Extracto de Moringa - Maduración in Vitro de Ovocitos Bovinos

Efecto antioxidante del extracto de
Moringa oleifera en la maduración in

vitro de oocitos bovinos
Lina Marcela Amaya Barragán
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencia Animal
Palmira, Colombia
2021
Efecto antioxidante del extracto de
Moringa oleifera en la maduración in
vitro de oocitos bovinos
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Ciencias Agrarias
Directora:
IB, MSc, Ph.D Viviana Torres Osorio
Codirector:
MV., MSc., DSc Rómulo Campos Gaona
Línea de Investigación:
Producción Animal Tropical
Grupo de Investigación:
Conservación, mejoramiento y utilización del ganado criollo hartón del valle y otros
recursos genéticos animales en el suroccidente colombiano
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento de Ciencia Animal
Palmira, Colombia
2021
Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.

«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he

realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de
texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida

por la universidad.
________________________________
Fecha 17/03 /2021

Agradecimientos
En primer lugar, agradezco a Dios por darme sabiduría y entendimiento durante todo el
proceso de estudio.
A mi familia por su apoyo y motivación en todo momento, brindándome consejos,

alentándome a seguir a delante pese a las dificultades y dar lo mejor de mí, personal y
académicamente.
Al grupo de investigación “Conservación, Mejoramiento y Utilización del Ganado Criollo

Hartón del Valle y Otros Recursos Genéticos Animales en el Sur Occidente Colombiano”
por acogerme, hacerme miembro, por su confianza y colaboración brindada.
A mi directora Viviana Torres Osorio, por su apoyo, conocimiento y orientación brindada

durante todo el proceso, su acogida en el laboratorio de la Universidad CES y su
hospitalidad al recibirme en su hogar.
Al profesor Rómulo Campos Gaona, por ser guía durante todos mis estudios y como
codirector en este proyecto, estar atento y presente en todas las necesidades que se
presentaron en el camino, y ante todo brindarme confianza y compartir sus conocimientos.
Al profesor Harlen Torres Castañeda, por brindarme su apoyo y acompañamiento durante

el proceso de extracción y evaluación fitoquímica.
A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, por darme la oportunidad de realizar

mis estudios, realmente es un orgullo pertenecer a esta institución, ante todo por financiar
el proyecto contribuyendo con el aporte continúo a la investigación del país.
A la Universidad CES, por acogerme en sus instalaciones y permitirme el uso de sus

equipos durante el proceso de investigación.
A la Planta de Beneficio Central Ganadera, por suministrar el material biológico (ovarios)

para el desarrollo de la investigación.
Por último y no menos importante a todas aquellas personas que de una manera u otra
participaron en este proyecto logrando así la realización de este.
Resumen y Abstract VII
Resumen
Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de

oocitos bovinos
Las hojas de Moringa oleifera tienen compuestos como vitaminas, minerales y metabolitos
secundarios que le confieren propiedades antioxidantes. Sin embargo, el extracto de esta
planta no ha sido estudiado como suplemento en los medios de cultivo en la producción in
vitro de embriones bovinos. Por tanto, el objetivo fue evaluar si el medio de maduración in
vitro con extracto de Moringa oleifera mejora la competencia del oocito y la calidad del
blastocisto, a través de la tasa de maduración nuclear, tasa de blastocistos totales, niveles
de especies reactivas de oxígeno (EROs), niveles de glutatión (GSH) intracelular y número
de células totales. La extracción fitoquímica se realizó a partir de hojas maduras de
Moringa oleifera. Los oocitos provenientes de ovarios de una planta de beneficio (1446)
se maduraron en medio TCM 199 suplementado con 0 (control-, C), 50, 100 y 150 μg mL-
1
de extracto de Moringa oleifera y 50 μg mL-1 de ácido ascórbico (Control+, AA). Pasadas
24 horas, se fertilizaron y cultivaron de acuerdo con el procedimiento estándar. Los datos
obtenidos fueron analizados con la prueba Kruskal-Wallis. No se observaron diferencias
significativas entre tratamientos (P>0,05), a excepción de los niveles de GSH y EROs, que
se redujeron un 59% y 57%, respectivamente, con el uso de 150 μg mL-1 de extracto. En
conclusión, el extracto de Moringa oleifera redujo las EROs, sin embargo las
concentraciones de GSH intracelular también se redujeron y no hubo un efecto significativo
en la maduración in vitro de oocitos bovinos ni en el desarrollo embrionario temprano.
Palabras clave: blastocisto, biotecnología, estrés oxidativo, planta medicinal,

ganado vacuno.
VII Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de
I oocitos bovinos
Abstract
Antioxidant effect of Moringa oleifera extract on in vitro maturation of bovine

oocytes
Moringa oleifera leaves have compounds such as vitamins, minerals and secondary
metabolites that give it antioxidant properties. However, the extract of this plant has not
been studied as a supplement in culture media in the in vitro production of bovine embryos.
Therefore, the objective was to evaluate whether the in vitro maturation medium with
Moringa oleifera extract improves oocyte competence and blastocyst quality, through the
nuclear maturation rate, total blastocyst rate, levels of reactive oxygen species. (ROS),
intracellular glutathione (GSH) levels and total cell number. The phytochemical extraction
was carried out from mature leaves of Moringa oleifera. The oocytes from ovaries of a
beneficiation plant (1446) were matured in TCM 199 medium supplemented with 0 (control-
, C), 50, 100 and 150 μg mL-1 of Moringa oleifera extract and 50 μg mL-1 of ascorbic acid
(Control +, AA). After 24 hours, they were fertilized and cultivated according to the standard
procedure. The data obtained were analyzed with the Kruskal-Wallis test. No significant
differences were observed between treatments (P> 0.05), with the exception of GSH and
ROS levels, which were reduced by 59% and 57%, respectively, with the use of 150 μg
mL-1 of extract. In conclusion, Moringa oleifera extract reduced ROS, however intracellular
GSH concentrations were also reduced and there was no significant effect on in vitro
maturation of bovine oocytes or early embryonic development.
Keywords: blastocyst, biotechnology, oxidative stress, medicinal plant, cattle.

Contenido IX
Contenido
Pág.
Resumen ............................................................................................................................ VII
Lista de figuras .................................................................................................................. XI
Lista de tablas ................................................................................................................... XII
Glosario ............................................................................................................................. XIII
Introducción ........................................................................................................................ 1
Hipótesis .............................................................................................................................. 1
1. Objetivos ...................................................................................................................... 3
1.1 Objetivo general ..................................................................................................... 3
1.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 3
2. Marco teórico ............................................................................................................... 5

2.1 Radicales libres y especies reactivas de oxígeno ................................................. 5
2.2 Estrés oxidativo ...................................................................................................... 7
2.3 Especies reactivas de oxígeno en PIVE ................................................................ 8
2.3.1 Fuentes endógenas de EROs ............................................................................ 8
2.3.2 Fuentes exógenas de EROs .............................................................................. 9
2.3.3 Efectos deletéreos de EROs ............................................................................ 11
2.4 Antioxidantes naturales en la MIV ....................................................................... 12
2.5 Generalidades de Moringa oleifera ...................................................................... 12
2.6 Metabolitos de Moringa oleifera ........................................................................... 13
2.7 Acción antioxidante de Moringa oleifera .............................................................. 14
2.7.1 Compuestos fenólicos ...................................................................................... 15
2.7.2 Ácidos fenólicos ................................................................................................ 16
2.7.3 Flavonoides ...................................................................................................... 17
2.8 Algunos estudios que involucran el extracto de Moringa oleifera como fuente
antioxidante ..................................................................................................................... 18
3. Materiales y métodos ................................................................................................ 21

3.1 Material vegetal .................................................................................................... 21
3.2 Obtención del extracto de hojas de Moringa oleifera .......................................... 21
3.3 Fraccionamiento del extracto ............................................................................... 22
3.4 Preparación muestra de trabajo........................................................................... 22
3.5 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................. 22
3.5.1 Determinación de Terpenoides y esteroides ................................................... 23
X Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de
oocitos bovinos
3.5.2 Determinación de Fenoles totales.................................................................... 23

3.5.3 Determinación de Flavonoides ......................................................................... 24
3.5.4 Determinación de Taninos ............................................................................... 24
3.5.5 Determinación de Cumarinas ........................................................................... 24
3.5.6 Determinación de Glúcidos cardiotónicos........................................................ 24
3.6 Determinación colorimétrica a microescala de compuestos fenólicos ............... 24
3.6.1 Contenido total de fenoles (CTF) ..................................................................... 25
3.6.2 Contenido de Flavonoides Totales (CFT) ........................................................ 25
3.6.3 Contenido total de catequinas (CTC) ............................................................... 25
3.7 Determinación de la actividad antioxidante ......................................................... 25
3.7.1 Método radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picril hidrazilo) ................................. 25
3.7.2 Método potencial antioxidante reductor férrico (FRAP)................................... 26
3.7.3 Método capacidad antioxidante equivalente a trolox o ABTS (ácido 2, 2-
azinobis, 3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) ................................................................... 26
3.8 Evaluación del extracto para uso en PIVE .......................................................... 27
3.8.1 Obtención del extracto y preparación para PIVE............................................. 27
3.8.2 Recolección de ovarios .................................................................................... 27
3.8.3 Aspiración folicular y obtención de oocitos ...................................................... 28
3.8.4 Maduración in vitro (MIV) ................................................................................. 28
3.8.5 Fertilización in vitro (FIV) .................................................................................. 29
3.8.6 Cultivo in vitro (CIV) .......................................................................................... 30
3.8.7 Evaluación de la maduración nuclear .............................................................. 30
3.8.8 Evaluación de los niveles de EROs y GSH intracelulares .............................. 30
3.8.9 Evaluación de la calidad embrionaria .............................................................. 31
3.9 Análisis estadístico ............................................................................................... 32
3.9.1 Extracción y análisis de extractos .................................................................... 32
3.9.2 Evaluaciones correspondientes a la PIVE ....................................................... 32
4. Resultados ................................................................................................................. 33
4.1 Análisis fitoquímico preliminar ............................................................................. 33
4.2 Contenido de compuestos fenólicos .................................................................... 33
4.3 Actividad antioxidante .......................................................................................... 34
4.4 Contenido de fenoles totales y actividad antioxidante del extracto utilizado en
PIVE .............................................................................................................................. 35
4.5 Maduración nuclear .............................................................................................. 36
4.6 Niveles EROs y GSH ........................................................................................... 37
4.7 Tasa de clivaje y blastocistos .............................................................................. 38
4.8 Número total de células en blastocistos .............................................................. 39
5. Discusión .................................................................................................................... 41
6. Conclusiones y recomendaciones .......................................................................... 49

6.1 Conclusiones ........................................................................................................ 49
6.2 Recomendaciones ............................................................................................... 49
Bibliografía ........................................................................................................................ 51
Contenido XI
Lista de figuras
Pág.
Figura 2-1: Acción pasiva y activa de EROs. ................................................................ 6

Figura 2-2: EROs, estrés oxidativo e intervención de enzimas antioxidantes. ............ 7
Figura 2-3: Reducción del oxígeno................................................................................ 9
Figura 2-4: Estabilización del radical fenóxi ................................................................ 16
Figura 2-5: Mecanismos de acción de los compuestos fenólicos .............................. 16
Figura 2-6: Estructura del ácido gálico y sus derivados ............................................. 16
Figura 2-7: Estructura de los flavonoides. ................................................................... 17
Figura 2-8: Estructura del kaempferol ......................................................................... 17
Figura 2-9: Estructura química de la quercetina ......................................................... 18
Figura 4-1: Actividad antioxidante de las hojas de Moringa oleifera en tres estados
fenológicos expresada como IC50 (mg L-1) de DPPH......................................................... 35
Figura 4-2: Niveles de fluorescencia de EROs y GSH en oocitos bovinos madurados
in vitro con extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control. ................................. 37
Figura 4-3: Niveles de fluorescencia de la sonda H2DCFDA para niveles de EROs y
la sonda Cell tracker blue para GSH intracelular en oocitos bovinos madurados in vitro
con extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control. ............................................. 38
Contenido XII
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1: Perfil nutricional de las hojas de Moringa oleifera ....................................... 14

Tabla 2-2: Contenido total de flavonoides, compuesto fenólicos y actividad antioxidante
de Moringa oleifera ............................................................................................................. 15
Tabla 3-1: Muestras utilizadas para la obtención de los extractos. .............................. 22
Tabla 3-2: Grupos experimentales ................................................................................. 29
Tabla 3-3: Tabla descriptiva de los tratamientos y análisis realizados en la PIVE ....... 32
Tabla 4-1: Análisis preliminar de compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de
hojas de Moringa oleifera en tres estados fenológicos. ..................................................... 33
Tabla 4-2: Contenido de fenoles, flavonoles y catequinas totales presentes en el
extracto de hojas de Moringa oleifera en tres estados fenológicos y en té verde como
control. ....................................................................................................................... 34
Tabla 4-3: Evaluación de la actividad antioxidante del extracto de hojas de Moringa
oleifera por los métodos de DPPH, FRAP y ABTS. ........................................................... 34
Tabla 4-4: Contenido total de fenoles y actividad antioxidante de extracto de hoja
madura de Moringa oleifera utilizado en PIVE. .................................................................. 36
Tabla 4-5: Efecto de la suplementación con extracto de Moringa oleifera, ácido
ascórbico y control sobre la maduración nuclear de oocitos bovinos. .............................. 36
Tabla 4-6: Efecto de la suplementación del medio de maduración con extracto de
Moringa oleifera, sobre la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos derivados de oocitos
bovinos. ....................................................................................................................... 39
Tabla 4-7: Número total de células en blastocistos bovinos producidos in vitro con la
suplementación de extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control, en el medio de
maduración. ....................................................................................................................... 39
Contenido XIII
Glosario
•O2 …………………………………………… Radical superóxido
•OH…………………………………………… Radical hidroxilo
ABTS………………………………………… Capacidad antioxidante equivalente a trolox
(ácido 2, 2-azinobis, 3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)
AcOH………………………………………… Ácido acético
ADN………………………………………… Acido desoxirribonucleico
ADP………………………………………… Adenosín difosfato
AG…………………………………………… Ácido gálico
AH…………………………………………….. Antioxidantes
ARN…………………………………………… Ácido ribonucleico
ATP…………………………………………… Adenosín trifosfato
BME…………………………………………… Aminoácidos esenciales
BSA…………………………………………… Albumina serica bovina
BTRA…………………………………………. Biotecnología de la reproducción asistida
CAT………………………………………….…Catalasa
CCOs………………………………………… Complejos cumulus-oocitos
CIV…………………………………………..… Cultivo in vitro
CO2……………………………………...…… Dióxido de carbono
CTC…………………………………………… Contenido total de catequinas
CTE…………………………………………… Cadena transportadora de electrones
CTF…………………………………………… Contenido total de fenoles
DPPH………………………………………… 2,2-difenil-1-picril hidrazilo
EGF…………………………………………… Factor de crecimiento epidérmico
EROs………………………………………….. Especies reactivas de oxígeno
ES………………………………………………Extracto seco
FDA…………………………………………… Diacetato de fluoresceína
FIV……………………………………………. Fertilización in vitro
FRAP………………………………………… Potencial antioxidante reductor férrico
XI Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de
V oocitos bovinos
FSH…………………………………………… Hormona folículo estimulante

