Semana 14: 22/11/2021 Teoría: Dr.

Elvis Sergio Peralta Roldan

Técnicas en biología
Molecular I
Estas técnicas han favorecido notablemente el desarrollo de las ciencias biomedicas, en este sentido
debemos fijarnos como en esta pandemia que nos ha tocado vivir se ha podido lograr el desarrollo de
vacunas en un tiempo relativamente corto y esto gracias a que existen múltiples técnicas para ir
obteniendo todos esos principios activos que van a permitir finalmente desarrollar una inmunidad,
pero justamente el desarrollo de la ciencia y el perfeccionamiento de estas técnicas a permitido este
y muchos otros logros, continua en investigación y en mejoramiento de cada una de estas técnicas.

CULTIVO CELULAR
Se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in
vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas, estos aspectos
deben de cuidarse y estar bien mantenidas.
Las células cultivadas pueden obtenerse en grandes cantidades; casi todos los cultivos contienen
solo un tipo de célula; muchas actividades celulares distintas, como la endocitosis, el movimiento
celular, la división celular, el tráfico de membrana y la síntesis de macromoléculas, pueden estudiarse
en un cultivo celular; las células pueden diferenciarse en un cultivo, y las células cultivadas responden
al tratamiento con fármacos, hormonas, factores de crecimiento y otras sustancias activas. Como
ejemplo cuando se trato de células cancerígenas y se menciono que para diferenciarlas de las
normales se habían cultivado tanto células normales como cancerígenas en dos grupos diferentes
cada una, a los cuales se les metió con presencia de factores de crecimiento y otro grupo sin
factores de crecimiento, como conclusión se llego a que las células normales siempre necesitan
factores de crecimiento para poder proliferar, pero las células tumorales con o sin factores de
crecimiento siempre puede generar sus propios factores
de crecimiento, pero todo esto gracias a poder emplear
esta técnica celular de cultivo.
Tipos de cultivo celular:
-Cultivos primarios: cuando proceden directamente
del organismo vivo.
-Cultivos secundarios: son los que se obtienen de la
resiembra de otro cultivo.
Casi todos los cultivos primarios de células animales se toman de embriones, cuyos tejidos se
disocian con más facilidad en células que los tejidos de los adultos.
La disociación se efectúa con la ayuda de una enzima proteolítica, como la tripsina, que digiere los
dominios extracelulares de las proteínas que median la adhesión celular. Entre célula y célula hay
algunas uniones, las cuales son las adhesiones celulares y esta mediada por proteinas que están a
nivel de la membrana celular y esas proteínas que tienen una porción extracelular e incluso una
porción citoplasmática, esos son los dominios que a partir de ahí que una célula se junta con otra, y
la tripsina va a actuar a ese nivel en la parte extracelular de esas proteínas .
Luego el tejido se lava para eliminar la enzima y por lo general se suspende en una solución salina que
carece de iones Ca 2 + y contiene una sustancia, como tetraacetato de etilenediamina (EDTA), que
se une con los iones Ca2 + .
Los iones Ca 2 + desempeñan una función clave en la adhesión celular y su eliminación de los
tejidos facilita mucho la separación de las células.
Cuando las células ocupan toda
la superficie disponible se dice
que han alcanzado la
CONFLUENCIA.
En esta etapa, las células
establecen contactos entre ellas
que inhiben su proliferación y el
crecimiento se detiene.
Por eso, al cabo de un tiempo
hay que trasplantar las células a
un nuevo soporte.
Esta operación se denomina
subcultivo o pase.
Tenemos el tejido o de donde se va a obtener, este se va a disociar usando la enzima y luego esas
células se colocaran en el medio de cultivo, son inoculadas en un medio de cultivo fresco. Estas
células van a realizar la proliferación, se van a ir dividiendo y va a haber un momento que este
crecimiento que esta haciendo en monocapa como toda célula normal en monocapa, va a haber un
momento en que alcanza toda la superficie del medio de cultivo y por lo tanto no hay mayor espacio
para una célula mas. Ese preciso momento se puede decir que el tejido a llegado a la confluencia. A
partir de este cultivo se puede replicar, se puede hacer un pase, obteniendo un cultivo secundario,
entonces tenemos el subcultivo que se ha implantado y esas células use van a crecer van a ser
muchas más homogéneas que la anterior, estas células puedes criopreservarse, es decir preservarlos
a muy bajas temperaturas.
TIPOS DE CULTIVO CELULAR PRIMARIO:
• Cultivos en suspensión: medio acuoso en donde las células
se encuentran dispersas en el medio de cultivo. Su crecimiento
no depende del anclaje.
Este tipo de cultivo se restringe a las células
hematopoyéticas, células madre, líneas celulares
transformadas y células tumorales. Alcanzan la confluencia
cuando el número de células es grande y los nutrientes son
insuficientes.
• Cultivos en monocapa: las células crecen adheridas sobre un
soporte sólido (plástico o vidrio). El anclaje al sustrato es un
prerrequisito para la proliferación celular.
Es el método utilizado para la mayoría de las células excepto
para las hematopoyéticas.

