriz extracélular.
Este procedimiento es necesario para cultivar las células procedentes de
un órgano o tejido.
 Métodos de disgregación celular
La disgregación se utiliza para realizar un cultivo primario y para despegar las células del
soporte. Se rompen las uniones de la célula con las proteínas de la matriz extracelular.
Las células epiteliales son más difíciles de disgregar porque tiene uniones más fuertes
entre sí. Las células mesenquimales son más fáciles de disgregar, porque solo están
unidas a la matriz extracelular.

Se puede realizar mediante:

• métodos mecánicos
• químicos
• enzimáticos.
A ) Métodos mecánicos: se utilizan para cualquier tipo celular y pueden
causar daño mecánico. La suspensión celular que se obtiene no es muy
buena. Se basan en cortar, picar o triturar con suavidad los fragmentos de
órganos o tejidos.

Un método muy usado para órganos blandos es el cribado de células o tamizado. El

proceso consiste en colocar los trozos de órgano sobre una malla de nailon o metálica y
aplastar suavemente. Esta malla se acopla a un recipiente y se realizan lavados seriados
sobre la malla, de modo que las células caen al recipiente y los restos orgánicos no
disgregados permanecen en la malla.
B ) Métodos químicos: se lava el medio con células con PBS ( tampón fosfato
salino) sin calcio y magnesio o se utilizan agentes quelantes como el EDTA
para romper los receptores de membrana ( integrinas) que unen la matriz con
el citoesqueleto.

C ) Métodos enzimáticos: Este método se basa en aplicar enzimas

proteolíticas sobre la matriz extracelular, para que las células se liberen. Las
proteasas más utilizadas son: colagenasa, tripsina (tripsinización.), papaína,
elastasa, y proteínasa K.
2.- Selección de células

Una vez las células están disgregadas obtenemos una mezcla compleja de células en
suspensión, con la que podemos directamente iniciar un cultivo primario. Pero si nos interesa
seleccionar un tipo celular concreto podemos seleccionarlo de dos modos:

-Por sus propiedades específicas: Podemos separar los tipos celulares en base a su diferente
adhesión a los sustratos. Se hace pasar las células por unas columnas o filtros con los diferentes
sustratos y las células quedan retenidas. Para liberarlas lavamos las columnas con un tampón
que disminuya la adhesión y eluya las células.

-Por métodos inmunológicos: Son métodos basados en la técnica ELISA mediante el empleo
de anticuerpos específicos para antígenos celulares concretos
3.- Recuento y viabilidad celular
Siempre que queramos saber la densidad celular (al iniciar un cultivo o un
subcultivo) debemos conocer la concentración de células y cuántas de
estas células son viables.
Los colorantes vitales nos permiten diferenciar las células vivas de las
muertas. El más usado es el azul tripán, un coloide que penetra en el
interior de las células cuya membrana está rota (muertas) pero que no
atraviesa la membrana de las células vivas.

Al observar al microscopio:
Las células azules: se contabilizan como muertas.
Las células blancas (refringentes): se contabilizan como vivas. Son las únicas
que nos interesan para la densidad celular al realizar un cultivo.
Contaje (recuento):
Es el proceso de recuento de vivas y muertas (blancas y azules). Los
recuentos se pueden hacer manualmente (en cámara de recuento o
hemocitómetro) o empleando métodos automáticos
(autohemocitómetros). La cámara de recuento manual más empleada es
la cámara de Neubauer.
Video
https://www.youtube.com/watch
?v=G0wmfyn3hqA
Para el contaje debemos:
• Homogenizar la suspensión celular.
• Realizar una alícuota de esta suspensión celular al 50% en azul tripán.
• Montar la cámara de Neubauer con un cubreobjetos. Queda un espacio de 0.1 mm entre la superficie de la
cámara y el cubreobjetos.
• Cargaremos 10 ul de la alícuota al 50%. La suspensión debe cubrir todo el volumen del cuadrado: 1 mm · 1 mm ·
0,1 mm = 0.1 mm3
• Cargaremos 10 ul de la alícuota al 50%. La suspensión debe cubrir todo el volumen del
cuadrado: 1 mm · 1 mm · 0,1 mm = 0.1 mm3
(lado del cuadrado · lado del cuadrado · altura al cubre).
• Visualizamos la cámara en el microscopio a 4x o 10x.
• Se realiza el recuento de viables (blancas o B) y no viables (azules o A), contando las
células presentes en los 4 cuadros

Marcados con L en la imagen.