GPx…………………………………………… Glutatión peróxidasa
GSH…………………………………………… Glutatión reducido
H2O2…………………………………………… Peróxido de hidrogeno
HCl…………………………………………… Ácido clorhídrico
HO………….…………………………………. Radical hidroxilo
KOH…………………………………………… Hidróxido de potasio
MEM……………………………………………Aminoácidos no esenciales
MIV……………………………………………. Maduración in vitro
NADH…………………………………………. Nicotinamida adenina dinucleótido
OH- …………………………………………… Anión hidroxilo
PBS…………………………………………… Medio salino fosfatado
Pi……………………………………………… Post inseminación
PIVE……………………………………………Producción de embriones in vitro
pmm…………………………………………… Partes por millón
rpm…………………………………………… Revoluciones por minuto
SFB………………………………………….…Suero fetal bovino
SOD…………………………………………… Superóxido dismutasa
SOF…………………………………………… Synthetic Oviductal Fluid
β-ME……………………………………………β-mercaptoetanol
Introducción
La producción de embriones in vitro (PIVE) es una de las biotecnologías de la reproducción
asistida (BTRA) que más se ha popularizado en los últimos años. La PIVE permite mejorar
el rendimiento productivo y reproductivo de los hatos bovinos al optimizar los procesos de
fertilización y de propagación de material de alto valor genético (Magata et al., 2019). Esta
técnica comprende tres etapas: maduración in vitro de oocitos (MIV), fertilización in vitro
(FIV) y cultivo in vitro (CIV), las cuales intentan imitar las condiciones fisiológicas del
entorno in vivo y producir blastocistos viables (Maillo et al., 2016). El uso de la PIVE ha
estado en constante crecimiento y durante el año 2019, a nivel mundial, se obtuvo un
incremento en la producción de embriones bovinos del 0,2% con respecto al 2018, y
aunque el incremento fue menor que el que se presentó entre el 2016 y 2017 (48,9%), se
logró una producción de más de un millón de embriones bovinos, lo cual representó el
72,7% del total de embriones bovinos transferibles (Viana, 2020). Sin embargo, la calidad
de los blastocistos bovinos producidos in vitro es baja con respecto a los producidos in vivo
(Salzano et al., 2014). Esto se debe al estrés al que se someten tanto los gametos como
los blastocistos en la PIVE y que afecta parámetros como el color y la densidad
citoplasmática, reduce la estabilidad de la zona pelúcida, altera el número de células
totales, modifica los patrones de expresión génica y promueve el aumento de la
concentración de lípidos (Maillo et al., 2016; Salzano et al., 2014; Lonergan, Rizos, Ward,
& Boland, 2001; Rizos et al., 2008). Estos factores contribuyen a la disminución de la tasa
de rendimiento, encontrando que entre el 20 y el 40% de los oocitos se desarrollan hasta
blastocistos en condiciones in vitro con una tasa de preñez del 45%, mientras que en
condiciones in vivo, específicamente por superovulación, se obtiene hasta el 70% de
blastocistos y una tasa de preñez del 65% (L. B. Ferré et al., 2020; Wrenzycki, 2016; Luis
Ferré & Cattaneo, 2013).
La calidad de los oocitos utilizados para los procesos de maduración in vitro, es un factor
determinante de la tasa de oocitos que se desarrollan hasta el estado de blastocisto. Se
ha comprobado que la capacidad del oocito para alcanzar el estadio de blastocisto se ve
2 Introducción
afectada por el medio y las condiciones de cultivo (Blanco, Demyda, Moreno Millán &
Genero, 2012). Por lo tanto, la calidad del oocito es un requisito indispensable para
garantizar el adecuado desarrollo embrionario temprano (Varghese, Ly, Corbin, Mendiola
& Agarwal, 2011). Dicha calidad puede verse afectada en gran medida por el estrés
oxidativo generado por la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs) y las
bajas concentraciones de antioxidantes en los medios de cultivo (Poprac et al., 2017).
Las EROs son moléculas de señalización producidas por el metabolismo aeróbico de las
células (Menezo, Silvestris, Dale & Elder, 2016). En cantidades reguladas, las EROs
presenta una acción activa y especifica (Timme, Hahn, Hansen, Rastogi & Roy, 2018) en
la señalización de diversos procesos celulares, entre los que se encuentran la reanudación
de la meiosis y la estimulación de Ca2+ intracelular en los oocitos, la capacitación e
hiperactivación de los espermatozoides, la activación del acrosoma y el desarrollo
embrionario temprano (Loren et al., 2017; Agarwal, Durairajanayagam & du Plessis, 2014).
Sin embargo, si se produce un desbalance entre la concentración de EROs y antioxidantes,
se generan acciones pasivas (Timme et al., 2018), es decir acciones no específicas que
causan daños en las células, como deterioro de la membrana y las mitocondrias,
agotamiento de energía y apoptosis (García, Romero , Astiz & Ruiz, 2013).
Durante la MIV, el estrés oxidativo genera el envejecimiento prematuro de los oocitos

(Chowdhury et al., 2017), dicho envejecimiento se relaciona con la disminución en las tasas
de fertilización, número de células de los blastocistos, aumento de la apoptosis y
deficiencias en el desarrollo embrionario temprano (Fan yang, Regouski & Polejaeva,
2017).
Una alternativa para aumentar el éxito de la MIV es el uso de extractos de plantas

medicinales como suplemento en el medio de maduración, estas aportan metabolitos
secundarios con propiedades antioxidantes que reducen los daños celulares y aumentan
la calidad y el número de embriones obtenidos (Mbemya, Vieira, Canafistula, Pessoa &
Rodrigues, 2017). Estos antioxidantes actúan como inhibidores en la formación de EROs
y mitigan los efectos dañinos sobre las células, provocados por el estrés oxidativo
(Chowdhury et al., 2017). Además, al ser antioxidantes naturales generan menos residuos
y menor toxicidad en comparación con los antioxidantes sintéticos (Zhong & Zhou, 2013;
Sen, Chakraborty, Sridhar, Reddy, & De, 2010).
Introducción 3
Las hojas de Moringa oleifera son fuente de vitamina A, B y C, calcio, proteína, potasio,
entre otras sustancias que actúan como antioxidantes y evitan la degradación de las
biomoléculas causada por EROs (Liu, Wang, Wei, Gao & Han, 2018). Los extractos de
esta planta se han utilizado como agentes anticancerígenos, en células de leucemia
mieloide y linfoblástica aguda (Khalafalla et al., 2010); antimicrobianos, en la inhibición de
algunos patógenos como P. aeruginosa, E. carotovora, Trichoderma sp, Candida. sp, y E.
coli (Oladeji, Odelade, & Oloke, 2019; Prabakaran, Kim, Sasireka, Chandrasekaran, &
Chung, 2018) y antiinflamatorios, en citosinas inflamatorias de hígado y riñón en ratas
diabéticas (Oguntibeju, Aboua, & Omodanisi, 2020). En las hojas de Moringa oleifera se
han encontrado flavonoides y compuestos fenólicos con actividad antioxidante, a los
cuales se les atribuye la capacidad de atrapar EROs a través de la quelación de metales y
donación de electrones o moléculas de hidrógeno (Y. Liu et al., 2018).
Actualmente, pocos estudios han evaluado el efecto del extracto de Moringa oleifera en
condiciones in vitro en biotecnologías de la reproducción animal. Barakat et al (2015),
reportaron el 64,3% de oocito maduros cuando se utilizó 100 µg mL -1 de este extracto en
la maduración in vitro de oocitos de oveja, en contraste con el 48% del control. Otro estudio
indica que en tejidos de ratas diabéticas el uso de extracto de Moringa oleifera promueve
el aumento significativo de la concentracion de las prinicipales enzimas con funcion
antioxidante, tales como superóxido dismutasa, catalasa y glutatión transferasa (Jaiswal et
al., 2013). Por tanto, el objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto antioxidante de
la suplementación de extracto de Moringa oleifera sobre la maduración in vitro de oocitos
bovinos y su subsecuente desarrollo embrionario temprano.
Hipótesis
El extracto de las hojas de Moringa oleifera tiene función antioxidante sobre los oocitos
bovinos madurados in vitro, permitiendo mejorar su calidad y el subsecuente desarrollo
embrionario in vitro.
1. Objetivos
1.1 Objetivo general

Evaluar el efecto antioxidante de la suplementación de extracto de Moringa oleifera
sobre la maduración in vitro de oocitos bovinos y su subsecuente desarrollo
embrionario in vitro.
1.2 Objetivos específicos

Establecer el estado fenológico de la hoja de Moringa oleifera en el que se encuentra la
mayor concentración de compuestos fenólicos y que permita su uso como suplemento
antioxidante en la maduración in vitro de oocitos bovinos.
Determinar el efecto del extracto de Moringa oleifera sobre la tasa de maduración nuclear
de oocitos bovinos in vitro.
Cuantificar el efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera durante la maduración in

vitro de oocitos bovinos, a través de los niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs)
y de glutatión (GSH) intracelular.
Estudiar el efecto del extracto de Moringa oleifera durante la maduración in vitro de oocitos
bovinos, sobre la tasa de blastocistos y la celularidad.
2. Marco teórico
2.1 Radicales libres y especies reactivas de oxígeno

Comúnmente los términos radicales libres y especies reactivas de oxígeno (EROs) se
relacionan con un mismo concepto (Lushchak, 2014), son moléculas de señalización cuya
producción resulta de un proceso normal del metabolismo aeróbico basal y se derivan de
la reducción del oxígeno (O2) (Menezo et al., 2016). Sin embargo, todas las EROs no son
consideradas radicales libres, por lo que tradicionalmente se incluye en las EROs toda
molécula que contenga oxígeno con uno o más electrones no apareados, entre ellas el
radical hidroxilo (•OH) y el anión superóxido (•O 2-). Esto ha cambiado en la actualidad y
han sido incluidas moléculas no radicales que contiene oxígeno, como el peróxido de
hidrógeno (H2O2), y las interacciones con otras moléculas que contengan nitrógeno o
azufre (Timme et al., 2018).
El efecto de las EROs está determinado por el tipo de antioxidante que actúe y el estado
redox, estableciéndose dos tipos de acciones, pasiva y activa. Los bajos niveles de EROs
permiten una acción activa dirigida a vías de señalización específicas, mientras que un
nivel elevado, no regulado, genera acciones pasivas que causan daños no específicos en
la célula (Figura 2-1) (Timme et al., 2018). Pequeñas cantidades de EROs actúan como
señalizadores e integradores del funcionamiento celular cuando modifican “el estado redox
de proteínas diana como enzimas metabólicas, componentes citoesqueléticos, proteínas
reguladoras del ciclo celular, factores de transcripción y reguladores de traducción” (Mckee
& Mckee, 2014).
6 Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de
oocitos bovinos
Figura 2-1: Acción pasiva y activa de EROs.
Tomado de “Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and
responses“ por A. R. Timme, M.E. Hahn, J.M. Hansen, A. Rastogi & M.A. Roy, 2018, Seminars in
Cell and Developmental Biology.
Adicionalmente, las EROs tienen funciones sobre la maduración ovocitaria, la formación

de blastocitos y la implantación (Romek et al., 2017; Guérin, El Mouatassim, & Ménézo,
2001). No obstante, la acumulación excesiva de estas moléculas causa algunos problemas
como la peroxidación lipídica de las membranas e interviene en la transcripción de ARN,
la síntesis proteica, el bloqueo del desarrollo embrionario y la apoptosis celular (Romek et
al., 2017).
La principal fuente de EROs es la fosforilación oxidativa llevada a cabo en las mitocondrias

(Glasauer & Chandel, 2013), seguida por el retículo endoplasmático, citosol, lisosomas,
peroxisomas y la membrana plasmática. Además, existen condiciones externas que
generan la producción de estas moléculas, condiciones como la exposición a compuestos
tóxicos o cambios ambientales, por ejemplo el uso de reactivos alterados para la
formulación de medios de cultivo in vitro, exposición a radiaciones y cambios en la
temperatura y la concentración de oxígeno (Kelley & Gardner, 2019; Martinez et al., 2017;
Conrad, Ingold, Buday, Kobayashi & Angeli, 2015).
Marco teórico 7
2.2 Estrés oxidativo

El estrés oxidativo se genera como consecuencia del desequilibrio entre la formación de
EROs y su control por parte de antioxidantes presentes en el medio (Figura 2-2) (Poprac
et al., 2017). Este desequilibrio puede ser ocasionado por una serie de eventos, por
ejemplo, aumento en los niveles de compuestos endógenos o exógenos que se oxidan,
disminución de las reservas de antioxidantes de baja masa molecular, inactivación de
enzimas antioxidantes o su escasa producción (Lushchak, 2014). Las defensas
enzimáticas antioxidantes primordiales son la superóxido dismutasa (SOD) que cataliza la
formación de H2O2 y O2 a partir de radical superóxido; la glutatión peróxidasa (GPx) que
controla la concentración de peróxidos y reduce el H 2O2 para formar agua; peróxirredoxina
que desintoxica peróxidos y la catalasa (CAT) que cataliza la conversión de H 2O2 en agua
y oxígeno (Mckee & Mckee, 2014).
Figura 2-2: EROs, estrés oxidativo e intervención de enzimas antioxidantes.
Tomado de “Targeting Free Radicals in Oxidative Stress-Related Human Diseases” por P. Poprac
et al., 2017, Trends in Pharmacological Sciences.
oocitos bovinos
2.3 Especies reactivas de oxígeno en PIVE

