Unidad 2

Realización de cultivos
celulares
Módulo: biología molecular y citogenética
 -2-

Objetivos

• Aprender los tipos de cultivos en citogenética

• Conocer los tipos de células y medios de cultivo
• Aprender a determinar la cantidad y viabilidad celular
• Conocer los posibles contaminantes de cultivo celular
 -3-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo celular → conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de

células de organismos pluricelulares in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades
fisiológicas, bioquímicas y genéticas
Cultivo de
Cultivo de células
órganos (primarios y
secundarios)
Cultivo de Cultivos
explantes histotípicos y
primarios organotípicos
 -4-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo de órganos

• Consisten en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase

entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada
• Se coloca el órgano sobre una rejilla en la interfase líquido-gas
• Permite mantener en parte la arquitectura característica del tejido in
vivo
• Se conservan las interacciones histológicas y gracias a ello permite
mantener los tipos celulares diferenciados → buenas réplicas del tejido
original
• No crecen mucho, no se pueden propagar (células maduras sin
capacidad de división)
• Se necesita un nuevo explante para cada experimento → mucho
trabajo, no es muy reproducible y difícilmente cuantificable
 -5-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo de explantes primarios https://www.youtube.com/watch?v=IBopkKSyck4

• Se coloca un fragmento de tejido o de órgano en la

interfase sólido-líquido de la superficie del soporte
de vidrio o plástico
• Las células de este fragmento se adhieren a la
superficie y las de la periferia del explante pueden
migrar y proliferar por toda la superficie, creciendo
en número
• Consiste en adherir un fragmento de tejido a la
superficie de la placa y nutrirlo con medio de cultivo
 -6-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo celular primario

• Es el más utilizado
• Se puede obtener a partir de suspensiones celulares o de explantes
primarios) de células disgregadas de cualquier tejido
• La disgregación se puede realizar por métodos enzimáticos o
mecánicos
• Las células se introducen en un recipiente junto con medio de cultivo y
se incuban en condiciones óptimas para que las células proliferen
• En estos cultivos se pierden las interacciones célula-célula y célula-
matriz extracelular
• Las células proliferan notablemente y la población celular crece
• Si las células han ocupado toda la superficie disponible → confluencia
 -7-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo celular primario

• Tipos de cultivo celular primario:

• Cultivos en monocapa: las células
crecen adheridas sobre un soporte
sólido (plástico o vidrio), es el método
más utilizado (excepto para células
hematopoyéticas)
• Cultivos en suspensión: las células
están dispersas en el medio de cultivo.
Su crecimiento no depende del anclaje.
Restringido a células hematopoyéticas, https://www.youtube.com/
tumorales y células madre watch?v=thPZ9F8NzFA
 -8-

Tipos de cultivos celulares

Cultivo celular secundario https://youtu.be/Oeo90Mw97Ws?feature=shared

• En la etapa de confluencia de un cultivo PRIMARIO se inhibe la proliferación celular, por eso

hay que trasplantar un grupo de células a un nuevo soporte → subcultivos (también llamados
cultivos secundarios o pases) → así obtendremos líneas celulares que podremos congelar

También se pueden obtener

a partir de líneas celulares
congeladas

https://youtu.be/EBaJcgzDOC0?feature=shared
 -9-

El ciclo celular
• El ciclo celular es el conjunto ordenado de actividades y cambios que experimenta una célula
desde su aparición como consecuencia de una división celular parental, hasta que se
transforma en dos células hijas mediante otra división celular

• 2 grandes fases: interfase y fase M de división celular (o

mitosis)

Interfase
• Fase de mayor duración
(tiempo variable)
• Periodo en el que la célula
crece y copia su ADN antes
de hacer la mitosis
• 3 fases: G1, S y G2
Fase M
• Mitosis, proceso por el cual
de una célula parental se
obtienen dos células “hijas”
idénticas, con la misma
dotación genética
• Fase rápida (1-2 horas)
• 5 fases
 - 10 -

El ciclo celular

Interfase
• Fase G1: primera fase del ciclo celular.
Periodo de crecimiento en tamaño de
la célula
• Fase S: fase de replicación y síntesis
de ADN, duplicación del material
genético
• Fase G2: la célula crece más, fabrica
más orgánulos (síntesis de proteínas y
ARN) y comienza a reorganizar su
material genético
 - 11 -