Ventajas
-Permiten un control preciso y fino del medio
ambiente: Se pueden controlar las condiciones
físico-químicas (pH, temperatura, presión osmótica,
presión parcial de O 2 y CO2 ), y fisiológicos
(hormonas, factores de crecimiento, densidad
celular, etc.).
-Caracterización y homogeneidad de la muestra:
Una muestra de tejido es siempre heterogénea. Sin
embargo, al cabo de uno o dos pases, las líneas
celulares cultivadas son homogéneas, es decir, su
morfología y su composición son uniformes.
-Economía: En los cultivos celulares se emplean
disoluciones con una concentración mucho menor
que en el caso del animal completo.
Además, se garantiza el acceso directo de la sustancia a las células sin que se diluya y sin que
sufra ningún tipo de modificación metabólica.
-Cuestiones éticas: La investigación biomédica supone el sacrificio cada año de muchos miles de
animales de experimentación. El cultivo celular no puede reemplazar siempre al ensayo 'in vivo’
pero es una alternativa válida en muchas situaciones. Aquí se destaca también la ética ecológica.
 Desventajas
-Técnica sensible: El crecimiento de las células animales se tiene que
realizar en estrictas condiciones de ASEPSIA porque su crecimiento es
mucho más lento que el de los contaminantes más habituales (hongos,
levaduras, bacterias, micoplasmas, etc.). Además, las células animales son
incapaces de mantenerse vivas en ausencia de la compleja mezcla de
nutrientes presente en el plasma o en el fluido intersticial.
-Cantidad y costo: Producir 1 gramo de células en cultivo cuesta 10 veces
menos que obtenerlas a partir del tejido de un animal. En un laboratorio
normal se pueden conseguir hasta 10 gramos de células sin que se
resienta mucho el presupuesto de investigación.