El estrés oxidativo es un problema común en la PIVE. Este se genera por la formación de
EROs endógenas mediante el metabolismo celular normal y EROs exógenas por factores
como los suplementos adicionados a los medios de cultivo, la exposición a la luz, altas
concentraciones de oxígeno (García et al., 2013), cambios de temperatura, pH,
centrifugación, criopreservación y la manipulación de las células o de los embriones
(Agarwal, Durairajanayagam, et al., 2014).
2.3.1 Fuentes endógenas de EROs
Formación de EROs en la mitocondria (fosforilación oxidativa)
En la fosforilación oxidativa el piruvato y los ácidos grasos son oxidados en la mitocondria

por medio del ciclo del ácido cítrico. Los protones que se liberan durante este proceso (H +)
son transportados por el NADH y el FADH2 en la cadena de transporte de electrones (CTE)
(Nolfi Donegan, Braganza, & Shiva, 2020). La conservación de la energía generada en la
CTE por la fosforilación del ADP permite el paso de protones desde la matriz mitocondrial
al espacio intermembranal. Los protones atraviesan la membrana interna a través de la
enzima ATPsintasa que induce la síntesis de ATP ( Nolfi-Donegan, Braganza, & Shiva,
2020; Mckee & Mckee, 2014). Dentro de este proceso se llevan a cabo eventos
desfavorables que causan daños a las moléculas, a la mitocondria y a la célula, estos
eventos se refieren a la salida de los electrones de la CTE y su reacción con el oxígeno, lo
que da lugar a la formación de EROs (Mckee & Mckee, 2014). En la mitocondria los sitios
de producción de EROs son el complejo I y la citocromo oxidasa del complejo III que
generan el radical •O2- y H2O2 (Tarazona, Olivera & Lenis, 2010).
Lushchak (2014), explica que alrededor del 90% del oxígeno consumido por la célula se
reduce directamente en agua por la citocromo oxidasa en la CTE y menos del 10% de
oxígeno se reduce mediante vía de un electrón dando como resultado la producción del
radical •O2-, que posteriormente se reduce y de manera simultánea acepta dos protones
produciendo H2O2, este último acepta un electrón y se divide en un radical hidroxilo (•HO)
y un anión hidroxilo (OH-), finalmente el •HO acepta un electrón y un protón generando una
molécula de agua (Figura 2-3).
Marco teórico 9
Figura 2-3: Reducción del oxígeno
Tomado de “Free radicals, reactive oxygen species, oxidative stress and its classification” por
Lushchak, 2014, Chemico-Biological Interactions.
Participación fisiológica de EROS en PIVE

La presencia de EROs en los procesos in vitro es necesaria, ya que estas moléculas
participan de forma positiva y funcional en diferentes etapas de la PIVE. Las EROs
participan en la maduración in vitro, la reanudación de la meiosis y la estimulación de Ca 2+
intracelular en los oocitos, la capacitación e hiperactivación de los espermatozoides, la
fosforilación de tirosina, la activación del acrosoma y el desarrollo embrionario
preimplantatorio (Loren et al., 2017). Además, las EROs tienen una función relevante en
la regulación de la fluidez de las membranas celulares y en la tasa de unión de
espermatozoides y oocitos (Agarwal et al., 2014).
2.3.2 Fuentes exógenas de EROs
Medios de cultivo y suplementos
La composición de los medios de cultivo utilizados en PIVE influye sobre la calidad de los
embriones (Vásquez, Torres, & Rojano, 2014). Por ejemplo, el uso de suero fetal bovino
como sustrato en los medios de cultivo, disminuye la síntesis de GSH y aumenta la
producción de EROs, en comparación con el uso de albúmina sérica bovina (BSA)
(Combelles, Gupta, & Agarwal, 2009;). Los iones metálicos (Fe2+ y Cu2+) presentes en los
medios de cultivo, promueven la formación de EROs a través de reacciones de Fenton y
Haber-Weiss, además, el hierro puede generar la peroxidación lipídica desencadenada por
el •OH libre (Guérin, El Mouatassim & Ménézo, 2001).
Naturalmente los oocitos y los embriones están protegidos del estrés oxidativo por factores
antioxidantes presentes en los fluidos folicular y oviductal, adicional a enzimas como la
oocitos bovinos
superóxido dismutasa de cobre y zinc (Cu-Zn SOD), superóxido dismutasa de manganeso

(Mn SOD), CAT, GPx y vitaminas A, C y E, factores ausentes en los medios utilizados in
vitro (García et al., 2013).
Luz
La luz visible produce estrés fotodinámico (du Plessis, Makker, Desai, & Agarwal, 2008).
La exposición a la luz por más de 5 minutos, proveniente ya sea del estéreo microscopio
o del ambiente, genera aumento de H2O2 provocando daños en los lípidos de la membrana
celular. Los daños provocados por la luz dependen del tiempo de exposición, la intensidad
y el espectro de la luz (Soto-Heras & Paramio, 2020; Agarwal et al., 2014).
Concentración de Oxígeno
Algunos estudios demuestran que la concentración de oxígeno (O2) en el tracto
reproductivo de los animales es menor (1,5-8,7%) que la utilizada generalmente en las
incubadoras y a la que se exponen tanto las células como los embriones en PIVE (20%)
(Sovernigo et al., 2017). El aumento en los niveles de O2 induce la producción excesiva de
EROs debido a la estimulación de enzimas oxidasas dependientes de O 2 (Agarwal,
Durairajanayagam, et al., 2014). El estrés oxidativo derivado de la exposición de los
embriones a altos niveles de O2 genera alteraciones en la expresión génica durante la
PIVE, provocadas por el aumento en la metilación del ADN (W. Li et al., 2014). Por otra
parte, se ha reportado que la producción de EROs disminuye con el uso de una tensión de
oxígeno del 2 al 5%, lo que promueve mejoras en la morfología y la viabilidad embrionaria
(Morin, 2017; Rodrigues et al., 2013).
pH y temperatura de los medios de cultivo

El pH es uno de los parámetros más importantes de regulación para el mantenimiento de
la homeostasis (Will, Clark, & Swain, 2011). La variación del pH en los medios de cultivo
afecta la movilidad espermática, la maduración ovocitaria y el desarrollo embrionario. Las
variaciones en las concentraciones de CO 2 durante la incubación de las células altera el
pH del medio, por lo que es relevante mantener niveles constantes de CO2 para garantizar
los niveles adecuados de pH (Agarwal, Durairajanayagam, et al., 2014). La temperatura de
incubación también tiene un papel importante en la regulación del pH, si aumenta
sobrepasando los valores normales el pH tiende a disminuir. Las alteraciones de estos
Marco teórico 11
parámetros conllevan a la producción excesiva de EROs (Agarwal, Durairajanayagam, et

al., 2014).
Centrifugación
La centrifugación es usada durante los procesos de PIVE para la separación de los
espermatozoides móviles de los inmóviles y de otras células presentes en el plasma
seminal (leucocitos, células epiteliales y bacterias), para su utilización eficiente en la
fertilización in vitro (FIV) de oocitos (Agarwal, Virk, Ong, & du Plessis, 2014).
Adicionalmente, durante la centrifugación las células se exponen a temperaturas más altas
lo que causa mayor producción de EROs (Agarwal, Durairajanayagam, et al., 2014), que
posteriormente causan la fragmentación del ADN y producen graves daños en los
espermatozoides, lo que limita la capacidad fecundante (Muratori et al., 2019; Guimarães
et al., 2014 ).
Criopreservación
La criopreservación es una técnica de las BTRA que permite la conservación de oocitos,
espermatozoides y embriones completos a temperaturas bajo cero por prolongados
periodos, para posteriormente ser descongelados y utilizados en otros tratamientos
(Mandawala, Harvey, Roy & Fowler, 2016). A pesar de que para la criopreservación se
utilizan sustancias protectoras y protocolos que mejoran la viabilidad de las células, esta
técnica representa un estrés que induce la producción de EROs y que puede llegar a
modificar la estructura y la integridad de las células (Agarwal, Durairajanayagam, et al.,
2014). Por ejemplo, las EROs producidas durante la criopreservación de oocitos causan
daños en biomoléculas como el ADN, las proteínas y los lípidos, lo que se deriva en daños
de la membrana plasmática y las organelas (Mateo-Otero, Yeste, Damato, & Giaretta,
2021; Gutnisky et al., 2020).
2.3.3 Efectos deletéreos de EROs

Altas concentraciones de EROs durante PIVE están relacionadas negativamente con la
calidad de los oocitos, la maduración y la implantación embrionaria (Loren et al., 2017).
Las EROs pueden combinarse con biomoléculas como lípidos, proteínas, carbohidratos y
ácidos nucleicos, entre otras, generando cambios estructurales y funcionales (du Plessis,
Makker, Desai & Agarwal, 2008), tales como la peroxidación de lípidos de la membrana,
oocitos bovinos
modificación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, alteraciones mitocondriales, bloqueo

celular, agotamiento de ATP y apoptosis celular (García et al., 2013).
2.4 Antioxidantes naturales en la MIV

Los antioxidantes han sido utilizados durante la MIV de oocitos para minimizar los daños
oxidativos, algunos de los reportados en la literatura son el ácido ascórbico, alfa tocoferol,
β-mercaptoetanol (β-ME), melatonina, cisteína y cisteamina, cuyos resultados están
relacionados con la disminución de la producción de EROs, el aumento de la tasa de
blastocistos, la mejora de la maduración citoplasmática y el aumento de los niveles de GSH
en bovinos (Zhao et al., 2018; Vásquez et al., 2014), porcinos (Alvarez, Morado, Soto,
Dalvit, & Cetica, 2015), caprinos (Lv et al., 2010) y bufalinos (Mahmoud et al., 2016). Así
mismo, los compuestos fenólicos han mostrado efectos positivos como antioxidantes, esto
debido a que estructuralmente contienen grupos hidroxilo que les permite transferir
electrones o radicales hidrógeno, entre estos antioxidantes están las catequinas de té
verde, resveratrol, quercetina, kaempferol, cumarina, entre otros, los cuales mejoran la
tasa de maduración y fertilización, aumentan la formación de blastocistos y el número de
células embrionarias en especies como porcinos (Lee, Jin, Taweechaipaisankul, Kim, &
Lee, 2018; J.-T. Kang et al., 2013), murinos (M. J. Liu et al., 2018), ovinos (A. Zabihi,
Shabankareh, Hajarian, & Foroutanifar, 2019), humanos (M. J. Liu et al., 2018) y bovinos
(Feng Wang et al., 2013). Adicionalmente, se ha informado que los antioxidantes naturales
causan menores efectos secundarios comparados con los antioxidantes sintéticos, ya que
generan menor toxicidad y debido a la estructura de sus componentes fenólicos muestran
una mayor estabilidad y menor producción de residuos (Zhong & Zhou, 2013; Sen,
Chakraborty, Sridhar, Reddy, & De, 2010). Es así como evaluar extractos de origen natural
resulta llamativo y Moringa oleifera ha mostrado tener gran número de compuestos con
capacidad antioxidante, por ejemplo, quercetina y Kaempferol (Vats & Gupta, 2017).
2.5 Generalidades de Moringa oleifera

Moringa oleifera es un árbol originario de la India, pertenece a la familia moringácea
(Nouman et al., 2016), orden Brassicales (Olson & Fahey, 2011) y se cultiva
comercialmente en los trópicos y subtrópicos, a una altitud entre 250 y 1.600 m.s.n.m.,
principalmente en África, Asia, Sur y Centro América (Lim, 2011). El uso de Moringa
Marco teórico 13
oleifera ha aumentado en los últimos años debido a que todas sus partes pueden ser
aprovechadas y cada una de ellas tiene propiedades nutricionales (Y. Liu et al., 2018),
antioxidantes (Akorede et al., 2020), antiinflamatorias (Jaiswal et al., 2013), antibacterianas
(Oladeji et al., 2019) y antifúngicas que permiten su uso terapéutico, además del uso en
alimentación humana y animal (Tiloke, Anand, Gengan & Chuturgoon, 2018).
Cada elemento estructural de este árbol presenta diferentes concentraciones de

componentes fitoquímicos (Vats & Gupta, 2017). Las hojas, son la estructura más completa
en cuanto a su composición, presentan un contenido alto de proteína, ácidos grasos
insaturados, aminoácidos, vitamina A, B, C, D y E, carbohidratos, β-carotenos, flavonoides,
alcaloides y diversos minerales como calcio, potasio, sodio y hierro entre otras sustancias
que le confieren el potencial de actuar como antioxidante (Liu et al., 2018; Prabakaran,
Kim, Sasireka, Chandrasekaran & Chung, 2018).
Algunos estudios reportan que el contenido total de fenoles, componente principal con
mayor actividad antioxidante, en las hojas de Moringa oleifera es 0,59 veces más alto que
en las flores y 1,36 veces más que en la corteza (Vats & Gupta, 2017) y la eficiencia del
efecto antirradical es mayor con el uso de su extracto (Nascimento et al., 2013).
2.6 Metabolitos de Moringa oleifera

Moringa oleifera es una planta con propiedades medicinales atribuidas a metabolitos como
la quercitina, kaemferol, zeatina, campesterol y sitosterol (Vats & Gupta, 2017), incluidos
en los grupos fenoles, flavonoides, carotenoides, alcaloides, glucosinalatos, isotiocianatos
(Tiloke et al., 2018), oxalatos (Prabakaran et al., 2018) y antocianinas (AL Juhaimi,
Ghafoor, Ahmed, Babiker & Özcan, 2017). También, contiene otros compuestos
polifenólicos como ácido gálico y ácido clorogénico (Prabakaran et al., 2018). Los
metabolitos secundarios encontrados en el extracto de Moringa oleifera en un estudio
realizado por Echavarria et al., (2016) fueron flavonoides, fenoles, antocianinas,
polifenoles, alcaloides y taninos, presentes en un 35,3% del extracto. Sin embargo, el tipo
y cantidad de metabolitos se ve afectado por las condiciones ambientales donde se
desarrolle el cultivo (Vats & Gupta, 2017). En razón a la presencia de sus metabolitos,
Moringa oleifera es utilizada en el tratamiento de hiperglucemia, inflamación, cáncer,
bronquitis e infecciones, como respuesta a las propiedades antioxidantes, antibacterianas
y antifúngicas que presenta (Tiloke et al., 2018). La tabla 2-1, señala el perfil nutricional de
oocitos bovinos
las hojas de Moringa oleifera con base a 100 g de muestra y 100 g de proteína, según
Holguín, García, & Mora, (2018).
Tabla 2-1: Perfil nutricional de las hojas de Moringa oleifera
Composición nutricional (g) Cofactores y coenzimas (mg)
Proteína 29,4* Vitamina B1* 2,02
Fibra 12,5* Vitamina B2* 21,4
Grasa 5,2* Vitamina B3* 7,6
Carbohidratos 41,2* Vitamina C* 15,8
Lisina 3,6** Vitamina E* 10,8
Leucina 5,22** Calcio* 2185
Metionina 0,95** Magnesio* 448
Cisteína 2,05** Fosforo* 252
Glicina 5,15** Potasio* 1236
Alanina 3,43** Cobre* 0,48
Energía Bruta (cal) 329* Hierro* 25,6
Fuente: Holguín et al, (2018). * Valores con base a 100 g de muestra; ** valores con base a 100 g
de proteína
2.7 Acción antioxidante de Moringa oleifera

