UNIDAD 2.

REALIZACIÓN DE
CULTIVOS CELULARES
M3. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA
UNIDAD 2_REALIZACIÓN DE CULTIVOS
CELULARES

2.1 Tipos de cultivos celulares en citogenética.

2.2 Biología de las células en cultivo

2.3 Factores que intervienen en el cultivo

2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y propagación de cultivos

 Tipos de cultivos celulares en
2.1
citogenética
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE EXTENSIONES
CROMOSÓMICAS
2.1 Tipos de cultivos celulares en citogenética

Cultivo de Cultivo de Cultivo de

órganos explantes células

consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de

cultivo artificial y una atmósfera controlada
2.1 Tipos de cultivos celulares en citogenética

Cultivo de Cultivo de Cultivo de

órganos explantes células

consiste en adherir un fragmento de tejidos a una superficie (placa o frasco de cultivo) y

nutrirlo con un medio de cultivo
2.1 Tipos de cultivos celulares en citogenética
2.1 Tipos de cultivos celulares en citogenética

Cultivo celular: conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento

de células de organismos pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus
características fisiológicas, bioquímicas y genéticas.

Cultivo celular primario: la suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células de un
tejido por métodos mecánicos o enzimáticos. De esta manera, se obtiene una mezcla celular compleja
formada por distintos tipos celulares presentes en el tejido. El cultivo celular se puede hacer a partir de
esta mezcla seleccionando un tipo celular concreto.
Es el primer cultivo que se hace a partir de un órgano para obtener una determinadas cél
Tripsina: Separa las cél

Cultivo celular secundario: la suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo primario o
de otro secundario mediante un subcultivo o un “pase”. También se puede obtener a partir de una línea
celular mantenida en congelación Es el primer pasaje que se hace a un medio rico para obtener mas cantidad de cél
 2.2 Biología de las células en cultivo
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE EXTENSIONES
CROMOSÓMICAS
2.2 Biología de las células en cultivo

2.2.1. La curva de crecimiento del

cultivo: representación gráfica de la
dinámica de crecimiento de un cultivo
(concentración de células por días de
evolución de cultivo)

subcultivo
2.2 Biología de las células en cultivo

2.2.2. Formas de crecimiento:

- Crecimiento en monocapa: las células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico o
vidrio) Estas Cél solo crecen a lo ancho, nunca en mas pisos (cel epiteliales, siempre estan quietas)
2.2 Biología de las células en cultivo

2.2..2. Formas de crecimiento:

- Crecimiento en monocapa: las células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico o
vidrio)

- Adhesión a una superficie: coincide con el periodo de latencia de la curva de crecimiento.

- Proliferación y formación de colonias: corresponde con la fase exponencial de la curva de
crecimiento.
- Inhibición por contacto: las células detienen su crecimiento pero siguen vivas. Se inicia la fase
estacionaria de la curva de crecimiento. En esta fase es cuando la morfología y la fisiología de las
células se parecen más a las de las células de origen. Para que las células reanuden su
crecimiento se necesita hacer un subcultivo o “pase” de parte de las células a un nuevo frasco de
cultivo. El momento idóneo para realizarlo es el final de la fase exponencial.
2.2 Biología de las células en cultivo

2.2.2 Formas de crecimiento:

- Crecimiento en suspensión: las células no necesitan pegarse a una superficie para crecer por lo
que se mantienen dispersas en el seno del medio de cultivo y proliferando. Crecimiento típico de
células sanguíneas circulantes, células hematopoyéticas, células madre, algunas líneas tumorales y
algunas líneas células transformadas.

- Adaptación al medio de cultivo

- Proliferación en suspensión
- Inhibición por densidad.
Las cél sanguineas siempre estan en movimiento
2.2 Biología de las células en cultivo

No todos los tipos celulares tienen la misma facilidad para crecer en cultivo. En general, se puede afirmar
que que un tipo celular será tanto más fácil de cultivar cuanto más indiferenciado sea, es decir, cuanto
mayor sea la capacidad de sus células de dividirse o diferenciarse en otras células.
De hecho, muchos tipos celulares pierden características de diferenciación cuando se cultivan, entre ellas
la incapacidad de dividirse, producción de enzimas, rutas metabólicas, etc.
Esta pérdida de propiedades y funcionalidades puede ser debida a la desdiferenciación o adaptación a
las nuevas condiciones microambientales generadas por el medio y a las condiciones de cultivo, tan
diferentes a las condiciones tisulares

