Cultivo de tejido animal.

Podemos decir que es el conjunto de tcnicas que nos permiten mantener clulas
in vitro con una gran aproximacin a sus propiedades y funciones in vivo.
Dependiendo del grado de preservacin de la estructura del tejido u rgano de
origen y del tiempo de su duracin distinguimos diferentes tipos de cultivos: de
rganos, explantes, primarios, secundarios, etc.
El trmino cultivo de tejidos suele ser usado como un trmino genrico que
incluye el de cultivo de rganos y el de cultivo de clulas.
Tipos de cultivos de tejidos
1.- Cultivo de rganos: En este tipo de cultivo la organizacin tridimensional del
rgano in vivo se mantiene, aunque slo sea parcialmente, y mantiene todas o
algunas de las caractersticas histolgicas del tejido original. El rgano o porcin
del mismo se mantiene en un medio lquido del que extrae los nutrientes y al que
elimina los desechos metablicos. Los diferentes tipos de clulas se mantienen en
su forma diferenciada y constituye una buena rplica del rgano original. Pero, sin
embargo, generalmente no permite la propagacin, ya que el crecimiento de
clulas se produce nicamente en la periferia. Normalmente este tipo de cultivo es
difcil de mantener durante un tiempo prolongado debido a las diferencias
potenciales de crecimiento de los distintos tipos celulares que constituyen el
rgano. La falta de propagacin tiene como consecuencia que para repetir el
experimento se necesite nuevo material, por lo que se produce cierta
heterogeneidad de muestras.
2.- Explantes primarios: Constituidos por fragmentos pequeos de tejidos u
rganos que se adhieren a una superficie en la que generalmente crecen las
clulas ms perifricas del explante. Un cultivo se denomina cultivo primario
cuando las clulas o tejidos procedentes de un ser vivo crecen sin haber pasado
previamente por una fase de crecimiento in vitro. Un cultivo se denomina cultivo
secundario cuando procede de una fase previa de crecimiento in vitro.

3.- Cultivo de clulas: Este tipo de cultivo est formado por clulas dispersas
disgregadas de un tejido vivo, de un cultivo primario, o de una lnea celular,
mediante distintos sistemas mecnicos, qumicos o enzimticos. Las clulas
crecen en suspensin o adheridas a una superficie. Generalmente son cultivos
que contienen un nico tipo de clula y stas suelen ser homogneas
genticamente. Es el tipo de cultivo ms utilizado en la actualidad debido a su
capacidad de propagacin, es decir de crecimiento mantenido.
Ventajas
Las principales ventajas de la utilizacin de las tcnicas de cultivo de tejidos son:
Control del medio extracelular. Podemos controlar en un cultivo distintos factores
como: pH, temperatura, humedad, presin osmtica, tensiones de O2 y de CO2,
concentracin de nutrientes, etc.
Homogeneidad de la muestra. Las clulas de un cultivo son bastante
homogneas en comparacin con la variabilidad existente entre animales de
experimentacin.
Disminucin del gasto. Si se experimenta con frmacos, al utilizarse cultivos de
clulas se utilizan concentraciones muy bajas de dichos productos. Recientemente
la utilizacin de sistemas robotizados que utilizan pequeos volmenes, permite la
realizacin de determinados trabajos que necesitan un gran nmero de
determinaciones

repetitivas

en

diferentes

tiempos

con

diferentes

concentraciones de productos.
Disminucin de la necesidad de realizar ensayos in vivo.
Evitndose,

aunque

no

completamente,

el

sacrificio

de

animales

de

experimentacin.
Desarrollo de cultivos histotpicos y organotpicos que incrementan la fiabilidad
de los modelos experimentales.

Desventajas
Excesiva sensibilidad. El crecimiento de las clulas es relativamente lento y es
dependiente en muchos casos de factores no del todon conocidos. Adems,
existen contaminantes como hongos, levaduras, bacterias, micoplasmas y virus
que suelen tener un crecimiento ms rpido y pueden llegar a matar las clulas en
cultivo.
Lmite de produccin. Generalmente el lmite de produccin de un laboratorio
normal es menor a 10g de clulas.
Inestabilidad. Muchas lneas celulares contnuas son inestables por ser
aneuploides.
Validacin del modelo. Cuando realizamos un modelo en cultivo celular, estamos
utilizando un conjunto de clulas disgregadas cuyo origen fue de un tejido, pero
que se diferencia de ste porque:

Se ha perdido la organizacin tridimensional espacial propia deltejido

original
Se han perdido las interacciones heterotpicas, entre los distintos tipos

celulares y entre las clulas y la matriz extracelular

Carece de los sistemas de regulacin in vivo y especialmente de los
constituyentes del sistema nervioso y del sistema endocrino.