La acción antioxidante de una molécula radica en evitar la formación de EROs e inhibir los
daños que estas generan, por ejemplo la peroxidación lipídica y la oxidación de proteínas
(Lim, 2011). Los antioxidantes presentes en Moringa oleifera son de defensa de segunda
línea, es decir actúan en la eliminación de las EROs activas para inhibir su acción y evitar
la propagación (Ighodaro & Akinloye, 2018).
La actividad antioxidante en Moringa oleifera (tabla 2-2) está relacionada, principalmente,

con la presencia de ácidos fenólicos (ácido gálico, clorogénico, elágico y ferúlico) y
flavonoides (kaempferol, quercetina y rutina) (Prabakaran et al., 2018; Verma,
Marco teórico 15
Vijayakumar, Mathela & Rao, 2009), que tienen la capacidad de ceder átomos de
hidrógeno o electrones y estabilizar las EROs (AL Juhaimi, Ghafoor, Ahmed, Babiker, &
Özcan, 2017). Prabakaran et al., (2018) reportan la miricetina como un compuesto
adicional al complejo de antioxidantes mayormente responsables de la acividad
antioxidante de Moringa oleifera. De igual forma, las vitaminas C (ácido ascórbico) y E (α-
tocoferol) tienen actividad antioxidante (Tiloke et al., 2018).
Tabla 2-2: Contenido total de flavonoides, compuestos fenólicos y actividad

antioxidante de Moringa oleifera
Fenoles Flavonoides Actividad
Componente Referencia
totales totales antioxidante
55 90 85 (Prabakaran et al., 2018)
(AL Juhaimi, Ghafoor, Ahmed,
56.10 38.90 78,97
Contenido Babiker y Özcan, 2017)
53.69 ------- 64,84 (Nascimento et al., 2013)
Fenoles totales (mg ácido gálico g-1 de extracto seco), Flavonoides (mg de quercetina g-1 de extracto
seco), 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH)
2.7.1 Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos se sintetizan a partir del aminoácido fenilalanina o tirosina y los
componen flavonoides, taninos, cumarinas, quinonas y antocianinas. Estos compuestos
tienen diversas estructuras, algunas simples donde hay presencia de sólo un anillo
aromático y otras formas poliméricas complejas (Mbemya, Vieira, Canafistula, Pessoa &
Rodrigues, 2017).
Los compuestos fenólicos están caracterizados por la presencia de grupos hidroxilo unidos
a anillos aromáticos y su potencial depende del número de grupos y su ubicación. Estos
compuestos tienen la capacidad de inhibir las EROs a partir de la donación de átomos de
hidrógeno, acción que permite la formación del radical fenóxi (Figura 2-4 y 2-5)
(Nascimento et al., 2013); impedir la etapa de inicio de las EROs o interrumpir la
prolongación y minimizar la formación de productos volátiles como cetonas o aldehídos
(Shahidi & Ambigaipalan, 2015).
oocitos bovinos
Figura 2-4: Estabilización del radical fenóxi
Los antioxidantes (AH) donan átomos de hidrógeno a las EROs, producen derivados y nuevos
radicales. Estos radicales (fenóxi) tienen la capacidad de interferir nuevamente en la cadena.
Tomado de “Phenolics and polyphenolics in foods, beverages and spices: Antioxidant activity and
health effects - A review” por F. Shahidi & P. Ambigaipalan, 2015, Journal of Functional Foods.
Figura 2-5: Mecanismos de acción de los compuestos fenólicos
El electrón desapareado de este radical se ubica alrededor del anillo aromático lo que permite que
se estabilice. Tomado de “Phenolics and polyphenolics in foods, beverages and spices: Antioxidant
activity and health effects - A review” por F. Shahidi & P. Ambigaipalan, 2015, Journal of Functional
Foods.
2.7.2 Ácidos fenólicos

Los ácidos fenólicos están formados a partir de ácido hidroxicinámico e hidrocibenzóico.
El ácido gálico (Figura 2-6) es el principal acido fenólico presente en las hojas de Moringa
oleifera, previene el daño oxidativo del ADN y aumenta la actividad de las enzimas
antioxidantes (Mbemya et al., 2017).
Figura 2--6: Estructura del ácido gálico y sus derivados
Tomado de “Plant derived and dietary phenolic antioxidants: Anticancer properties” por F.F.M.
Roleira et al., 2015, Food Chemistry.
Marco teórico 17
2.7.3 Flavonoides
Los flavonoides son un grupo difenilpropano compuesto por 15 carbonos (Figura 2-7). Los
más relevantes encontrados en Moringa oleifera son kaempferol y quercetina (Lin, Zhang,
& Chen, 2018). La capacidad antioxidante de los flavonoides se atribuye a los grupos
hidroxilo, que varían en número y presencia de dobles enlaces y se unen a los anillos
aromáticos de la estructura (Lin et al., 2018; AL Juhaimi et al., 2017; Mbemya et al., 2017).
Figura 2-7: Estructura de los flavonoides.
Tomado de “Reports on in vivo and in vitro contribution of medicinal plants to improve the female
reproductive function” por G.T. Mbemya et al., 2017, Reproducao e Climaterio.
Kaempferol:
La concentración reportada en Moringa oleifera es de 1933 mg kg-1. Tiene una estructura

de difenilpropano (Figura 2-8), sintetizada de la condensación de 4-cumaroil-CoA con tres
moléculas de malonil CoA (Lin et al., 2018). Este compuesto elimina los radicales hidroxilo
cuando se encuentra en bajas concentraciones, si las concentraciones son altas aumenta
la actividad de enzimas antioxidantes (Kashyap et al., 2017).
Figura 2-8: Estructura del kaempferol
Tomado de “Kaempferol – A dietary anticancer molecule with multiple mechanisms of action: Recent
trends and advancements” por D. Kashyap et al., 2017, Journal of Functional Foods.
oocitos bovinos
Quercetina:
Quercetina es un polifenol potente que inhibe los daños celulares al quelar los iones
metálicos que permiten la formación de EROs y los elimina. La concentración de quercetina
en Moringa oleifera es de 1362 mg kg-1 (Figura 2-9) (Lin et al., 2018). Además, al evaluar
el efecto de la quercetina sobre la maduración in vitro de oocitos bovinos, se observó un
aumento de los niveles de GSH y la disminución de los niveles de EROs en los oocitos
maduros, lo que se reflejó en la mejora de la calidad y viabilidad de los embriones
producidos (J. T. Kang et al., 2016).
Figura 2-9: Estructura química de la quercetina
Tomado de “Values, properties and utility of different parts of Moringa oleifera: An overview” por Y.
Liu et al., 2018, Chinese Herbal Medicines.
2.8 Algunos estudios que involucran el extracto de

Moringa oleifera como fuente antioxidante
En estudios reportados por Tiloke et al., (2018) se encontró que Moringa oleifera inhibió la
viabilidad celular de carcinomas hepáticos, linfoblásticos, pancreáticos y de leucemia
linfoide. Además, se observó que al suministrar en cabras una dieta suplementada con sus
extractos, se obtuvo como respuesta una fuerte actividad antioxidante reflejada en la
capacidad de captación de radicales DPPH y el aumento de la actividad de las enzimas
CAT, SOD y GSH cuyos resultados fueron 0,177%, 97,8%, 86%, respectivamente,
comparados con el control 0,027%, 74,5% y 10% (Moyo, Oyedemi, Masika & Muchenje,
2012).
Por otro lado, se encontró que el extracto acuoso de Moringa oleifera en diferentes tejidos
de ratas sanas y diabéticas, aumentó significativamente la concentración de SOD, CAT y
Marco teórico 19
GPx (Jaiswal et al., 2013). En otro estudio, se reportó que el 64,3% de oocitos de ovejas
maduraron con la suplementación de 100 μg mL-1 de extracto de Moringa oleifera en
contraste con el 48% de maduración del control, además con el uso del extracto, los oocitos
expresaron altos niveles de concentración de calcio. Este efecto es positivo, ya que el
calcio actúa como promotor de la expresión del ARNm para la síntesis de proteínas
importantes en la maduración del oocito, por ejemplo, el factor promotor de la maduración
(Barakat et al., 2015).
3. Materiales y métodos
El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de química de la Universidad Nacional de
Colombia sede Palmira, en el departamento del Valle del Cauca y en el laboratorio de
biotecnología de la Universidad CES en Sabaneta, Antioquia. Debido al no uso de animales
vivos y por utilizar material proveniente de plantas de beneficio, no se requirió aval del
comité de ética.
3.1 Material vegetal

Las hojas de Moringa oleifera se clasificaron de acuerdo a su color en tres estados
fenológicos: hoja joven (verde claro brillante), hoja madura (verde oscuro) y hoja adulta
(amarilla) (Assiene Agamou, Fombang, & Mbofung, 2015; Sreelatha & Padma, 2009). El
material vegetal se recolectó en julio de 2019 en el municipio de Linares, Nariño, Colombia,
ubicado a 1500 m.s.n.m. con temperatura promedio de 22°C y precipitación de 1300 mm
anuales. Las hojas se lavaron con agua destilada con el fin de eliminar residuos e
impurezas, se secaron en horno a 40°C, se molieron a un tamaño de partícula <1 mm y se
almacenaron a temperatura ambiente hasta su uso. Como control se utilizó hojas de té
verde (Camellia Sinenesis) de origen comercial.
3.2 Obtención del extracto de hojas de Moringa oleifera

El extracto de las hojas de Moringa oleifera se realizó en el laboratorio de química de la
Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, de acuerdo con la metodología usada
por Torres C., Colmenares D., & Isaza M., (2013), con algunas modificaciones. Se pesaron
200 mg de cada muestra seca (Tabla 3-1), se les agregó una mezcla de cloroformo-
metanol-agua (2:1:1) y luego de agitarlas en vortex se ultrasonificaron durante 10 minutos
(Branson 2510). Finalmente, se centrifugaron a 7000 rpm durante 5 minutos y se separó
22 Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de oocitos
bovinos
la fracción metanol-agua de la fracción clorofórmica. Este procedimiento se realizó tres

veces consecutivas. Los extractos obtenidos se secaron a 40°C en horno y se almacenaron
a -4°C hasta su uso.
Tabla 3-1: Muestras utilizadas para la obtención de los extractos.

No. Muestra
TV Hojas Té verde comercial
(Camellia Sinensis)
HJ Hoja joven
HM Hoja madura
HA Hoja adulta
3.3 Fraccionamiento del extracto

Este procedimiento se realizó con base en la metodología propuesta por Bajpai, Majumder,
& Park, (2016) con algunas modificaciones. La porción metanol-agua de cada muestra se
fraccionó mediante cromatografía en columna abierta. En una columna de vidrio en forma
de cilindro se depositó, como fase estacionaria, resina (Diaion HP20) en una proporción
30:1 con respecto al extracto, y como fase móvil se utilizó agua destilada y metanol. En
primer lugar, se activó la resina con metanol y agua destilada. Posteriormente, se depositó
el extracto diluido en la parte superior de la columna, se agregó agua destilada para la
separación de azúcares y metanol para la separación de compuestos fenólicos. Por último,
la porción metanólica se recuperó, se secó en horno a 40°C y se almacenó a -4°C hasta
su uso.
3.4 Preparación muestra de trabajo

Se diluyeron 10 mg de muestra seca en 1 mL de agua destilada (solución patrón) y
posteriormente se hizo una disolución 1 a 20 para obtener la muestra de trabajo. Este
procedimiento se realizó con cada una de las muestras.
3.5 Análisis fitoquímico preliminar

Después de obtener los extractos, se estimó la presencia de compuestos fitoquímicos con
base en pruebas cualitativas estandarizadas. Se estimó la presencia de esteroides,
Materiales y métodos 23
terpenoides, saponinas, fenoles totales, flavonoides, taninos condensados, taninos

hidrolizables, cumarinas y glúcidos cardiotónicos. Las pruebas se realizaron en tubos de
ensayo siguiendo la metodología descrita por Alamgir, (2018); Torres C., Colmenares D.,
& Isaza M., (2013) y Cai, Shi, & Gao, (2011).
3.5.1 Determinación de terpenoides y esteroides

Prueba de Salkowski
Se diluyeron 100 μL de la fracción clorofórmica en 500 μL de cloroformo. Posteriormente

se le agregó 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. La presencia de esteroides se determinó
con la formación de color amarillo o rojo.
Prueba de Lieberman-Bouchard
Para determinar la presencia de esteroides y terpenos se diluyeron 100 μL de la fracción
clorofórmica en 500 μL de cloroformo. Luego, se añadieron tres gotas de anhídrido acético
y una gota de ácido sulfúrico concentrado. El cambio a color azul verde indicó la presencia
de esteroides y terpenos.
Saponinas
Para la evaluación de saponinas se disolvieron 200 μL de la fracción acuosa en 1 mL de
agua. Posteriormente, se agitó vigorosamente durante 30 segundos y la ausencia de
espuma persistente indicó la ausencia de saponinas.
3.5.2 Determinación de Fenoles totales

Prueba del cloruro férrico
Se diluyeron 100 μL de la fracción acuosa del extracto en 1 mL de agua, se añadieron dos
gotas de solución acuosa de cloruro férrico al 1%. La formación de color verde indicó la
presencia de compuestos fenólicos.
Prueba de Folin-Ciocalteu
Se mezclaron 100 μL de la fracción acuosa con 1 mL de agua destilada, se agregaron 50
μL de reactivo Folin-Ciocalteu y 100 μL de carbonato de sodio al 20%. El cambio a color a
azul oscuro indicó la presencia de compuestos fenólicos.
bovinos
3.5.3 Determinación de Flavonoides