Las cel si no se dividen, el cultivo muere

2.2 Biología de las células en cultivo

2.2.3 Comportamiento vital tras sucesivos pases:

Para hacer un carotipado Necesita cantidad

LÍNEA CELULAR PRIMARIA LÍNEA CELULAR CONTINUA

- Obtenida a partir de cultivo primario - Obtenido a partir de cultivo primario

- Pases seriados limitados - Pases seriados ilimitados

- Cultivo primario realizado a partir de mezcla de - Pueden aparecer de manera espontánea en

células: el tipo celular con mayor tasa de algunos cultivos: células inmortales
crecimiento acaba desplazando al resto. Mutación que la hace inmortal

- Senescencia: las células van perdiendo su - Aparecen como consecuencia de un fenómeno

capacidad de dividirse y el cultivo acaba de transformación de las células normales,
muriendo. relacionado con la pérdida de los mecanismos
de control.
Características de las células transformadas:

❖ Crecen indefinidamente en cultivo: inmortales

❖ Pierden la dependencia del anclaje para crecer, pueden crecer en suspensión.
❖ Pierden inhibición por contacto.
❖ Pueden invadir tejidos y producir tumores
❖ Acumulan anomalías genéticas. Normalmente son aneuploides y con múltiples
aberraciones cromosómicas.

Factores que pueden inducir la aparición de líneas celulares continuas:

❖ Métodos físicos: irradiación del cultivo. UV

❖ Métodos químicos: tratamiento con productos químicos carcinogénicos. Bromuro
etidio
de

❖ Métodos biológicos: infección vírica, transfección de ADN, etc.

 2.3 Factores que intervienen en el cultivo
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE EXTENSIONES
CROMOSÓMICAS
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

A) Soporte físico en el que van a crecer las células

B) La composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo
C) La atmósfera gaseosa
D) Las condiciones de incubación
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

A) Soporte físico en el que van a crecer las células

Tenemos que tener en cuenta ciertos aspectos del recipiente:

- El material o el sustrato con el que está fabricado (plástico reutilizable, plástico desechable,
matrices tridimensionales , microesferas de sephadex o poliacrilamida, metales)
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

A) Soporte físico en el que van a crecer las células

Tenemos que tener en cuenta ciertos aspectos del recipiente:

- Características y tipos de recipientes de cultivo: placas multipocillo, placa transwell, placas petri,
frascos o botellas roux. Estudiar si hay algún tipo de comunicación cel.
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

A) Soporte físico en el que van a crecer las células

Tenemos que tener en cuenta ciertos aspectos del recipiente:

- Tratamiento de las superficies: para facilitar la adhesión celular.

2.3 Factores que intervienen en el cultivo

A) Soporte físico en el que van a crecer las células

 2.3 Factores que intervienen en el cultivo

B) Composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo

- Sales minerales: solución salina equilibrada

- Tapón: las células son muy sensibles a los cambios de pH (bicarbonato, HEPES...)
Fuente de
-
carbono y
Glucosa: fuente de energía para las células. Puede ir acompañado de otros hidratos de carbono.
energia - Aminoácidos: como mínimo, todos los aminoácidos esenciales (aquellos que los organismos no
pueden sintetizar por sí mismos)
- Vitaminas: influyen en la tasa de crecimiento y en la supervivencia celular.
- Suplementos orgánicos de bajo peso molecular: ácidos grasos esenciales, otros lípidos,
nucleósidos, piruvatos, etc.
- Indicador de pH: como el rojo fenol.
- Hormonas y factores de crecimiento: dificil de estandarizar en el medio de cultivo. Se suelen
suplementar los medios con suero animal (entre 2%-50%, siendo el más habitual el 10%).
Descomplementación del suero animal (56º 30-45 minutos)
- Antibióticos y antifúngicos.
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

B) Composición y propiedades fisicoquímicas del medio de cultivo

- pH: Normalmente el pH óptimo es 7,4

- Osmolaridad: deben ser isotónicos o ligeramente hipotónicos respecto de las células que se
cultivan.
- Viscosidad: no suele ser un parámetro limitante para el crecimiento de las células. Depende
principalmente de la concentración de suero que se utilice. Una viscosidad ligeramente elevada
puede tener un efecto protector durante la tripsinización y agitación del cultivo. Si se usa un medio
libre de suero se pueden usar sustancias inertes que aumentan la viscosidad.
- Tensión superficial: debe mantenerse baja y no suele ser un problema. En algunos cultivos en
suspensión en los que se burbujea CO2 puede producirse espuma en el cultivo. Se pueden añadir
agentes antiespumantes.
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

C) La atmósfera gaseosa

Es la mezcla de gases en que se mantienen los cultivos.