Para producir hasta 100 gramos de células hay que incrementar tanto el instrumental como el
personal. Para producir cantidades mayores se necesitan instalaciones de tipo industrial.
-Inestabilidad: Muchas líneas celulares continuas son inestables y adoptan una dotación
cromosómica aneuploide, lo que afecta tanto a su velocidad de crecimiento como a su capacidad para
diferenciarse. La única manera de evitarlo es emplear líneas estables que se resiembran cada
determinado tiempo o después de un determinado número de generaciones a partir de un stock
congelado.
FRACCIONAMIENTO DEL CONTENIDO DE UNA CÉLULA
MEDIANTE CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL
-El aislamiento de una organela particular en gran cantidad suele lograrse mediante la técnica de
CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL, que depende del principio de que, en tanto sean más densas
que el medio circundante, las partículas de diferente tamaño y forma viajan hacia el fondo de un
tubo centrifugado a distintas velocidades cuando se colocan en un campo de centrifugación.
-Cuando una célula se rompe por homogeneización, las membranas citoplasmáticas se fragmentan
y los bordes de los fragmentos de la membrana se fusionan para formar vesículas esféricas
menores de 100 nm de diámetro.
-Las vesículas obtenidas de diferentes organelos (núcleo, mitocondria, membrana plasmática,
retículo endoplasmático, etc.) tienen diferentes propiedades, que les permiten separarse entre sí.
Esta técnica se conoce como fraccionamiento subcelular.
La centrifugación va a requerir de movimiento circular a grandes velocidades donde se coloca la
muestra, las partículas mas grandes son los primeros en llegar hacia abajo, mientras que los mas
ligeros se mantendrán arriba.
Para efectuar esta técnica se procede primero a la rotura mecánica de las células con un
HOMOGENEIZADOR.
Las células se homogeneizan en una solución amortiguada isotónica (que a menudo contiene
sacarosa), lo que previene la rotura de las vesículas de membrana por ósmosis.

El resultado del homogeneizador va a ser la muestra que será llevada a centrifugacion que en donde se ven los
tubos es en donde se aplican las muestras a grandes velocidades en un tiempo determinado

VALORES NORMALES DE LAS

DIVERSAS ETAPAS DE
CENTRIFUGACIÓN:
-Velocidad baja: 1000 veces la fuerza de
gravedad durante 10 minutos.
-Velocidad media: 20000 veces la fuerza
de gravedad por 20 minutos.
-Velocidad alta: 80000 veces la fuerza
de la gravidade por 1 hora.
-Velocidad muy alta: 150000 veces la
fuerza de la gravedad por 3 horas.
Vemos el primer tubo de centrifuga que contiene el homogenizado es decir a la célula rota, fraccionada y
por lo tanto es lo que se va a someter a una primera centrifugación a velocidad baja que implica mil
veces de fuerza de gravedad durante 10 minutos, luego lo retiramos y vamos a tener dos fases un
precipitado y un sobrenadante pero aqui vemos el resultado en el precipitado, tendremos células, núcleos
y citoesqueleto. Todo el sobrenadante se lleva a centrifugacion nuevamente aplicando la velocidad media,
luego vemos que tenemos en el precipitado mitocondrias, lisosomas y peroxisomas, su sobrenadante
también lo llevamos pero por velocidad alta y en el precipitado se tendrá mitocondrias y pequeñas
vesículas, este sobrenadante se lleva a una velocidad muy alta y tendremos macromoléculas, ribosomas
e incluso virus.
AISLAMIENTO, PURIFICACIÓN y FRACCIONAMIENTO
DE PROTEÍNAS
-La proteína debe aislarse en un estado relativamente puro antes de poder obtener información de la
estructura o la función de una proteína particular.
-La purificación completa de una proteína determinada suele requerir el uso de técnicas sucesivas
que aprovechan las diferentes propiedades de las proteínas que se separan.

PRECIPITACIÓN SELECTIVA
-Por lo general el primer paso en la purificación aprovecha las
diferencias en la solubilidad entre las proteínas mediante la
precipitación selectiva de la proteína deseada.
-La solubilidad de una proteína en una solución determinada
depende de un equilibrio relativo entre las interacciones
proteína-solvente que la mantienen en solución y de las
interacciones proteína-proteína que hacen que se agregue y
precipite de la solución.
-La sal que más se utiliza para la precipitación selectiva de
proteínas es el SULFATO DE AMONIO.