Prueba de Shinoda
Se disolvieron 200 μL de la fracción acuosa en 300 μL de etanol. Se agregó una tira de

magnesio y tres gotas de ácido clorhídrico concentrado. Una coloración roja reveló la
presencia de flavonoides.
3.5.4 Determinación de Taninos

Taninos condensados
En un tubo de ensayo se agregó 200 μL de la fracción acuosa, 500 μL de n-butanol y tres

gotas de HCl concentrado. El tubo se calentó durante varios minutos y la ausencia de
coloración rojiza indicó que la prueba fue negativa.
Taninos hidrolizables
Se disolvieron 200 μL de la fracción acuosa en 1 mL de metanol, posteriormente, se agregó

1 mL de una mezcla etanol:AcOH (ácido acético) (1:1) y 10 mg de nitrito de sodio. La
ausencia de color rojo indicó que la prueba fue negativa.
3.5.5 Determinación de Cumarinas

Se disolvieron 200 μL de la fracción acuosa en 1 mL de metanol y se adicionó 1 lenteja de
KOH. La formación de color amarillo indicó presencia de cumarinas.
3.5.6 Determinación de Glúcidos cardiotónicos

Se mezclaron 200 μL de extracto acuoso con tres gotas de ácido 3,5-dinitro benzóico al
2% y tres gotas de KOH al 6%. La formación de color rojizo indicó presencia de glúcidos.
3.6 Determinación colorimétrica a microescala de

compuestos fenólicos
A cada muestra por triplicado, se le realizó la determinación colorimétrica de fenoles por
espectrofotometría con la metodología de microplaca de 96 pozos de acuerdo con Wu, Li,
Chen, Wang, & Lin, (2020). Las lecturas se realizaron con un lector de placas (Biotek
Lx800) y el software Gen 5TM (versión 3.02.1).
3.6.1 Contenido total de fenoles (CTF)

El contenido total de fenoles se determinó de acuerdo con la metodología de Oboh,
Olubode, Oyetomi, & Adewuni (2018), con el método de Folin-Ciocalteu y algunas
modificaciones. Se tomaron 60 µl de muestra de trabajo, 60 µl de reactivo Folin-Ciocalteu
diluido 1:5 (v/v) y 180 µl de disolución de carbonato de sodio 0,17 N. La mezcla se incubó
a 60° durante 45 minutos y la absorbancia fue leída a 750 nm. Como estándar se utilizó
ácido gálico (AG) y los resultados se expresaron en mg equivalentes de AG por gramo de
extracto seco (ES) (mg EAG g-1 ES).
3.6.2 Contenido de Flavonoides Totales (CFT)

El contenido de flavonoides se determinó con base a la metodología de Braham et al.,
(2019) con algunas modificaciones. Se utilizaron 100 µl de muestra de trabajo y 100 µl de
solución de tricloruro de aluminio al 2%. La absorbancia fue leída a 405 nm y los resultados
se expresaron en mg equivalentes de rutina por gramo de ES (mg ER g-1 ES).
3.6.3 Contenido total de catequinas (CTC)

El contenido de catequinas se determinó de acuerdo con el método de vainillina. Se
utilizaron 100 µl de muestra de trabajo mezclada con 100 µl de vainillina a 15000 ppm en
metanol y 100 µl de ácido sulfúrico al 30% (v/v) en metanol. La mezcla se incubó a 30°C
por 10 minutos y la lectura se realizó a 515 nm. Los resultados se expresaron en mg
equivalentes de hidrato de catequina por gramo de ES (mg EHC g-1 ES) (Hong et al., 2014;
Sun, Ricardo-da-Silva, & Spranger, 1998).
3.7 Determinación de la actividad antioxidante
3.7.1 Método radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picril hidrazilo)

DPPH es un método utilizado para evaluar la actividad de eliminación del radical DPPH a
través de la disminución del color. En este método el antioxidante neutraliza los radicales
a través de la trasferencia de electrones o átomos de hidrógeno (Mwamatope, Tembo,
bovinos
Chikowe, Kampira, & Nyirenda, 2020; Hamed et al., 2019; Foti, 2015). Esta evaluación se
realizó según la metodología de Vázquez-León et al., (2017) con algunas modificaciones.
Se utilizaron 60 µl de muestra de trabajo y 140 µl de dilución de DPPH a una concentración
de 100 ppm. La mezcla se incubó a temperatura ambiente, en un lugar oscuro durante 30
minutos y se leyó a 515 nm. El resultado se expresó en µmoles equivalentes de trolox por
gramo de ES (µmol ET g-1 ES). Los resultados para los extractos de Moringa oleifera
también fueron expresados como IC50 y se utilizaron los estándares trolox y quercetina
como control. El IC50 se refiere a la concentración necesaria de antioxidante para disminuir
el 50% de la concentración de DPPH (Antolovich, Prenzler, Patsalides, McDonald, &
Robards, 2002).
3.7.2 Método potencial antioxidante reductor férrico (FRAP)

El método FRAP consiste en la reacción redox que ocurre entre la sustancia antioxidante
y los iones Fe3+ a través de la trasferencia de electrones y se determina de acuerdo al
cambio de color (Martins et al., 2013). Esta evaluación se realizó con base a la metodología
propuesto por Braham et al., (2019) con algunas modificaciones. El reactivo FRAP se
preparó mezclando 10 mL de disolución de buffer acetato a una concentración de 300 mM,
1 mL de disolución 10 mM de TPTZ (2,4,6 Tris(2-pyridyl)-s-triazine; C18H12N6; MW
312,53) en 40 mM de HCl y 1 mL de disolución 20 mM de tricloruro férrico (FeCL3). Se
utilizaron 60 µl de muestra, 180 µl de agua destilada y 60 µl de reactivo FRAP. La mezcla
se incubó a temperatura ambiente, en oscuridad por 30 minutos y se realizó la lectura a
630 nm. Los resultados se expresaron en mmol de ion ferroso por gramo de ES (mmolFe 2+
g-1 ES).
3.7.3 Método capacidad antioxidante equivalente a trolox o ABTS

(ácido 2, 2-azinobis, 3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico)
El método ABTS consiste en determinar la actividad de reducción de los radicales ABTS a
través de la transferencia de electrones y átomos de hidrógeno, y se determina por
decoloración (Mwamatope, Tembo, Chikowe, Kampira, & Nyirenda, 2020; Hamed et al.,
2019). La actividad antioxidante de las muestras se determinó siguiendo la metodología
reportada por Farooq & Koul, (2019) con algunas modificaciones y con el uso de trolox
(ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetramethilchroman-2-carboxilico) como estándar. Se preparó una
disolución de 7 mM de ABTS y 2,45 mM de peroxodisulfato (disolución stock). La disolución

de trabajo se obtuvo diluyendo 1:50 la disolución stock. En la determinación de la actividad
antioxidante por el método ABTS se utilizaron 60 µl de muestra y 240 µl de solución ABTS.
La lectura se hizo a 750 nm y los resultados se expresaron en mmol equivalentes de trolox
por gramo de ES (mmol ET g-1 ES).
3.8 Evaluación del extracto para uso en PIVE
3.8.1 Obtención del extracto y preparación para PIVE

Para realizar esta extracción se utilizaron 100g de hoja madura de Moringa oleifera, se
secó a 40° y se molió a un tamaño de partícula < 1 mm. Este procedimiento se realizó en
tres pasos. En primer lugar, se realizó la extracción con cloroformo, se agregó dos veces
el volumen del sólido (aprox. 800 mL) y se ultrasonificó durante 10 minutos, posteriormente
se filtró. Este proceso se llevó a cabo cuatro veces. En segundo lugar, se realizó la
extracción con metanol, igualmente, se ultrasonificó durante 10 minutos, se filtró y se
concentró el extracto usando el rotavaporador (Hei-VAP Precision) a 40°C y 337 mbar de
presión. Por último, se realizó una extracción liquido-liquido, en donde se utilizó un embudo
de separación y una mezcla compuesta por metanol-agua-cloroformo en una proporción
1:1:2, el cloroformo se agregó por secciones y se separó por decantación. El extracto
acuoso se rotavaporó y se fraccionó de acuerdo a la metodología de Bajpai et al., (2016)
con pequeñas modificaciones. El extracto se secó en horno a 40°C y se almacenó a 4°C
hasta su uso. Por último, se preparó una solución stock a una concentración de 10 mg
mL-1 en medio de maduración TCM-199 y se almacenó en alícuotas de 10 μL a -20°C para
evitar alteraciones en la composición y osmolaridad del medio.
3.8.2 Recolección de ovarios

Los ovarios se obtuvieron de hembras en ciclo reproductivo durante el faenado en la
Central Ganadera de Medellín, Antioquia. Como criterio de selección de los ovarios se
definió que estos no tuvieran cuerpo lúteo. Una vez recuperados, se depositaron en
solución salina fisiológica estéril (0.9% NaCl) a 30-32°C y se llevaron al laboratorio de
biotecnología de la Universidad CES sede Sabaneta. El tiempo entre la recolección y la
aspiración del material fue de aproximadamente tres horas.
bovinos
3.8.3 Aspiración folicular y obtención de oocitos

En el laboratorio, los ovarios se lavaron nuevamente con solución salina y se colocaron en
baño María a 32°C. Posteriormente, se aspiraron los folículos con diámetro entre 3 a 8 mm
con una aguja hipodérmica calibre 18 G y una jeringa de 10 mL. El líquido folicular
recuperado se depositó en tubos estériles de 50 mL puestos en baño María.
Una vez terminado el proceso de aspiración, el líquido folicular se dejó decantar durante
15 min para facilitar la recuperación de los oocitos, estos se depositaron en una caja Petri
de 100x15 mm con medio de selección (Solución salina fosfatada modificada, PBSm,
suplementado con BSA).
La selección de los oocitos se realizó con estéreomicroscopio y se seleccionaron

complejos cúmulo-oocitos (CCOs) tipo 1 y 2, según la metodología clásica (Sovernigo et
al., 2017), los cuales tienen múltiples capas compactas de células del cúmulo (>3),
citoplasma homogéneo y potencial para ser sometidos a procesos de fertilización in vitro.
Posteriormente, los CCOs se lavaron en medio de selección y por último en medio de
maduración (Rodrigues-Cunha et al., 2016).
3.8.4 Maduración in vitro (MIV)

Los CCOs seleccionados se incubaron en medio de maduración TCM 199 con sales
Earle’s (GIBCO), suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB), 0,2 mM de Piruvato de
sodio, 1 μg mL-1 de hormona folículo estimulante (FSH), 5 ng mL -1 de Factor de crecimiento
epidérmico (EGF), y solución antibiótica 1X sigma (penicilina 100 UI mL -1, estreptomicina
100 mg mL-1, anfotericina B 0,25 mg mL-1) (Madrid Gaviria, López Herrera, Urrego,
Restrepo Betancur, & Echeverri Zuluaga, 2019). Basados en el estudio realizado por
Barakat et al., (2015), el medio de maduración se suplementó con tres diferentes
concentraciones de extracto de Moringa oleifera 50 (M1), 100 (M2) y 150 (M3) μg mL-1.
Como control positivo se utilizó ácido ascórbico a una concentración de 50 μg mL-1 (AA)
(Nohalez et al., 2018; Kere, Siriboon, Lo, Nguyen, & Ju, 2013) y como control negativo el
medio sin extracto de Moringa oleifera (C, Control-) (Tabla 3-2). El ácido ascórbico se
considera un compuesto idóneo para ser utilizado como control positivo debido a que es
un antioxidante natural, hidrosoluble, ampliamente estudiado y con reportes de
propiedades beneficiosas en cuanto a su actividad reductora y protectora durante la PIVE

(Nohalez et al., 2018; Kere et al., 2013).
Para cada tratamiento se usó una caja Petri de 30 mm con múltiples gotas de 70 μL de
medio de maduración cubiertas con aceite mineral. En cada gota se distribuyó entre 10 y
15 CCOs y se incubaron entre 22 a 24 horas en una atmosfera de 38,5°C, 5% de CO2 en
aire con una humedad relativa de 90%.
Tabla 3-2: Grupos experimentales

Tratamientos Concentraciones
C Sin Extracto
AA 50 μg mL-1
M1 50 μg mL-1 de extracto
3.8.5 Fertilización in vitro (FIV)

Transcurrido el tiempo de maduración in vitro, los CCOs se transfirieron a gotas de 50 L
de medio de fertilización TALP (2 mM CaCl2.2H2O, 3,2 mM KCl, 0,5 mM MgCl2.6H2O, 0,4
mM NaH2PO4.H2O, 11 mM ácido láctico, 114 mM NaCl y 25 mM NaHCO 3) suplementado
con 6 mg mL-1 de BSA-EFAF, 0,2 mM de piruvato de sodio, 10 μg ml-1 de heparina, 20 μM
de D-penicilina, 10 μM de hipotaurina, 1 μM de epinefrina y solución antibiótica 1X (Madrid
Gaviria, López Herrera, Urrego, et al., 2019).
Se utilizó semen proveniente del mismo ejemplar y el mismo lote, perteneciente al banco
de semen de la Universidad CES, con fertilidad comprobada para fertilización in vitro. El
semen se descongeló a 37°C durante 60 segundos y se seleccionaron los
espermatozoides viables y móviles por medio del gradiente de densidad discontinuo All
Grad (45% y 90%). El gradiente se centrifugó a 700g en una centrífuga (MiniSpin®) durante
10 minutos, el pellet resultante se resuspendió en 500 μL de medio de fertilización y se
centrifugó nuevamente durante 5 minutos (Oseikria et al., 2016). Posteriormente, se ajustó
a una concentración final de 2x10 6 espermatozoides mL-1 en medio de fertilización, y se
incubó con los CCOs durante 18-20 horas a 38.5ºC, bajo una atmosfera de 5% CO 2 en
aire y 90% de humedad relativa.
bovinos
3.8.6 Cultivo in vitro (CIV)

Una vez transcurrido el tiempo de fertilización, se denudaron los presuntos cigotos y se
trasladaron a gotas de 70 μL de medio de cultivo SOF (Synthetic Oviductal Fluid)
suplementado con 5% de SFB, 0,2 mM de piruvato, 30 μL mL-1 de aminoácidos esenciales
(BME) y 1 μL mL-1 de aminoácidos no esenciales (MEM) (SIGMA), 5 mg mL -1 de BSA-
EFAF y solución antibiótica 1X y se incubaron a 38.5°C, 5% de CO 2 y 90% de humedad
relativa (Madrid Gaviria, López Herrera, Urrego, et al., 2019).
El día 3 post inseminación (pi), se determinó la tasa de clivaje, se retiraron las estructuras
no fecundadas y se realizó el recambio parcial del medio (40 μL) por nuevo medio de
cultivo. El día 6 pi se realizó nuevamente el recambio parcial del medio. La tasa de
blastocistos totales se evaluó el día 7 y 8 pi, esta evaluación consistió en la clasificación y
conteo de los blastocistos en la etapa de blastocisto inicial (Bi), blastocisto (BL), blastocisto
expandido (Bx), blastocisto iniciando eclosión (Bh) y blastocisto eclosionado (Be) (Bó &
Mapletoft, 2014).
3.8.7 Evaluación de la maduración nuclear

La maduración nuclear de los oocitos se realizó con base en el protocolo descrito por Coy
et al., 2008. Los CCOs maduros se denudaron, se fijaron por 15 minutos en 0,5% de
glutaraldehído en PBS a temperatura ambiente, se lavaron en PBS durante 5 minutos y se
incubaron en solución de tinción Hoechst 33342 (5 μg mL -1 en PBS) durante 15 minutos.
La maduración nuclear se observó en un microscopio de epifluorescencia (NIKON
OPTIPHOT-2) con filtro UV (longitud de emisión 455 nm y excitación 352 nm) y se
clasificaron los estadios nucleares como vesícula germinal (VG), metafase I (MI) o
metafase II (MII).
3.8.8 Evaluación de los niveles de EROs y GSH intracelulares

La determinación de la producción de EROs y GSH en oocitos maduros por fluorescencia
se determinó como fue descrito previamente por Mukherjee et al., (2014). Los CCOs
maduros se incubaron durante 15 minutos en 10 μM de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína
diacetato (H 2DCFDA, Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA), para la evaluación de
la producción de EROs y en 10 μM de 4-clorometil-6,8-difluoro-7-hidroxicumarin (Cell
tracker blue; CMF2HC; Invitrogen Corporation) para la producción de GSH.