- Oxígeno: en general, la concentración de oxígeno atmosférico es suficiente para cubrir las

necesidades de cualquier cultivo celular.
- CO2: los niveles de CO2 pueden influir en el pH del medio. La concentración más habitual es del
5% Mantiene el pH estable
2.3 Factores que intervienen en el cultivo

D) Las condiciones de incubación

- Temperatura: influye en gran medida en la tasa de crecimiento del cultivo. La temperatura óptima
suele ser la misma a la que están sometidas fisiológicamente en los organismos de procedencia.
Células de mamíferos: 37º. Células de insectos: 28º

- Humedad: Debe ser suficientemente elevada para evitar la evaporación del medio de cultivo, lo
que produciría un aumento de la concentración de los componentes y de la osmolaridad, y
variaciones de pH. Humedad relativa: 95% Hidrata el cultivo
 Técnicas de obtención, mantenimiento y
2.4 propagación de cultivos
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE EXTENSIONES
CROMOSÓMICAS
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.1 Disgregación y selección celular
2.4.2. Recuento y viabilidad celular
2.4.3 Descongelación de células
2.4.4. Inicio del cultivo (siembra)
2.4.5 Mantenimiento del cultivo
2.4.6 Conservación de células
2.4.7 Contaminaciones
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.1 Disgregación celular: separación de las
Recomendación:
Combinación de ambos
células entre sí y de la matriz extracelular en la
que se encuentran.

Se coloca en remojo
con estas enzimas y
ellas rompen los
tejidos que las
mantienen unidad
Trituradora
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.1.1 Disgregación celular mecánica:

Fragmentos de Cortar, picar o

Filtrar para retirar
órgano o tejidos triturar
restos de tejido
en placa petri suavemente
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.1.1 Disgregación celular enzimática:

Tratamiento del tejido con
enzimas proteolíticas que
digieren las células de la
matriz extracelular
Proteasas más utilizadas: Se pueden combinar con
- Tripsina EDTA (quelante de Ca2+).
- Dispasa Retira los cationes de Ca2+
- Papaína que estabilizan las uniones
- Elastasa entre las proteínas de matriz y
- Pronasa las células.
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.1 Selección de células: tras la disgregación de un tejido se obtiene una mezcla de células. Se
puede comenzar el cultivo primario (cultivo mixto) o seleccionar el tipo celular de interés (cultivo puro)
Columna: Se lava con buffer
Métodos de selección celular
❖ Propiedades específicas:
➢ Adhesión a sustratos naturales (colágeno, endotelios, etc,)
Licuado
➢ Adhesión a sustratos artificiales (lana de vidrio, plástico)
❖ Métodos inmunológicos: uso de anticuerpos específicos que reconocen las células de interés
anclados a un soporte sólido.
➢ En placa multipocillo Cell
sorting
➢ Esferas de material inerte + filtrado
➢ Esferas magnéticas + imán
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.2 Recuento y viabilidad celular: necesitamos saber la densidad del cultivo (número de células
por ml) y la proporción de células vivas.

COLORANTE VITAL CONTAJE

Blancas vivas
Muertas azules

Azul de tripran (tripan blue). Sólo entra en Cámara de contaje celular o

las células muertas. hemocitómetro. Ej. Cámara de Neubauer
 2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
CONTAJE

La cámara de Neubauer es una

cámara de recuento adaptada al
microscopio de campo claro o al de
contraste de fase. Consta de un
portaobjetos con una depresión en el
centro, en el fondo de la cual se ha
marcado una cuadrícula (por lo general,
con la ayuda de un diamante). Relación de cél x mL Conteo de cél por cuadro