El ciclo celular https://www.youtube.com/watch?v=N97cgUqV0Cg

https://www.youtube.com/watch?v=L61Gp_d7evo

https://www.youtube.com/watch?v=GhD-haQU4Og
Fase M o mitosis
• Profase: condensación de cromosomas, formación de
huso mitótico (microtúbulos).
• Prometafase: la membrana nuclear se desintegra, los
cromosomas están condensados y dispersos.
• Metafase: los cromosomas se alinean en la placa
metafásica, anclados al huso mitótico. Las 2 cromátidas
hermanas de cada cromosoma están unidas.
• Anafase: las cromátidas de cada cromosoma se
separan hacia polos opuestos tensadas por el huso
mitótico
• Telofase: el huso mitótico desaparece, se forma nueva
membrana nuclear alrededor de cada conjunto de
cromosomas nuevo, se descondensan y se inicia la
citocinesis
https://www.youtube.com/watch?v=ELLINOKt_vI
 - 12 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención de las muestras

• Amniocentesis

• Biopsia corial

• Extracción de sangre periférica

• Extracción de médula ósea o punción lumbar

 - 13 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención de las muestras

Amniocentesis
• Recogida de líquido amniótico (10-15 ml) con una punción
transabdominal bajo control ecográfico
• Entre la semana 15-17 (incluso en la 18) de embarazo normalmente,
para que haya celularidad suficiente para realizar un cultivo celular y
menos riesgo de aborto
• Con la muestra recogida se crean cultivos y se realizan métodos de
bandeo cromosómico para estudiar microscópicamente el cariotipo
fetal
• Desventaja: demora de tiempo (15-20 días), contaminación materna
• Riesgo de aborto actual: 0,6 - 1%
https://www.youtube.com/watch?v=1kbnCsj_fpw
 - 14 -

Metodologías en cultivos celulares

https://www.elsevier.es/es-
revista-diagnostico-prenatal-327-
Obtención de las muestras ¿Cómo se hace? articulo-biopsia-corial-
transcervical-guia-practica-
S2173412711001089

Biopsia corial o coriónica

• Extracción transcervical o transabdominal de vellosidades
coriales o coriónicas

• Se emplea entre la semana 11-13 de embarazo (incluso de la

10 a la 14)

• Desventajas: más riesgo de aborto, es un cultivo de tejido

(difícil que crezca)

• Riesgo de aborto actual: 7-8%

https://www.youtube.com/watch?v=u-JZ_plCKtY
 - 15 -

Metodologías en cultivos celulares

Manutención y propagación
de cultivos
¿Qué necesitamos para mantener un cultivo?

• RPMI: medio Roswell Park Memorial Institute, es un medio celular usado para cultivos celulares. Tradicionalmente, es
usado para el cultivo de células humanas o de tejidos aislados (leucocitos, células neoplásicas…)

• Suero fetal bovino : FBS, es una mezcla compleja de biomoléculas que incluye factores de crecimiento, proteínas,
oligoelementos, vitaminas y hormonas.

• MEM o DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium, se le añade L-glutamina 1% como fuente de energía para
crecimiento rápido (también lleva glucosa, piruvato sódico y rojo fenol)

• Buffer HEPES 1%: es un agente amortiguador de ácido sulfónico para mantener pH 7-7,4

• Antibióticos 1%: penicilina, estreptomicina que erradican bacterias Gram + y -

• Factores de crecimiento
 - 16 -

Metodologías en cultivos celulares

Manutención y propagación
de cultivos
• Medios materiales:

• Flask

• Placas de Petri

• Pipetas

• Tubos (Falcon)