Posteriormente, se lavaron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)
y se observaron en el microscopio de epifluorescencia (NIKON OPTIPHOT-2) con filtro UV
(longitud de emisión 517 y 450 nm y excitación 495 y 358 nm para EROs y GSH
respectivamente) (Mukherjee et al., 2014). Se tomaron registros de las imágenes digitales
con la cámara para microscopio OCS-SK2-5.2x (OptixCam), usando siempre parámetros
de configuración estandarizados, se guardaron como archivos gráficos (formato TIFF) y se
evaluó la intensidad de la fluorescencia de ambos fluorocromos en el software ImageJ 1.50
(National Institutes of Health, USA). De esta manera se obtuvo un valor promedio de
intensidad de fluorescencia emitida para cada oocito. “Los niveles de fluorescencia
detectados por H2DCFDA dependen de la actividad de la esterasa; por lo tanto, la relación
entre el brillo de cada oocito medido por H 2DCFDA y la media del brillo detectado por el
diacetato de fluoresceína (FDA) en cada tratamiento se consideró un mejor indicador de
los niveles de EROs en cada oocito” (Alvarez et al., 2015; Morado, Cetica, Beconi, & Dalvit,
2009).
3.8.9 Evaluación de la calidad embrionaria

Para esta evaluación se utilizaron blastocistos expandidos de día 7 y 8. Los blastocistos
se fijaron en una solución de glutaraldehído al 0,5% durante 15 minutos, posteriormente
se lavaron en 500 μL de PBS durante 5 minutos y por último se transfirieron a la solución
de tinción de Hoechst 33342 (5 mg mL-1 en PBS) por 15 minutos. Los blastocistos fijados
se montaron en un portaobjetos en solución mounting (PBS, glicerol y solución Hoechst),
se colocó sobre ellos un cubreobjetos y por último se visualizaron en un microscopio de
epifluorescencia (NIKON OPTIPHOT-2) con filtro UV (longitud de emisión 455 nm y
excitación 352 nm) a un aumento de 40X. Se realizó el conteo celular de cada uno de los
blastocistos utilizando el software ImageJ 1.50 (National Institutes of Health, USA)
directamente en las imágenes digitales capturadas con la cámara para microscopio OCS-
SK2-5.2x (OptixCam) (Velez et al., 2017).
bovinos
3.9 Análisis estadístico
3.9.1 Extracción y análisis de extractos

El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) en el software
estadístico Infostat (versión 2018) (Grupo InfoStat, Universidad Nacional de Córdoba,
Argentina). Los datos que mostraron diferencias significativas se sometieron a análisis de
comparación de medias mediante la prueba de Duncan con una significancia de 0,05.
3.9.2 Evaluaciones correspondientes a la PIVE

Los datos obtenidos fueron procesados en el software estadístico Infostat. Para los análisis
correspondientes a la evaluación de la tasa de maduración nuclear, niveles de EROs y
GSH intracelulares, tasa de desarrollo y calidad embrionaria se verificó la normalidad a
través de la prueba de Shapiro Willks, la cual indicó que las variables no se distribuían
normalmente (p <0.0001). Posteriormente, se realizó el análisis no paramétrico Kruskal
Wallis y para los datos que mostraron diferencia estadística significativa (p<0,05), se
realizó un contraste pareado.
Tabla 3-3: Tabla descriptiva de los tratamientos y análisis realizados en la PIVE

Variables dependientes
Tratamientos
Tasa de
Niveles de Niveles de Tasa de Celularidad
maduración
EROs GSH blastocistos embrionaria
nuclear
N=161 Rep. N=109 Rep. N=111 Rep. N=930 Rep. N=135 Rep.
C 34 3 21 3 26 3 200 5 35 5
AA 18 3 15 3 18 3 162 5 25 5
M1 42 3 24 3 23 3 202 3 31 5
M2 33 3 33 3 30 3 180 4 18 5
M3 34 3 16 3 14 3 186 5 26 5
4. Resultados
4.1 Análisis fitoquímico preliminar

Los resultados preliminares del análisis en los tres estados fenológicos de la hoja, indicaron
presencia de terpenoides y esteroides, fenoles, flavonoides, cumarinas y determinación
inconclusa de glúcidos cardiotónicos (Tabla 4-1).
Tabla 4-1: Análisis preliminar de compuestos fitoquímicos presentes en el extracto de

hojas de Moringa oleifera en tres estados fenológicos.
Terpenoides Taninos Taninos Glúcidos

M Saponinas Fenoles Flavonoides Cumarinas
y esteroides Condensados Hidrosolubles Cardiotónicos
HJ + - ++ ++ - - + +/-
HM + - ++ ++ - - + +/-
HA + - ++ ++ - - + +/-
++ Francamente positivo, + Positivo, +/- Dudoso, - Negativo.

M: muestra, HJ: Hoja joven, HM: Hoja madura, HA: Hoja adulta
4.2 Contenido de compuestos fenólicos

La evaluación del contenido de compuestos fenólicos arrojó diferencia significativa
(p<0,05) para fenoles, flavonoides y catequinas (Tabla 4-2). El contenido de fenoles fue
mayor en el control positivo (146,31 ± 1,8 mgEAG g-1 ES), seguido por el extracto de hoja
madura (114,50 ± 4,5 mgEAG g-1 ES) y hoja joven (109,52 ± 3,1 mgEAG g-1 ES). El
contenido de flavonoides de la hoja madura fue significativamente mayor (256,14 ± 4,8
mgER g-1 ES) a las demás muestras y el contenido de catequinas del té verde (49,21 ± 2,7
mgEHC g-1 ES) fue estadísticamente diferente a los extractos de Moringa oleifera. Los
datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM).
bovinos
Tabla 4-2: Contenido de fenoles, flavonoles y catequinas totales presentes en el

extracto de hojas de Moringa oleifera en tres estados fenológicos y en té verde como
control.
Fenoles Flavonoides Catequinas

Muestras
(mgEAG g-1 ES) (mgER g-1 ES) (mgEHC g-1 ES)
TV 146,31 ± 1,8 a 28,88 ± 0,34 d 49,21 ± 2,7 a

HJ 109,52 ± 3,1 b 190,54 ± 3 b 18,04 ± 5,5 b
HM 114,50 ± 4,5 b 256,14 ± 4,8 a 18,28 ± 3,3 b
HA 81,14 ± 1,9 c 98,87 ± 1,6 c 20,66 ±3,3 b
TV: té verde, HJ: Hoja joven, HM: Hoja madura, HA: Hoja adulta, EAG: equivalente de ácido gálico,
ER: equivalente de rutina, EHC: equivalente de hidrato de catequina. Letras diferentes en la misma
columna indicaron diferencia significativa (p<0,05).
4.3 Actividad antioxidante

La evaluación de la actividad antioxidante mostró diferencias significativas para DPPH en
la hoja joven y madura, y para FRAP y ABTS en la hoja madura (p<0,05). Los resultados
se muestran en la tabla 4-3. Los datos se expresan como media ± error estándar de la
media.
Tabla 4-3: Evaluación de la actividad antioxidante del extracto de hojas de Moringa

oleifera por los métodos de DPPH, FRAP y ABTS.
DPPH FRAP ABTS

Muestra
(µmolesET g-1 ES) (µmoles Fe2+ g-1 ES) (µmolesET g-1 ES)
TV 254,86 ± 1,2 c 612,74 ± 5,2 d 81,72 ± 0,1 d

HJ 1127,07 ± 10 a 2232,95 ± 23,2 b 373,37 ± 0,8 c
a a
HM 1140,69 ± 59 2923,09 ± 65,3 532,5 ± 28 a
HA 557,79 ± 51,35 b 1784,65 ± 54,4 c 422,02 ± 0,71 b
ET: equivalente de trolox, ES: extracto seco. Letras diferentes en la misma columna indicaron
diferencia significativa (p<0,05).
Resultados 35
En la figura 4-1 se muestra el IC50 de DPPH de los extractos de Moringa oleifera, en donde
se observa que la hoja madura es la que menor concentración requiere para inhibir el 50%
del radical DPPH (108,7 ± 7,7 mg L-1), seguida por la hoja joven (112,1± 7,1 mg L -1) y adulta
(216,5 ± 8,3 mg L-1). Sin embargo, los estándares (trolox y quercetina) muestran el mismo
efecto a concentraciones más bajas.
Figura 4-1: Actividad antioxidante de las hojas de Moringa oleifera en tres estados
fenológicos expresada como IC50 (mg L-1) de DPPH.
IC50 DPPH
250
216,5
200
150
mg L-1
112,1 108,7
100
50 27,8
12
0
Trolox Quercetina HJ HM HA
Muestra
HJ: Hoja joven, HM: Hoja madura, HA: Hoja adulta (trolox y quercetina como estándar) .
4.4 Contenido de fenoles totales y actividad antioxidante

del extracto utilizado en PIVE
La tabla 4-4 muestra el contenido total de fenoles y la actividad antioxidante del extracto
de hoja madura de Moringa oleifera utilizado en las evaluaciones de PIVE. Se observa que
tanto la concentración de fenoles y la actividad antioxidante disminuyen en comparación
con las evaluaciones realizadas previamente.
bovinos
Tabla 4-4: Contenido total de fenoles y actividad antioxidante de extracto de hoja

madura de Moringa oleifera utilizado en PIVE.
Fenoles DPPH FRAP ABTS

(mgEAG g-1 ES) (µmolesET g-1 ES) (µmoles Fe2+ g-1 ES) (µmolesET g-1 ES)
92,72 ± 0,5 1001,3 ± 3,2 910,808 ± 15,5 860,77 ± 0,1

ET, equivalente a trolox; ES, extracto seco
4.5 Maduración nuclear

No se encontraron diferencias significativas entre tratamientos (p>0,05) en los parámetros
de maduración nuclear evaluados (VG, MI, MII). Sin embargo, en MII el tratamiento con
mayor porcentaje de oocitos maduros fue AA (87,78 ± 6,2%), seguido por M1 (82,12 ± 5,8)
y M3 (82,96 ± 3). La Tabla 4-5, muestra el estadio nuclear de los oocitos sometidos a MIV
con la suplementación de 50, 100 y 150 μg ml-1 de extracto de Moringa oleifera (M1, M2 y
M3, respectivamente), 50 μg ml-1 de ácido ascórbico (AA) y sin extracto de Moringa oleifera
(control, C).
Tabla 4-5: Efecto de la suplementación con extracto de Moringa oleifera, ácido

ascórbico y control sobre la maduración nuclear de oocitos bovinos.
Oocitos VG (%) M I (%) M II (%) Ranks

Tratamiento
N=161 n (media ± SEM) n (media ± SEM) n (media ± SEM)
C 34 0 8 (26,98 ± 7,4) 26 (73,02 ± 7,4) 6,67
AA 18 0 2 (12,22 ± 6,2) 16 (87,78 ± 6,2) 11,33
M1 42 1 (3,03 ± 3,0) 7 (14,85 ± 6,5) 34 (82,12 ± 5,8) 9,67
M2 33 1 (3,7± 3,7) 12 (37,73 ± 3,8) 20 (58,56 ± 7,3) 2,67
M3 34 0 6 (17,04 ± 3,0) 28 (82,96 ± 3,0) 9,67
p-valor 0,5188 0,1153 0,1315
VG, vesícula germinal; MI: metafase I; MII: metafase II; Ranks: posición.
Resultados 37
4.6 Niveles de EROs y GSH

Los niveles de fluorescencia de las EROs se redujeron significativamente (p<0,05) con la
suplementación de extracto de Moringa oleifera (M1:0,52 ± 0,09; M2: 0,51 ± 0,09; M3: 0,43
± 0,1), en comparación con AA y C, mientras que entre los controles no hubo diferencia
estadística (0,81 ± 0,09 y 1 ± 0,1, respectivamente).
En cuanto a los niveles de GSH, fueron reducidos significativamente cuando se

suplementó con 100 μg mL-1 y 150 μg mL-1 de extracto (0,59 ± 0,07 y 0,41 ± 0,04,
respectivamente) con respecto al control (1 ± 0,08) y AA (0,93 ± 0,07). La figura 4-2
muestra los niveles de fluorescencia de EROs y GSH en oocitos madurados con cada
tratamiento y en la figura 4-3 se ilustra la fluorescencia de las sondas H2DCFDA y Cell
tracker blue en cada tratamiento.
Figura 4-2: Niveles de fluorescencia de EROs y GSH en oocitos bovinos madurados in

vitro con extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control.
1,20 a
a
a
1,00 a
ab
Pixeles oocito-1
0,80
bc
b b
0,60 b
c
0,40
0,20
0,00
C AA M1 M2 M3
EROS GSH
Concentraciones de extracto de Moringa oleifera: 50 μg ml-1 (M1), 100 μg ml-1 (M2) y 150 μg ml-1
(M3). Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p<0,05).
bovinos
Figura 4-3: Niveles de fluorescencia de la sonda H2DCFDA para niveles de EROs y la

sonda Cell tracker blue para GSH intracelular en oocitos bovinos madurados in vitro con
extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control.
Sonda Cell tracker