Es un cuadrado de 3x3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0,25mm. La depresión
central del cubreobjetos está hundida 0,1 mm respecto a la superficie de forma que, cuando se cubre con
un cubreobjetos, éste dista de la superficie marcada 0,1mm.
Se agregaun porta muy fino que genera una especie de sanwich y por capilaridad se siembra debajo del cristal
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
Procedimiento de contaje:

https://www.youtube.com/watch?v=3cbm8_
MhmPY

Las cel que pisan una liniea

Si la densidad celular es muy elevada y no no se tienen en cuenta
se puede hacer bien el recuento, se puede
hacer un dilución previa en PBS
1/10-1/100. Este factor de dilución se
deberá tener en cuenta a la hora de hacer
los cálculos

10x: Se mira si hay uniformidad

40x: Se hace el recuento
Los cuadros de fuera no se tienen en cuenta
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
Evita errores y ahorra tiempo

El principio del contador celular se basa en la

medida de los cambios en la resistencia eléctrica
que se producen cuando una partícula no
conductora en suspensión en un electrólito
atraviesa un pequeño orificio. Una pequeña
abertura entre los electrodos es la zona sensible a
través de la que pasan las partículas que se
encuentran en suspensión. Cuando una partícula
atraviesa el orificio, desplaza su propio volumen de
electrólito. El volumen desplazado se mide como
un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es
proporcional al volumen de la partícula. Si se
controla la cantidad de suspensión que circula a
través del orificio, es posible contar y medir el
tamaño de las partículas. Este dispositivo es capaz
de contar y medir varios miles de partículas por
segundo, independientemente de su forma, color y
densidad.
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.3. Descongelación de células: para iniciar cultivos secundarios a partir de líneas celulares
mantenidas en congelación en nitrógeno líquido o a -80ºC

Pasos a seguir en el proceso de descongelación:

1) Incubar el vial que contiene las células congeladas en un baño
a 37ºC Transferencia rápida de sólido a líquido Procurar que las células
2) Limpiar la superficie externa del vial con etanol 70% para están poco tiempo en
prevenir contaminaciones contacto con el DMSO
3) Transferir el contenido del vial a un tubo falcon de 15mL y porque es tóxico para
añadir 10mL de medio de cultivo precalentado a 37ºC ellas a temperatura
4) Centrifugar 4-5 minutos a 700-800 rpm Obtener el pellet ambiente
5) Eliminar el sobrenadante para eliminar el DMSO
6) Añadir 4-5mL de medio de cultivo completo nuevo. La
Protege a la cél por rotura por congelación
suspensión celular está lista para iniciar el cultivo.
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.4. Inicio del cultivo (siembra) nº de cél inicial de siembra: Segun tamaño y tiempo

Pasos a seguir en el proceso de siembra:

1) Elegir el tipo de recipiente que se va a utilizar para el cultivo
2) En virtud del recipiente, establecer el número de células que se
van a sembrar inicialmente
3) Hacer recuento de células viables en la suspensión
4) Transferir un volumen de suspensión que contenga el número
de células deseado a un tubo falcon y lavarlas con medio de
cultivo completo precalentado a 37ºC Evitar el shock a la cél
5) Diluir las células con el volumen adecuado de medio de cultivo
completo e introducirlas en el recipiente de cultivo
6) Colocar el recipiente de cultivo en un incubador a la
temperatura adecuada (normalmente 37ºC) con la proporción
de CO2 requerida (del 5% habitualmente) y 95% de humedad
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.5 Mantenimiento del cultivo: el objetivo es mantener la viabilidad y el crecimiento de las células.

Manipulación en cabinas de clase II El cambio de medio se realiza

Control para renovar los nutrientes
Cambio de Subcultivo o consumidos por la célula y
periódico al
medio pase eliminar los productos de
microscopio
desechos generados por el
Se añade antibiótico y antimicótico al medio metabolismo.

- Cultivo en monocapa: retirar

con pipeta ⅔ de medio y
sustituirlo por medio nuevo
- Cultivo en suspensión:
centrifugar a 700-800 rpm el
cultivo, retirar ⅔ del volumen
Rojo fenol del medio y sustituir por
Acidez cambia magenta Viraje del indicador de pH medio nuevo
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.5 Mantenimiento del cultivo: el objetivo es mantener la viabilidad y el crecimiento de las células.