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA EN COLUMNA

CROMATOGRAFÍA: designa varias técnicas en las que
una mezcla de componentes disueltos se fracciona a su
paso por cierto tipo de matriz porosa.
En las técnicas de cromatografía líquida, los componentes
en una mezcla pueden relacionarse con una de dos fases
alternativas:
una FASE MÓVIL, consistente en un solvente en
movimiento, y una FASE ESTACIONARIA, que es la
matriz a través de la cual se mueve el solvente.
La fase inmóvil consiste en materiales que se empacan en
una columna.
Las proteínas que van a fraccionarse se disuelven en un
solvente y luego se pasan por la columna.
Los materiales que conforman la fase inmóvil contienen
sitios a los que las proteínas en solución pueden unirse.
Cromatografía de intercambio iónico
-La cromatografía de intercambio iónico depende de los enlaces iónicos de proteínas con un
material matriz inerte, como la celulosa, que contiene grupos con carga eléctrica unidos por
enlaces covalentes.
-Dos de las resinas de intercambio iónico más usuales son la dietilaminoetilcelulosa (DEAE) y la
carboximetilcelulosa (CM).

->La DEAE-celulosa tiene cargas positivas, por lo que se une con moléculas de carga
negativa; es un INTERCAMBIADOR DE ANIONES.
->La CM-celulosa posee carga negativa y es un INTERCAMBIADOR DE CATIONES.

-La resina se empaca en una columna y se permite que la solución de proteína pase por la
columna en un amortiguador cuya composición promueve la unión de algunas o todas las
proteínas con la resina.
Las proteínas se unen con la
resina en forma reversible y
pueden desplazarse por el
aumento en la fuerza iónica del
amortiguador (que agrega iones
para competir con los grupos
cargados de las
macromoléculas para sitios en
la resina) o por el cambio de su
pH.
Las proteínas se extraen de la
columna en orden, de la que
tiene una unión menos fuerte a
la unida con mayor fuerza.

Vemos la columna, la matriz, es celulosa y nos dice que es una DEAE-celulosa con carga
positiva, la mezcla se proteinas se va a colocar desde la parte superior que por gravedad va a
ir bajando pero solo las proteínas con carga negativa van a quedar atrapadas porque van a
establecer uniones iónicas con las cuentas de celulosa y obviamente los que tienen cargas
positivas pasan de frente desarrollándose una separación de diferentes tipos de proteínas.
Cromatografía de filtración en gel
La filtración en gel separa proteínas (o ácidos nucleicos) con base en su tamaño efectivo.
El material de separación consiste en cuentas diminutas que se empacan en una columna a través
de la cual la solución de proteína pasa lentamente.
Los materiales que se emplean en la filtración por gel se componen de polisacáridos con enlaces
cruzados (dextranos o agarosa) de distinta porosidad, lo que permite que las proteínas se difundan
dentro y fuera de las cuentas.

Lo que esta de blanco son las cuentas o perlas que se ven tres, las proteínas mas pequeñas quedarán atrapadas
en los poros pero las mas grandes pasan por los intersticios
Cómo purificar una proteína globular con una masa molecular de 125 kDa :
Un modo en que la proteína podría purificarse consiste
en pasar la mezcla por una columna de cuentas
Sephadex G-150, que permite la entrada de proteínas
globulares < 200 kDa.
Cuando la mezcla de proteínas pasa por el lecho de la
columna, la proteína de 250 kDa es incapaz de entrar
a las cuentas y permanece disuelta en la fase solvente
móvil.
Las otras dos proteínas pueden difundirse a los
Cromatografia de filtración en gel. Separación
intersticios entre las cuentas y su paso por la columna de 3 proteínas globulares con diferente
se retrasa. masa 250, 125 y 75 kDa.