• Cabina de flujo laminar

 - 17 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención, mantenimiento y propagación de
cultivos de muestras prenatales
• Cultivo de vellosidad corial o coriónica:
• Lavar para eliminar restos de sangre materna
• Trocear
• Recoger en 2-3 tubos con 3 ml de medio de cultivo
RPMI cada uno (o 1 tubo con unos 10 ml si la muestra
es grande)
• Posteriormente se pasa a PLACAS DE CULTIVO!!
• Incubar 7-15 días a 37ºC en estufa
• Se deben hacer pases o subcultivos cuando se
alcance la confluencia https://www.youtube.com/watch?v=FeBvW_ERiKk
 - 18 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención, mantenimiento y propagación de
cultivos de muestras prenatales
• Cultivo de líquido amniótico:
La prueba revisa el riesgo del bebé de
• Depositar la muestra en 2 tubos tener ciertos trastornos
genéticos (defecto del tubo neural,
• Centrifugar los tubos y recoger el sobrenadante síndrome de Down).
Se realiza entre las semanas 15 y 20
para determinar la alfa-fetoproteína (AFP) del embarazo.

• El pellet (en el libro lo llaman “botón celular”) se

resuspende en unos ml de medio de cultivo y se
siembra en PLACAS
• Incubar 7-15 días a 37ºC en estufa
• Se deben hacer pases o subcultivos cuando se
alcance la confluencia
 - 19 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención, mantenimiento y propagación de
cultivos de muestras postnatales
• Cultivo de sangre periférica:
• La sangre extraída se siembra de forma
directamente en tubo con medio de cultivo (la
sangre debe provenir de otro tubo con un
anticoagulante como la heparina)
• la cantidad de sangre REAL utilizada es 1 ml aunque
en el libro pone 4-6 gotas
• El volumen total del cultivo es de unos 5 ml (4 ml
de medio de cultivo y 1 ml de sangre) https://www.yout
• Se incuban a 37ºC aproximadamente 4 días ube.com/watch?a
pp=desktop&v=RR
0_iuoOZTA
 - 20 -

Metodologías en cultivos celulares

Obtención, mantenimiento y propagación de
cultivos de muestras postnatales
• Cultivo de médula ósea: https://www.youtube.com/watch?v=bi8fOCQtq4s

• El líquido obtenido se siembra directamente en

tubos con medio de cultivo y después se pasa a
placas con medio de cultivo, para hacer subcultivos
• Se incuban a 37ºC

https://www.youtube.com/watch?v=73miPgDW_MQ
 - 21 -

Determinación de cantidad y viabilidad celular

Colorante vital

• Los colorantes vitales permiten distinguir células vivas de células muertas

• El más habitual → Azul tripán

Células azules Células blancas

• No viables (muertas)
• Viables (vivas)
• Se tiñen porque su
• Su membrana plasmática
membrana plasmática se
está intacta y el colorante
ha roto y el colorante a
no puede penetrar
penetrado
 - 22 -

Determinación de cantidad y viabilidad celular

https://www.youtube.com/watch?v=zyeIwczdgnA

Contaje o recuento https://www.youtube.com/watch?v=G0wmfyn3hqA

https://www.youtube.com/watch?v=G0wmfyn3hqA
• El contaje es el proceso de recuento de células viables
• Se hace en una cámara de recuento celular o hemocitómetro (cámara de
Neubauer)
• Se utiliza para conocer las características de las líneas celulares y determinar
el método de cultivo (saber cuándo hacer los pases)
• La concentración recomendada es de 1,6 x 𝟏𝟎𝟔 células
viables/ml

X
dilución
 - 23 -

Determinación de cantidad y viabilidad celular

Contaminación de
cultivos celulares
• Alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados
• La contaminación puede provocarla el operador o la contaminación del ambiente
• Contaminantes más comunes:
• Bacterias generales y hongos levaduriformes: contaminan cultivos a corto plazo
• Micoplasmas: bacterias “especiales” sin pared celular, pueden provenir de líneas
celulares continuas que se contaminan o de sueros animales contaminados
• Virus: provienen de sueros animales, aunque está muy controlado actualmente.
Los materiales con los que se
trabaja deben estar dentro de la
El cuarto de cultivos es una campana y desinfectados.
habitación aislada, separada del La campana debe estar
resto del laboratorio, que cuenta esterilizada, desinfectada y limpia
con, al menos, 1 campana de flujo (obligatorio, antes de comenzar,
laminar vertical (CBS tipo 2 A) desinfectar todo con ETOH 70%)
 - 24 -

Muchas gracias