❖ Cultivos en suspensión: cuando alcanzan una densidad crítica el crecimiento se

Subcultivo o detiene.
pase ➢ Realizar un recuento de células viables y calcular la dilución necesaria

4/5 del 4/5 del 4/5 del 4/5 del 4/5 del
Dilución
medio medio medio medio medio
adecuada
1/5

1/5 del cultivo viejo

Otra opción es ir escalando el tamaño del

recipiente de cultivo
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.5 Mantenimiento del cultivo: el objetivo es mantener la viabilidad y el crecimiento de las células.

❖ Cultivos en monocapa: cuando las células se encuentran en situación de

Subcultivo o confluencia, el crecimiento se detiene.
pase Hay que despegar las células de la superficie a la que están adheridas:
- Medios mecánicos : raspador
- Medios enzimáticos: tripsina (tripsinización)

https://www.youtube.com/watch?v=qkEbC8CF3_0

Hay dos mecanismos de despegar las cél:

- Medio enzimático como tripsina
- Método mecánico como una pala o rastrillo muy fino con el que se rasca y permite barrer el fondo de la placa
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.6. Conservación de células: las líneas continuas o inmortales se pueden mantener en el tiempo
mediante pases seriados. Problema: consume tiempo y recursos

Congelación Pasos a seguir en el proceso de congelación:

1) Se procede como si se fuese a realizar un pase
2) Después del recuento de células viables se retira el medio de cultivo
por centrifugación y se añade por un volumen adecuado de suero
animal con un 10% de DMSO. Una densidad celular aceptable en el
medio de congelación (suero + DMSO 10%) sería ~106 cel/mL
3) Alicuotar la solución en criotubos (~1 mL/criotubo) y congelar de
manera progresiva.

https://www.youtube.com/watch?v=ozDQpS6TjSw
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.7 Contaminaciones: normalmente por microorganismos omnipresentes en el ambiente.
❖ Bacterias, levaduras y hongos: crecen más rápidos que las células ocasionando la muerte del
cultivo en poco tiempo.
➢ Uso de antibióticos y antifúngicos en los medios cultivo
➢ Trabajar en condiciones estrictas de asepsia y en cabinas de bioseguridad clase II
➢ Cuidado cuando haya que manipular los recipientes fuera de la campana
➢ Limpiar la superficie externa de todos los viales y recipientes con etanol 70% (ojo con los
recipientes que vienen de un baño a 37ºC)
➢ Mantener limpios los incubadores
➢ En el caso de descubrir cultivos contaminados, separarlos rápidamente del resto y
eliminarlos previa esterilización
2.4 Técnicas de obtención, mantenimiento y
propagación de cultivos
2.4.7 Contaminaciones: normalmente por microorganismos omnipresentes en el ambiente.
❖ Micoplasma: microorganismos procariotas sin pared celular que provocan la muerte o la
alteración de los cultivos celulares. Hay ocasiones en que la contaminación proviene de la propia
línea o de los sueros de animales.
➢ Hay que eliminar cualquier cultivo positivo que se encuentre
➢ Tener incubadores separados para cultivos primarios y líneas
➢ Se puede intentar limpiar el cultivo con antibióticos
❖ Virus: infrecuente pero grave. Puede ser por suero animal. La detección se basa en la
observación del efecto citopático característico de cada virus. Ante la sospecha de infección, mejor
eliminar el cultivo previa esterilización por radiación.
ACTIVIDADES
1. Completa el mapa conceptual con los
conceptos siguientes: animal,
necropsia, cultivo celular
secundario,disgregación celular, cultivo
de explantes, línea celular continua,
pase, cultivo de órganos, necropsia,
cultivo celular primario, órganos,
animal, fragmentación mecánica,
transformación, suspensión celular,
línea celular primaria, fragmentos de
tejidos.Las casillas verdes
corresponden a material biológico las
azules a tipos de cultivo las moradas
para líneas celulares y las naranjas a
procedimientos o procesos
 ACTIVIDADES
2. Define los siguientes conceptos relacionados con la biología de las células en cultivo:

a) Dependencia de anclaje
b) Crecimiento en monocapa
c) Crecimiento en suspensión
d) Inhibición por contacto
e) Senescencia