Sonda H2DCFDA para blue para niveles de
Tratamiento
niveles de EROs GSH
AA
M1
M2
M3
4.7 Tasa de clivaje y blastocistos

En la tasa de clivaje y de blastocistos, no se observó diferencia significativa. No obstante,
el tratamiento M3 mostró tendencia a mejores resultados en la tasa de clivaje (85,32 ± 3,0)
y en la tasa de blastocistos del día 8 (47,90 ± 5,3). Similares resultados se obtuvieron en
el control (47,61 ± 4,7) para la tasa de blastocistos del día 8 (Tabla 4-6).
Resultados 39
Tabla 4-6: Efecto de la suplementación del medio de maduración con extracto de

Moringa oleifera, sobre la tasa de clivaje y la tasa de blastocistos derivados de oocitos
bovinos.
Tratamiento
Tasa de Tasa de
Oocitos Clivaje 48hpi (%) blastocistos día blastocistos día
Ranks Ranks Ranks
N=930 n (media ± SEM) 7 (%) 8 (%)
n (media ± SEM) n (media ± SEM)
C 200 153 (76,49 ± 2,5) 30,63 83(40,97 ± 5,2) 44,41 93 (47,61 ± 4,7) 44,56
AA 162 119 (74,25 ± 4,6) 31,54 55 (35,15 ± 4,1) 35,88 60 (37,79 ± 4,4) 34,77
M1 202 162 (80,20 ± 2,3) 37,23 72 (34,42 ± 3,6) 36,33 73 (34,91 ± 3,6) 30,93
M2 180 142 (79,61 ± 4,2) 38,71 50 (28,84 ± 3,9) 27,50 58 (32,66 ± 4,2) 28,07
M3 186 159 (85,32 ± 3,0) 46,70 69 (37,0 ± 4,0) 39,60 91 (47,90 ± 5,3) 45,27
p-valor 0,2349 0,2827 0,0852
Ranks: posición
4.8 Número total de células en blastocistos

No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos. El tratamiento con mayor
número de células por blastocisto fue AA (105,55 ± 5,6), seguido por M2 (104,85 ± 3,3) y
control (103,57 ± 2,9) como se presenta en la tabla 4-7.
Tabla 4-7: Número total de células en blastocistos bovinos producidos in vitro con la
suplementación de extracto de Moringa oleifera, ácido ascórbico y control, en el medio de
maduración.
Blastocistos No. total de células

Tratamiento
N=135 (media ± SEM)
C 35 103,57 ± 2,9
AA 25 105,55 ± 5,6
M1 31 102,33 ± 7,1
M2 18 104,85 ± 3,3
M3 26 102,6 ± 5,3
p-valor 0,9842
5. Discusión
Moringa oleifera es una planta con alto potencial medicinal, de ella se reportan múltiples
beneficios que podrían atribuirse al contenido de fenoles y que le confieren actividad
antioxidante como protección contra el daño oxidativo (Braham et al., 2019). En este
sentido, se han evaluado todos los componentes morfológicos de esta planta,
evidenciando que las hojas tienen la mayor concentración de compuestos fenólicos
(Prabakaran et al., 2018). Por esto, fue relevante estudiar en qué etapa de madurez de las
hojas (estado fenológico), el contenido de estos compuestos era mayor.
Se obtuvieron los extractos de hojas de Moringa oleifera en tres estados fenológicos y se

realizó la evaluación del contenido de compuestos fenólicos, esta evaluación consistió en
un análisis fitoquímico preliminar por métodos cualitativos y en la determinación
colorimétrica del contenido de compuestos fenólicos y la actividad antioxidante. De
acuerdo con un reporte el contenido de fenoles y la actividad antioxidante en hojas
maduras mostro valores más altos que en hojas jóvenes (Sreelatha & Padma, 2009),
resultados que concuerdan con los de este estudio. En el análisis fitoquímico preliminar se
encontró que el extracto de Moringa oleifera contiene terpenoides, esteroles, fenoles,
flavonoides, cumarinas y glúcidos cardiotónicos. Estos resultados coinciden parcialmente
con otros autores que además, encontraron presencia de saponinas, taninos y alcaloides
en bajas concentraciones (Aremu et al., 2018; Idoga, Ambali, Ayo, & Mohammed, 2018).
El extracto de hojas de té verde comercial fue usado como control durante el proceso de
extracción y determinación de la actividad antioxidante, debido a que su composición
fitoquímica es ampliamente estudiada y en la literatura se reportan contenidos altos de
compuestos fenólicos, principalmente catequinas, que le otorgan capacidades biológicas
como antioxidante, bactericida y de protección celular (Souza et al., 2020; Anand,
Upadhyaya, Rawat, & Rai, 2015).
bovinos
Las variaciones observadas en las concentraciones de compuestos fenólicos del material

vegetal evaluado con respecto a otros estudios, pueden deberse a diferencias climáticas,
tipos de suelo, condiciones del cultivo, prácticas agrícolas, madurez, edad de los árboles,
secado, métodos de extracción o almacenamiento y variabilidad analítica (Abdel Fattah,
Sobhy, Reda, & Abdelrazek, 2020; Akorede et al., 2020; Vázquez-León et al., 2017;
Sreelatha & Padma, 2009). En relación con la evaluación del contenido total de fenoles, se
encontró que la concentración de fenoles en las hojas de Moringa oleifera es menor a la
de té verde; siendo la concentración de esta última; muy similar a la encontrada en la
literatura (Bharti & Singh, 2020; Yang & Liu, 2013). Además, el contenido de fenoles totales
del extracto de hoja madura de Moringa oleifera presentó una mayor concentración, sin
embargo, no hubo diferencia significativa con relación a la hoja joven. La concentración de
fenoles reportada en literatura es variable, algunos estudios informan concentraciones
menores a las de este estudio (Nascimento et al., 2013), mientras que en otros las
concentraciones fueron superiores (Vyas, Kachhwaha, & Kothari, 2015). Así mismo, se
reporta que el contenido de compuestos fenólicos aumenta con el estado de madurez de
las hojas (Toit, Sithole, & Vorster, 2020). Sin embargo, en el presente estudio se observó
que en las hojas adultas disminuye significativamente el contenido de estos compuestos.
Con respecto al contenido de flavonoides totales, en este estudio se encontraron

concentraciones más altas en Moringa oleifera comparada con té verde. Además, el
extracto de hoja madura tuvo mayor concentración de flavonoides y fue significativamente
diferente a las demás muestras. Estas concentraciones fueron menores a las reportadas
por Wang et al., (2020). De igual forma, los compuesto fenólicos predominantes en Moringa
oleifera, reportados en la literatura, son los flavonoides y dentro de estos quercetina,
kaempferol y sus derivados se encuentran en mayor concentración (Cadorin Oldoni et al.,
2019; Hamed et al., 2019; Rodríguez Pérez, Quirantes Piné, Fernández Gutiérrez, &
Segura Carretero, 2015). Algunos estudios reportan que la concentración de estos
compuestos se correlaciona con la actividad antioxidante de la planta (Wang et al., 2020;
Hamed et al., 2019).
Por otro lado, el contenido de catequinas de Moringa oleifera fue significativamente menor
al de té verde y no hubo diferencia significativa entre las muestras de extracto de Moringa
oleifera. La concentración de catequinas encontrada en este estudio para té verde (49,21
Discusión 43
± 2,7 mg g-1) fue menor a la reportada en literatura (365,1 mg g-1) (Barriera et al., 2020) y
hasta donde se conoce no se han realizado reportes de concentración de catequinas en
extractos de Moringa oleifera.
Por su parte, en este estudio, la actividad antioxidante del extracto de Moringa oleifera en
los tres tipos de hojas fue mayor a la del extracto de té. Los valores encontrados para
DPPH (557,79 ± 51,35 a 1140,69 ± 59 µmoles g-1) y FRAP (1784,65 ± 54,4 a 2923,09 ±
65,3 µmoles g-1) fueron superiores a los reportados en la literatura (526,4 ± 47,6 y 1436,5
± 53,8 µmoles g-1, respectivamente), mientras que para ABTS se encontraron valores entre
373,37± 0,8 y 532,5 ± 28 µmoles g-1, menores a los reportados (876,0 ± 43,4 µmoles g-1)
(Cadorin Oldoni et al., 2019). Así mismo, para el IC50 de Moringa oleífera ha sido reportado
un valor de 26,61 mg L-1, menor al encontrado en este estudio (108,7 mg L-1) (Farooq &
Koul, 2019). Es conocido que a un menor valor de IC 50 mayor es la capacidad reductora
del extracto. Del mismo modo, se ha informado que el poder reductor de los compuestos
bioactivos está relacionado con la actividad antioxidante, la concentración de compuestos
fenólicos y su capacidad de donar átomos de hidrógeno y electrones. Es así, como el
extracto de Moringa oleifera podría detener la reacción de los radicales libres y crear un
producto estable (Moyo et al., 2012; Sreelatha & Padma, 2009).
De acuerdo con los resultados de este estudio, el extracto de hoja madura de Moringa
oleifera presentó el mayor contenido de compuestos fenólicos y actividad antioxidante, en
contraste con el extracto de hoja joven y adulta. Por tanto, el extracto de hoja madura fue
usado para evaluar su efecto durante la maduración in vitro de oocitos bovinos. Por
consiguiente, a este extracto se le realizaron los análisis de determinación de fenoles
totales y actividad antioxidante y se observó que las concentraciones disminuyeron. Este
efecto probablemente se deba a los tiempos de extracción y de rotaevaporación, ya que
por tratarse de volúmenes altos el tiempo para cada procedimiento aumentó. Así mismo,
se ha informado que el método de evaporación de los solventes influye sobre el contenido
total de fenoles de los extractos, y la exposición de estos durante largos periodos a presión
y calor en el proceso de rotaevaporación puede causar el deterioro de los compuestos
fitoquímicos (Bennour, Mighri, Eljani, Zammouri, & Akrout, 2020). Es importante recalcar
que, hasta el momento solo un estudio evaluó este extracto sobre la maduración in vitro
de oocitos ovinos, reportando un aumento en la maduración meiótica (Barakat et al., 2015),
pero no hay datos relacionados al desarrollo posterior. Por tanto, el presente estudio es el
bovinos
primero en evaluar el extracto de hojas de Moringa oleifera sobre la competencia del oocito
y la calidad de los blastocistos.
En este estudio, el extracto de Moringa oleifera no tuvo un efecto significativo en el estado

de maduración nuclear de los oocitos en las diferentes concentraciones evaluadas. Estos
resultados difieren de los encontrados por Barakat, Khalil, & Al-Himaidi, (2015), en donde
reportan que la suplementación del medio de maduración con este extracto en diferentes
concentraciones aumenta la tasa de maduración nuclear de oocitos ovinos. Por otro lado,
con el uso de quercetina, flavonoide presente en el extracto de Moringa oleifera, no se
encontró efecto significativo en la maduración nuclear de los oocitos bovinos (Guemra et
al. 2013). Este mismo resultado se encontró con la utilización de ácido ascórbico en
porcinos (Kere, Siriboon, Lo, Nguyen, & Ju 2013), y en bovinos (Sovernigo et al. 2017). De
igual forma, en el presente estudio no se encontró diferencia significativa en la maduración
nuclear de los oocitos con la suplementación de ácido ascórbico, por lo que se sugiere que
el no encontrar diferencias significativas en la progresión meiótica de los oocitos con
suplementación de polifenoles podría indicar que no está influenciada en gran medida por
el estrés oxidativo (Spinaci et al. 2019).
Por otra parte, se considera que la diferencia en los resultados obtenidos y en los
reportados por Barakat et al., (2015), puede deberse a los métodos de extracción, pues en
este estudio se realizó una extracción asistida por ultrasonido y el reportado en literatura
se realizó por percolación. Además, de los otros procesos a los que se sometió el extracto
y que pudieron afectar en alguna medida los compuestos presentes. Igualmente, estas
diferencias pueden deberse a otros aspectos metodológicos como la especie en estudio.
Con el fin de evaluar la actividad antioxidante del extracto, los niveles de EROs y GSH
intracelular fueron cuantificados en oocitos bovinos madurados in vitro, encontrando que
redujo significativamente los niveles de EROs, lo que significa que este extracto actuó
como antioxidante y neutralizó las EROs. Sin embargo, no promovió el aumento de GSH.
Generalmente, la disminución de las EROs se asocia con el aumento de los niveles de
GSH cuando el medio de maduración se suplementa con sustancias que promueven su
almacenamiento, este es el caso de los antioxidantes (Fan et al., 2017). Por su parte, el
Discusión 45
efecto que se observó con la suplementación de extracto de Moringa oleifera en el medio