• Es importante para evitar errores contar siempre del mismo modo. Normalmente, se cuentan solo las células que se
encuentran dentro del cuadrado formado por las líneas triles. Si una célula toca alguna de estas líneas emplearemos el
siguiente criterio:
Líneas superior e izquierda: SI SE CUENTAN Líneas inferior y derecha: NO SE CUENTAN
4.- Descongelación de células

El descongelado de células es un procedimiento habitual en el laboratorio de cultivos

celulares para iniciar cultivos secundarios, a partir de líneas celulares mantenidas en
congelación en nitrógeno líquido o en ultracongeladores a -80ºC.
Trabajaremos en cabina de bioseguridad para prevenir contaminaciones

1. Incubar el vial de células congeladas a 37ºC en un baño.

2. Limpiar la superficie externa del vial con etanol al 70%.
3. Transferir el contenido del vial a un tubo y añadir medio de
cultivo nuevo atemperado a 37ºC.
4. Centrifugar el tubo a 800 rpm durante 5 minutos.
5. Desechar el sobrenadante, para eliminar el DMSO
(crioprotector) que es tóxico, y resuspender el pellet celular en
medio de cultivo nuevo atemperado a 37ºC.
6. La suspensión celular está lista para iniciar el cultivo
5.- Inicio del cultivo (siembra)

A partir de una suspensión celular que hemos disgregado de un

tejido o a partir de una suspensión celular congelada, se inicia un
cultivo, para ello se siguen los siguientes pasos:

• Elegir el recipiente a emplear y su volumen: frasco, placa…..

• En base al recipiente ajustar la densidad de células a sembrar, una vez
hecho el recuento de células viables. ( según tablas establecidas)
• Añadir al recipiente de cultivo un volumen adecuado de la suspensión
celular y añadir medio de cultivo nuevo atemperado a 37ºC hasta
alcanzar el volumen de cultivo adecuado para ese recipiente.
• Incubar a: 37ºC de temperatura, 95% humedad y 5% de CO2.
6.- Mantenimiento del cultivo

El mantenimiento de los cultivos consiste en diferentes operaciones para el

control de su viabilidad y crecimiento. Las más importantes son:

❖1- Control periódico microscópico:

Los cultivos se controlan microscópicamente de forma periódica, normalmente entre 1 y 3
días. Para esto debemos examinar los recipientes de cultivo (frascos o placas) en un
microscopio invertido, y comprobar su evolución y crecimiento.
❖2- Cambios de medio:
El cambio de medio es la operación de mantenimiento del cultivo celular más frecuente.
De esta forma se renuevan los nutrientes consumidos y se eliminan los productos de
desecho generados por el metabolismo celular. El cambio se hace cada 2 o 3 días, pero
siempre que percibamos un cambio de color en el medio (viraje del indicador de pH) hay
que observar el cultivo.

El cambio de medio nunca es completo, se sustituyen únicamente 2/3 del total. De esta
manera mantenemos en el cultivo posibles sustancias beneficiosas secretadas por las
mismas células.

• En los cultivo en monocapa, el medio de cultivo está por encima del cultivo y tan solo es necesario
retirar 2/3 partes del medio antiguo con una pipeta y sustituirlo con medio nuevo atemperado.

• Los cultivos en suspensión se centrifugan suavemente, para depositar las células en el fondo. A
continuación se retiran 2/3 partes del medio antiguo y se sustituye por medio nuevo atemperado,
resuspendiendo las células.
7.- Pase o subcultivo:

Cada 6 o 7 días los cultivos en monocapa llegan a su confluencia máxima y los cultivos
en suspensión a su densidad crítica. Es el momento de realizar un subcultivo o pase
celular.
En los cultivos en monocapa es necesario despegar las células de la superficie, bien de
forma mecánica con rascadores o scrappers o bien de forma enzimática con tripsina.
Una vez resuspendidas las células, se realiza un recuento de viables y se realiza un
subcultivo con la cantidad adecuada de células para iniciar un nuevo crecimiento.
En los cultivos en suspensión se realiza el pase a partir del recuento de viables.
8.- Conservación de células
Las líneas celulares continuas o inmortales se pueden conservar mediante su
congelación. ( equipo de criogenia)

Primero es necesario realizar una suspensión celular del cultivo en monocapa, por
medios mecánicos o enzimáticos. (Los cultivos en suspensión no precisan este paso)

A continuación centrifugamos y se resuspende junto con un crioprotector.

Se introducen en alícuotas y se criogeniza progresivamente.
 CONTAMINACIONES
La contaminación en los cultivos
celulares se refiere a la alteración del
cultivo por la presencia de
microorganismos no deseados
presentes en el ambiente (bacterias,
levaduras, hongos, micoplasmas y
virus).

Bacterias, levaduras y hongos

Las bacterias y las levaduras son los
contaminantes más habituales en los
cultivos a corto plazo.
Los hongos filamentosos los más
habituales en los cultivos a largo
plazo.
El uso de antibióticos y antifúngicos,
no siempre es suficiente para
prevenir la contaminación.
Micoplasmas
Son microorganismos procariotas sin pared celular que suelen infectar los cultivos. La
contaminación suele provenir de las propias líneas celulares continuas, que se suministran
contaminadas o de una contaminación de los sueros animales.
No es una contaminación fácil de detectar (en ocasiones es necesario realizar una PCR).
Siempre hay que aislar el cultivo contaminado del resto o incluso eliminarlo.
Si el cultivo es importante y no puede ser eliminado se puede intentar tratar con
antibióticos.
Virus
Es un tipo de contaminación poco frecuente, pero grave. La fuente de contaminación de
virus suelen ser los sueros animales. La presencia de virus se detecta mediante la
observación del efecto citopático característicos de cada virus (pe. mutaciones).
Ante la sospecha de infección viral lo mejor es eliminar el cultivo .