3. Enumera cinco diferencias entre una línea celular primaria de crecimiento en monocapa y una línea celular
continua

4. En el laboratorio de cultivos celulares disponemos de los siguientes recipientes para cultivo: placas multipocillo
de 24 pocillos, frascos roux de 25cm2, botellas roller de 850 cm2, frascos de cultivo con portaobjetos. Indica que
tipo de recipiente de cultivo utilizarías para las siguientes situaciones y justifica la respuesta:
a) cultivo celular de líquido amniótico para hacer un cariotipo
b) ensayo de inhibición de la síntesis de proteínas citoplasmática mediante tratamiento con un fármaco
antitumoral
c) ensayo de citotoxicidad en varias líneas celulares con varias concentraciones de una molécula nueva
d) expansión de una línea celular de crecimiento en monocapa para purificar un antígeno de membrana
característico de aquella
 ACTIVIDADES
5. Explica la función o justifica el motivo por el que son necesarios los siguientes componentes de un medio de
cultivo celular

a) glucosa
b) tampón
c) aminoácidos esenciales
d) indicador de pH
e) antibióticos antifúngicos

6. Indica las ventajas y los inconvenientes del uso de suero animal para completar los medios de cultivos
celulares.
 ACTIVIDADES
7. Respecto a los procedimientos habituales en el laboratorio de cultivos celulares, di si son verdaderas o falsas
las siguientes afirmaciones. Justifica las que consideres falsas.
a) La mejor manera de disgregar células de un órgano o tejido es combinar métodos mecánicos con métodos
enzimáticos.
b) La descongelación de células para cultivo se realiza a temperatura ambiente, conservando las células en la
solución de congelación hasta el momento de sembrarlas.
c) Conviene controlar los cultivos periódicamente mediante observación microscópica con un microscopio
invertido para observar la morfología celular y la evolución del crecimiento.
d) Un cambio de color en el medio de cultivo por viraje del indicador de pH indica que el cultivo evoluciona
normalmente y, en consecuencia, no es necesario cambiar el medio.
e) Es conveniente realizar siempre dos pasos de cultivo por semana para que las células no pierdan
vitavilidad.
 ACTIVIDADES

8. Se quiere hacer un pase de un cultivo en monocapa que está a punto de entrar en confluencia. Una vez
despegadas y lavadas las células, se resuspenden en 5 ml de medio de cultivo. Para hacer el recuento de células
viables, 20ul de suspensión se mezclan con 20 ul de azul tripán y con la mezcla se carga una cámara de
Neubauer. El recuento de las células blancas y azules en las cuatro esquinas de la cámara ha sido el siguiente:

1- 76 células blancas y 16 azules

2- 68 células blancas y 20 azules
3- 72 células blancas y 16 azules
4- 64 células blancas y 12 azules

a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5mL de suspensión? y la densidad celular viable?
b) ¿Qué viabilidad tienen las células (porcentaje de viables respecto al total)?
c) Las células se van a subcultivar en frascos roux de 25cm2 y se quieren sembrar 7*105 células por frasco en
un volumen final de medio de 5 mL por frasco. ¿Cuántos frascos se necesitan? ¿Qué cantidad de medio y
de suspensión celular hay que colocar en cada uno?
 ACTIVIDADES

9. Queremos congelar células de una línea celular que crece en suspensión. Partimos de una suspensión de
células lavadas y resuspendida en 5 ml de medio de cultivo. Para hacer el recuento de viables, se hace una
dilución previa 1/10 de la suspensión con PBS. Después se mezclan 20ul de la dilución con 20ul de azul tripán y
con la mezcla se carga una cámara de Neubauer. El recuento de las células blancas y azules en las cuatro
esquinas de la cámara ha sido el siguiente.

1- 48 células blancas y 10 azules

2- 41 células blancas y 9 azules
3- 44 células blancas y 12 azules
4- 47 células blancas y 11 azules

a) ¿Cuál es la densidad celular total de los 5mL de suspensión? ¿y la densidad celular viable?
b) ¿Qué viabilidad tienen las células (porcentaje de viables respecto al total)?
c) Queremos congelar las células en criotubos a una densidad de 106 células viables/mL, colocando 1,5 mL
de suspensión en cada criotubo. Explica qué pasos seguirías desde la suspensión de las células en medio
de cultivo hasta colocar los criotubos en nitrógeno líquido. ¿Qué volumen de solución de congelación
necesitas? ¿Cuántos criotubos necesitas?