Conforme más solvente pasa por la columna, estas
proteínas se mueven hacia abajo y salen por el fondo,
pero lo hacen a distintas velocidades. Entre las proteínas
que entran a las cuentas, las especies más pequeñas se
retrasan más que las grandes.
Las de 125 y 75 quedaran atrapadas mientras
que las 250 continuaran su paso. Irán
migrando y salen primero las que no estuvieron
dentro de los poros y luego las de segundo
tamaño y finalmente las de menor tamaño.
Cromatografía por afinidad
La cromatografia por afinidad aprovecha las propiedades
estructurales únicas de una proteína, lo que permite que una
especie de proteína se retire de manera específica de la
solución mientras que las demás quedan en ésta.
Las proteínas interactúan con sustancias específicas:
enzimas con sustratos, receptores con ligandos, antígenos
con anticuerpos, etc.
Cada uno de estos tipos de proteínas pueden retirarse de la
solución si la mezcla de proteínas se pasa a través de una
columna en la que la molécula específica de interacción
(sustrato, ligando, anticuerpo, etc.) se une mediante enlaces
covalentes con un material inerte e inmovilizado (la matriz).
Por ejemplo, los receptores no aceptan a cualquier ligando, es muy especifico, tiene un ligando especifico. Un
antígeno va a provocar una respuesta inmunitaria un anticuerpo para ese antígeno.
Cada uno de estos tipos de proteína puede retirar una solución si es que la mezcla de proteina pasa a través de
una columna donde va a encontrarse con una molécula específica para la interacción con esa proteína, uniéndose
mediante enlaces covalentes. En la imagen vemos el instrumento que contiene las esferas y estas se les incluye
insulina, y esta es un ligando para una proteína receptora de tal manera que lo que se busca de este contenido es
solamente la proteína que es receptor de insulina por eso que a las cuentas se le ha colocado insulina que por
afinidad tendrá que atrapar solo al receptor de insulina y de esa manera se hace esa selección.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

La separación electroforética de proteínas casi siempre se realiza por electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE), en la que las proteínas son impulsadas por una corriente que se aplica a
través de una matriz gelatinosa.
La matriz se compone de polímeros de acrilamida que establece enlaces cruzados para formar un
tamiz molecular.
El movimiento relativo de las proteínas por un gel de
poliacrilamida depende de la densidad de carga (carga por
unidad de masa) de las moléculas.
Mientras mayor sea la densidad de carga, la proteína se
impulsa con más fuerza por el gel y por tanto la migración
es más rápida.
No obstante, el tamaño y la forma también influyen.
-Las muestras de proteína suelen disolverse en una solución de sacarosa cuya densidad impide que la
muestra se mezcle con el amortiguador y luego se carga en los pozos con una pipeta fina.
-Se aplica una corriente directa al gel, lo que ocasiona que las proteínas se muevan en la
poliacrilamida en carriles paralelos.
Cuando se realiza con dodecil sulfato de amonio (SDS), como casi siempre sucede, las proteínas se
mueven como bandas a velocidades inversamente proporcionales a su masa molecular.
-Una vez que la electroforesis se completa, el gel se retira y se realiza la tinción.
La solución se va a cargar en los pocillos o los pozos con una
micro pipeta o pipeta fina, se hace la carga con las muestras y
se manifiesta que incluye un tinte rastreador, es decir que las
proteínas saldrán coloreadas porque van a migrar en este
sentido, en sentido vertical y este tinte nos va a permitir ver
hasta que punto a llegado una u otra proteína, todo esto se esta
llevando acabo en el gel de poliacrilamida.

El gen de poliacrilamida esta entre dos placas de vidrio protegías, se cargaron los pocillos y se le va aplicar un
cátodo y un ánodo, lo que va a impulsar que las propiedades ya manifestadas de las proteínas el tema que influye
su forma y tamaño, entonces estas van a migrar y se obtendrá el resultado que su interpretación de manera
general es que las bandas representan aquellas proteínas grandes que han podido migrar hacia el otro lado, hacia el
otro extremo y que las proteínas más pequeñas se quedan abajo. Si las grandes son mas gruesas es porque tienen
mayor cantidad de esa proteína frente a las delgaditas que la cual en esa muestra solo habían una cantidad menor.
En el otro extremo tenemos las fotografía de un gen de poliacrilamida y vemos como se ha distribuido según las
muestras que se han desarrollado.