Almacenamiento de clulas
Las clulas procedentes de cultivos primarios o de lneas celulares establecidas
pueden almacenarse durante largos perodos de tiempo en temperaturas bajo
cero. Para ello se utilizan sistemas criognicos como veremos en el apartado
siguiente.
Con la criopreservacin se favorece:
El mantenimiento de clulas sin tener que utilizar tejidos animales primarios

 Evitar la prdida de la lnea por contaminacin

Evitar la prdida de la lnea por cambios genticos
El substrato y el medio de cultivo
Para poder realizar un cultivo de tejidos es preciso:

Un recipiente, donde se realiza el cultivo

Placa de Petri de tamaos 3.5, 6.0 y 10 cm
Multiplacas, con varios pocillos de 6 a 96 son las ms frecuentes
Frascos de Roux de diferentes formas y tamaos
Especiales, como las roller bottles o los que llevan incorporados un
portaobjetos

Un substrato, donde las clulas se adhieren y crecen

Recipientes de vidrio, de los indicados en el apartado anterior

Recipientes de plstico, de los indicados en el apartado anterior
Microsoportes, pequeas esferas de distinta naturaleza, que se mantienen

en suspensin, sobre las que crecen las clulas

Substratos metlicos
Superficies tratadas con componentes de la matriz extracelular como

colgeno, fibronectina, vitronectina, etc...

Feeder layers, que son restos de celulas que creciereon en monocapa y

que se esterilizan y se inhibe su crecimiento con radiacin gamma o X.

Matrices tridimensionales como geles de colgeno, celulosa, fosfato clcico,

etc ...
Substratos no adherentes como agar o agarosa que permiten cierta
separacin entre las clulas para formar colonias

Una fase gaseosa donde es de gran importancia el oxgeno y el dixido de

carbono. El primero de ellos, imprescindible para la vida de las clulas.
El segundo, fundamental para la regulacin del pH del medio de cultivo.
Un medio lquido que recubre o en el que estn suspendidas las clulas y que las
nutre. Este es el medio de cultivo que presenta una serie de caractersticas como:

 Propiedades fsicas
pH, generalmente alrededor de 7.4 y controlado por el CO2 del incubador y
por substancias amortiguadoras incluidas en la formulacin del medio como
el HEPES. El medio de cultivo suele incluir rojo fenol que es un indicador
del pH, medio es de color rojo a pH 7.4, naranja a pH 7.0, amarillo a pH 6.5,
azul-rojizo a ph 7.6 y de color prpura a pH 7.8
Osmolaridad, que suele estar comprendida generalmente entre 260-320
mOsm/kg.
Temperatura, es fundamental para el correcto crecimiento de las clulas e
influye asimismo en el pH
Viscosidad, relacionada con la concentracin de suero
Tensin superficial, que debe de mantenerse lo suficientemente baja para
evitar la formacin de espumas
Composicin qumica
Solucin salina equilibrada (BSS):

mezcla

de

sales

inorgnicas

suplementada con glucosa

Aminocidos, es necesario suplementar con aminocidos esenciales,
generalmente se aade glutamina a una concentracin 2mm antes de la

utilizacin del medio

Vitaminas
Glucosa
Otras molculas, como lpidos, piruvato, etc...
Suero, que aporta hormonas y factores de crecimiento. Los ms utilizados
son el suero de ternera (CF), el suero bovino fetal (FCS), el suero de
caballo (HS) y el suero de origen humano (HuS). El suero es un elemento
determinante en el correcto crecimiento de un cultivo. Existen lneas que sin
suero no crecen y existen otras lneas que no crecen en la presencia de
suero. Esto se debe a la presencia de diferentes molculas en el suero,
generalmente en concentraciones mnimas, que pueden estimular o inhibir
el crecimiento celular.

Adems, los distintos lotes de suero suelen ser diferentes en las concentraciones
de estos elementos, con lo a veces la repeticin de un experimento no es posible
al desconocer exactamente las concentraciones de estas molculas en los
distintos sueros utilizados.

 Antibiticos y antifngicos, para evitar el crecimiento de bacterias y hongos.

Los ms utilizados son penicilina, estreptomicina, gentamicina, fungizona y
anfotericina-B
Actualmente se pueden utilizar ciertos medios con frmulas definidas que incluyen
factores de adhesin, inhibidores de proteasas, hormonas, factores de
crecimiento, oligoelementos como Cu, Se y Fe, y protenas