MIV en relación a los niveles de EROs puede atribuirse a la presencia de compuestos
antioxidantes como el ácido ascórbico, la vitamina E y flavonoides, entre otros compuestos
fenólicos (Fotio, Nguepi, Tonfack, Temdie, & Nguelefack, 2020). También se ha encontrado
en otros tejidos (tejido hepático) que la administración oral de extracto de Moringa oleifera
en ratas redujo las EROs (Khalil et al., 2020). En este tipo de tejidos los flavonoides
presentes en Moringa oleifera pueden estar involucrados en la regulación de la vía Nrf2-
ARE (factor de transcripción Nrf2- elemento de respuesta antioxidante), vía que regula la
expresión de genes de enzimas antioxidantes permitiendo la desintoxicación y la
mitigación de los efectos dañinos ocasionados por las EROs (Karthivashan, Arulselvan,
Tan, & Fakurazi, 2015).
Los mecanismos de acción de los compuestos antioxidantes de Moringa oleifera en oocitos

no han sido reportados. Sin embargo, estos mecanismos se pueden comparar con los
reportados para los polifenoles de té verde. Los polifenoles presentes en los extractos
tienen alta actividad antioxidante que se puede explicar por la distribución de los grupos
hidroxilo en la estructura de las moléculas, la transferencia de átomos de hidrógeno y la
transferencia de electrones (Zhang, Lin, Liu, Huang, & Liu, 2020). Es así como la reducción
de las EROs en este estudio, concuerdan con reportes relacionados con otros
antioxidantes polifenólicos como el extracto de té verde, cuyo componente principal son
las catequinas. Estas comparten características estructurales y químicas (como la
presencia de grupos hidroxilo) con la mayoría de compuesto fenólicos. El grupo hidroxilo
confiere a los compuestos fenólicos la capacidad de neutralizar los radicales •O2 y •HO y
actuar como agentes quelantes de metales (Roychoudhury, Agarwal, Virk, & Cho, 2017).
Con el uso de una catequina presente en el extracto de té verde, se reporta la reducción
de los niveles de EROs cuando se emplea en la maduración in vitro de oocitos bovinos
(Huang et al., 2018). Así mismo, el uso de otros compuestos fenólicos como quercetina y
resveratrol redujeron las EROs y no tuvieron efecto significativo sobre los niveles de GSH
en oocitos bovinos madurados in vitro (Sovernigo et al., 2017), mientras que en otros
reportes, el resveratrol utilizado durante la MIV disminuyó los niveles de EROs y aumentó
los niveles de GSH en oocitos de cabra (Mukherjee et al., 2014), bovinos (Torres, Muñoz
B, Urrego B, Echeverry, & Lopez, 2016) y cerdos (Kwak et al., 2012). Por otro lado, el
tratamiento con ácido ascórbico no tuvo diferencia significativa respecto al control para los
niveles de EROs y GSH, lo cual puede deberse a la concentración empleada en el presente
bovinos
estudio. Por lo contrario, otros estudios en donde se utiliza ácido ascórbico reportan el
aumento de GSH y la disminución de EROs durante la MIV de oocitos (Sovernigo et al.,
2017;Vásquez et al., 2014).
Diversos estudios reportan que el extracto de Moringa oleifera inhibe la peroxidación

lipídica, reduce el metabolismo de compuestos oxidantes y estimula la síntesis de GSH a
través del aporte de cisteína, aminoácido precursor de GSH. Este mecanismo se evidenció
en células hepáticas y cerebrales (Fotio et al., 2020), células trabeculares (Wulandari,
Umiati, & Sujuti, 2019) y células cardiacas (Aju, Rajalakshmi, & Mini, 2019).
El GSH es uno de los principales antioxidantes no enzimáticos de los oocitos e interviene

como sustrato para la síntesis de GPx y está compuesto por los aminoácidos glutamato,
cisteína y glicina (Hansen & Harris, 2015). La síntesis de GSH intracelular es uno de los
principales eventos críticos en el proceso de maduración de oocitos, niveles altos de GSH
en metafase II se consideran un marcador bioquímico de maduración citoplasmática y de
la mejora en la calidad del oocito, e indican un alto potencial en el desarrollo embrionario
debido a que protege el cigoto contra daños oxidativos antes de la activación genómica,
momento en que inicia la síntesis de novo de GSH (Soto-Heras & Paramio, 2020; Rocha-
Frigoni, Leão, Dall’Acqua, & Mingoti, 2016). Sin embargo, este mecanismo no se reflejó en
el presente estudio, ya que la suplementación con extracto provocó la disminución de los
niveles de GSH. Además, se observa que a concentraciones más altas de extracto, los
niveles de GSH son menores. Esto puede obedecer a una condición denominada “la
paradoja de la quercetina”, la cual consiste en un mecanismo de acción mediante el que
la quercetina neutraliza las EROs y genera como residuo un radical quercetina quinona
altamente reactivo a compuestos tipo tiol, principalmente GSH, lo que conduce a la
reducción de sus niveles (Spinaci et al., 2019; Boots et al., 2007). Otra posible respuesta
a este resultado es una mayor movilización y consumo de GSH, en busca de reducir las
altas concentraciones de EROs producidas en el proceso de manipulación y cultivo de las
células (Rocha-Frigoni et al., 2016). Lo anterior teniendo en cuenta que la síntesis de GSH
ocurre principalmente entre la etapa de VG a ruptura de la vesícula germinal y alcanza
valores máximos en MII, como preparativo para la fertilización y descondensación de la
cabeza espermática (H. J. Li et al., 2016) y al no haber síntesis de novo los niveles de GSH
se mantienen constantes gracias a procesos de óxido reducción. Durante este proceso
GSH actúa en el metabolismo de H2O2 con la intervención de GPx, lo que conlleva a que
Discusión 47
GSH se oxide formando glutatión oxidado (GSSG) y agua. Posteriormente, GSSG se

reduce por la acción de GSH reductasa dependiente de NADPH (Zhang et al., 2020;
Adeoye, Olawumi, Opeyemi, & Christiania, 2018; Marí et al., 2013). Si los niveles de H2O2
aumentan habrá mayor consume de GSH y el proceso de óxido reducción se verá
interrumpido (Adeoye et al., 2018).
La acumulación de GSH también puede verse afectada por la excreción de GSH oxidado
y la capacidad de penetración de la membrana plasmática y mitocondrial por los
compuestos antioxidante utilizados (Rocha-Frigoni et al., 2016). El paso de las moléculas
hacia el oocito puede dificultarse por su tamaño y una vez dentro de la célula, el paso hacia
las mitocondrias se puede obstaculizar por la carga de la membrana interna mitocondrial
(Gonçalves et al., 2021).
Algunos estudios mencionan que los bajos niveles de GSH en oocitos afectan el desarrollo
posterior y reducen el número de blastocistos obtenidos (Mukherjee et al., 2014). Pese a
que los niveles de GSH no fueron altos con la suplementación de extracto durante la MIV,
el desarrollo embrionario temprano no se vio afectado. No se conocen estudios que hayan
evaluado el extracto de Moringa oleifera en la tasa de blastocistos obtenidos, en general,
la suplementación del medio de maduración con quercetina, en otro estudio, mostró que
la tasa de blastocistos aumentó significativamente, lo que se atribuyó al aumento en los
niveles de GSH en el oocito maduro (J. T. Kang et al., 2016). Efecto contrario ocurrió
cuando al suplementar con taxilofina, un tipo de flavonoide, los niveles de GSH no
aumentaron, sugiriendo que esta respuesta afecto la competencia del oocito (J. T. Kang et
al., 2016).
El número total de células en blastocistos, representa uno de los paramentos más

utilizados para evaluar la calidad embrionaria. En el presente estudio no se encontró
diferencia significativa entre los tratamientos, lo que probablemente se deba a las bajas
concentraciones de GSH intracelular (Furnus et al., 2008). En este estudio, el número de
células en blastocistos no se vio afectado significativamente por la suplementación de
extracto de Moringa oleifera ni ácido ascórbico, lo cual concuerda con otros reportes en
donde el número de células en blastocistos de cerdos no aumentó con el uso de ácido
ascórbico (Nohalez et al., 2018). Por otro lado, el resveratrol, un antioxidante polifenólico
mostró un aumento significativo en el número total de células embrionarias cuando fue
bovinos
usado en medios de cultivo de embriones bovinos (Madrid Gaviria, López Herrera,

Restrepo Betancur, Urrego, & Echeverri Zuluaga, 2019), y en medio de maduración en
oocitos de oveja (Adeleh Zabihi, Shabankareh, Hajarian, & Foroutanifar, 2021).
Estos resultados pueden deberse a la baja estabilidad y disponibilidad de los compuestos

fitoquímicos del extracto por exposición a pH, luz, oxígeno y temperatura, o por limitaciones
en la absorción (Pachuau et al., 2021). En los últimos años se han utilizado mecanismos
que facilitan y garantizan el paso de las biomolecular a las células, es así como la
encapsulación representa una alternativa para mejorar la biodisponibilidad de los
componentes del extracto de Moringa oleifera en el medio de maduración in vitro. Esto
permite una mayor eficiencia al proteger los compuestos y facilitar su transporte a través
de la membrana. Un estudio reporta que las nanopartículas poliméricas ingresan
fácilmente al oocito y pueden ser utilizadas como portadoras de compuestos de interés.
En ese estudio, evaluaron la capacidad de paso de las nanopartículas a través de las
células del cúmulo y la zona pelúcida de oocitos bovinos y detectaron, después de dos
horas, la presencia de un número considerable de partículas en el interior del oocito.
Además, las partículas no son tóxicas debido a los materiales utilizados en su elaboración
(polietilenglicol, ácido láctico y ácido láctico-co-glicólico) (Gonçalves et al., 2021). También,
se han evaluado nanopartículas de núcleo lipídico y sus resultados revelan mayor acción
de antioxidantes, como la melatonina, en la MIV de oocitos bovinos (Remião et al., 2016).
Con el uso de estas nanopartículas lograron reducir los niveles de EROs y aumentar la
tasa de producción de blastocistos, además, establecieron que tienen la capacidad de
penetrar la zona pelúcida y la membrana plasmática y de permanecer en el interior del
oocito hasta la etapa de blastocisto (Remião et al., 2016).
6. Conclusiones y recomendaciones
6.1 Conclusiones
La hoja madura de Moringa oleifera presentó la mayor concentración de compuestos
fenólicos y actividad antioxidante. Por tanto, el extracto de hoja madura fue utilizado
durante la maduración in vitro de oocitos bovinos.
Con el presente estudio se evidenció que el extracto de Moringa oleifera redujo las
concentraciones de EROs en oocitos bovinos madurados in vitro. Sin embargo, los niveles
de GSH también se redujeron limitando el efecto antioxidante del extracto y las posibles
mejoras en la competencia del oocito.
Es importante resaltar que el extracto no tuvo efectos tóxicos sobre los oocitos ni los
blastocistos, lo que se evidenció en el proceso de maduración y desarrollo de blastocistos.
6.2 Recomendaciones
Es relevante evaluar las condiciones fisicoquímicas del medio cuando se suplementa con
sustancias como el extracto de Moringa oleifera, esto para verificar si ocurre algún cambio
que pueda afectar la competencia del oocito.
Pese a que los compuestos principales de Moringa oleifera son altamente polares sería
interesante evaluar la encapsulación de estos compuestos como método para facilitar su
paso hacia el citoplasma y la mitocondria.
Se sugiere hacer ensayos con otras concentraciones en busca de evaluar cuál es la

concentración óptima en la que se alcanzan los mejores efectos del extracto y además
cual es la concentración máxima en la que no se produce toxicidad.
Bibliografía
Abdel Fattah, M. E., Sobhy, H. M., Reda, A., & Abdelrazek, H. M. A. (2020).
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Extracto de Moringa - Maduración in Vitro de Ovocitos Bovinos

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Extracto de Moringa - Maduración in Vitro de Ovocitos Bovinos

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Efecto antioxidante del extracto de

Moringa oleifera en la maduración in

Lina Marcela Amaya Barragán

Universidad Nacional de Colombia

Lina Marcela Amaya Barragán

Universidad Nacional de Colombia

He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.

Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he

Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida

Lina Marcela Amaya Barragán

Fecha 17/03 /2021

A mi familia por su apoyo y motivación en todo momento, brindándome consejos,

Al grupo de investigación “Conservación, Mejoramiento y Utilización del Ganado Criollo

A mi directora Viviana Torres Osorio, por su apoyo, conocimiento y orientación brindada

Al profesor Harlen Torres Castañeda, por brindarme su apoyo y acompañamiento durante

A la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, por darme la oportunidad de realizar

A la Universidad CES, por acogerme en sus instalaciones y permitirme el uso de sus

A la Planta de Beneficio Central Ganadera, por suministrar el material biológico (ovarios)

Efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera en la maduración in vitro de

Palabras clave: blastocisto, biotecnología, estrés oxidativo, planta medicinal,

Antioxidant effect of Moringa oleifera extract on in vitro maturation of bovine

Keywords: blastocyst, biotechnology, oxidative stress, medicinal plant, cattle.

Resumen ............................................................................................................................ VII

Lista de figuras .................................................................................................................. XI

Lista de tablas ................................................................................................................... XII

Glosario ............................................................................................................................. XIII

2. Marco teórico ............................................................................................................... 5

3. Materiales y métodos ................................................................................................ 21

3.5.2 Determinación de Fenoles totales.................................................................... 23

6. Conclusiones y recomendaciones .......................................................................... 49

Figura 2-1: Acción pasiva y activa de EROs. ................................................................ 6

Tabla 2-1: Perfil nutricional de las hojas de Moringa oleifera ....................................... 14

FSH…………………………………………… Hormona folículo estimulante

Durante la MIV, el estrés oxidativo genera el envejecimiento prematuro de los oocitos

Una alternativa para aumentar el éxito de la MIV es el uso de extractos de plantas

1.1 Objetivo general

1.2 Objetivos específicos

Cuantificar el efecto antioxidante del extracto de Moringa oleifera durante la maduración in

2.1 Radicales libres y especies reactivas de oxígeno

Figura 2-1: Acción pasiva y activa de EROs.

Adicionalmente, las EROs tienen funciones sobre la maduración ovocitaria, la formación

La principal fuente de EROs es la fosforilación oxidativa llevada a cabo en las mitocondrias

2.2 Estrés oxidativo

Figura 2-2: EROs, estrés oxidativo e intervención de enzimas antioxidantes.

2.3 Especies reactivas de oxígeno en PIVE

2.3.1 Fuentes endógenas de EROs

Formación de EROs en la mitocondria (fosforilación oxidativa)

En la fosforilación oxidativa el piruvato y los ácidos grasos son oxidados en la mitocondria

Figura 2-3: Reducción del oxígeno

Participación fisiológica de EROS en PIVE

2.3.2 Fuentes exógenas de EROs

Medios de cultivo y suplementos

superóxido dismutasa de cobre y zinc (Cu-Zn SOD), superóxido dismutasa de manganeso

pH y temperatura de los medios de cultivo

parámetros conllevan a la producción excesiva de EROs (Agarwal, Durairajanayagam, et

2.3.3 Efectos deletéreos de EROs

modificación de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos, alteraciones mitocondriales, bloqueo

2.4 Antioxidantes naturales en la MIV

2.5 Generalidades de Moringa oleifera

Cada elemento estructural de este árbol presenta diferentes concentraciones de

2.6 Metabolitos de Moringa oleifera

Tabla 2-1: Perfil nutricional de las hojas de Moringa oleifera