UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA

Guía de Laboratorios
Principios de Sistemas Celulares

Profesores
Dra. Adriana Pineda
Dr. Eduardo López

Primer semestre
2022
 REPORTE DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Preparación de ADN genómico vegetal

Nombres integrantes: Amanda Barrientos, Gonzalo Pinochet y Andrea Rodríguez.

Nombre Profesor: Eduardo López

Fecha de entrega: 09 de junio del 222

Puntaje máximo =45 puntos = 7.0

% exigencia 60% = 27 puntos = 4.0

En base a los resultados de la electroforesis en gel de agarosa y de la lectura de absorbancia a

260 y 280nm para su preparación de ADN genómico, discuta y/o responda los siguientes
planteamientos. Para ello, muestre en una tabla los resultados de absorbancias entregados y
una figura del gel de agarosa donde individualice su preparación.

1. Evalúe la calidad de su preparación (integridad), considerando el tamaño de la banda

principal, si la hay, y/o de los fragmentos visualizados. Considere el valor referencial de las
diferentes bandas del marcador de tamaños de ADN (10 puntos).

Congelado por nitrógeno: el nitrógeno es el primer paso de esta operación de extracción

de ADN. Es por ello que, es necesario que este proceso ocurra rápidamente y de manera
certera. Es decir, se debe procurar que la muestra vegetal este completamente congelada.
Esto se apreciará en la fragmentación de la muestra que tendrá a convertirse en polvo.
Pero, si el proceso de congelación es deficiente, la muestra no se fragmentará
eficientemente y tendrá a formar una pasta. Es por ello que, este paso podría mejorarse a
modo de garantizar el correcto congelado, por ejemplo, se podría dar mas tiempo de
congelado o congelar en un recipiente que evita estar en contacto con el medio ambiente,
a modo de evitar el rápido acenso de la temperatura de la muestra.

Un mayor centrifugado podría permitir una mejor separación de fases en la muestra de

ADN, por ello, podría proponerse mayores revoluciones de giro en menos tiempo de
operación en cada ciclo de centrifugado.

El uso de componentes orgánicos para aislar el gen de ADN podría usarse en una
concentración ligeramente mayor para asegurar la mayor cantidad de extracción posible
de ADN.

Finalmente, es recomendable trabajar con una mayor masa y volumen de muestras, a

modo de que, se puedan tomar varios duplicados y tener un análisis mucho más completo
y representativo.
2. ¿Cuáles fueron, a su juicio, los pasos claves en este resultado, y cuáles consideraciones se
deben tomar para optimizarlos? (10 puntos).

Se nombrará 1 paso clave por cada etapa del proceso de extracción de ADN:

1.- Extracción:
Como grupo se considera que el paso clave en esta etapa (y el más importante de la
experiencia) es el procedimiento de pulverización de tejido vegetal, ya que es aquí en
donde se fragmentará el tejido con el cual se trabajará a lo largo de toda la
experiencia.
Para optimizar este paso, se recomienda encontrar una fuerza de trituración
(utilizando un mortero) intermedia, no muy fuerte, ya que se debe preservar el ácido
nucleico, pero lo suficientemente enérgico como para lograr romper el tejido. Se
sugiere realizar con mucho cuidado y concentración, ya que el tejido debe
permanecer congelado para una óptima trituración, por lo tanto, se debe estar
pendiente del estado físico (congelado o líquido) del triturado. Los golpes que se le dé
al mortero con el pistilo deben ser ojalá vertical a la superficie del mortero, ya que, si
se tritura en círculos, es probable que se forme una pasta y no un polvo, que es lo que
se quiere lograr. Además de que, con la trituración circular, queda mucho material
disperso y adherido al mortero.

2.- Precipitación del ADN:

En esta etapa se considera como paso clave la correcta extracción de la fase superior,
sin arrastrar la fase inferior, puesto que solventes como el cloroformo contaminan
fácilmente el ADN, por lo que recomienda evitar acarrear la fase inferior.

3.- Lavado de ADN:

Aquí se considera como paso clave la centrifugación (ya que es la etapa en donde más
se realiza) y para optimizarlo, se recomienda no exceder la fuerza de centrifugación de
5000 x g, pues de lo contrario se comprimirán los sedimentos, dificultando la
solubilización del ADN.

4.- Solubilización del ADN:

Por último, para esta etapa se considera como paso más importante el pipeteo en el
retiro de etanol, para lograr una solubilización completa del ADN genómico.

Por tanto, se recomienda escoger al integrante del grupo con mejor pulso y mayor
precisión para pipetear, puesto que se debe realizar varias veces y de forma
milimétrica. También se sugiere máxima concentración y delicadeza, pues una
solubilización incompleta dará como resultado la pérdida de ADN durante el paso final
de centrifugado.

3. Realice una comparación de los resultados obtenidos en su extracción de ADN contra la

del plásmido empleado en términos de integridad y calidad de la preparación (5 puntos).
Primero que todo, es importante señalar que la función de utilizar el plásmido en la
experiencia realizada es entregar un parámetro de comparación, puesto que, al ser solo
material genético, será una representación ideal de cómo deberían verse las muestras en
las cuales la extracción fue idónea.

Ahora bien, si se compara la banda del plásmido versus la banda resultante en el

laboratorio, es posible observar y deducir que a pesar de que el procedimiento de
extracción de ADN fue seguido paso a paso, la manipulación no fue la correcta, pues en
contraste con el plásmido no se distingue ninguna banda, solo se visualiza un sendero o
estela luminosa a lo largo del gel indicio de que el ADN no está integro, sino fragmentado.

Plásmido de Muestra en
referencia estudio

Por otra parte, la calidad de preparación de la muestra de ADN, no se reduce

simplemente a la comparación con el plásmido, sino que esta engloba diferentes
aspectos que entregan información, como la concentración de la muestra, la pureza,
integridad, entre otras.

En el caso del laboratorio, la calidad pudo ser evaluada mediante la

espectrofotometría llevada a cabo, la cual indica el grado de pureza que obtuvo la
muestra “basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una
solución a una longitud de onda determinada” de este modo se utiliza la relación de
absorbancias 260/280 para evaluar la pureza del ADN, en donde para dicha relación se
 considera un ADN de óptima pureza entre los valores de ratio 1.8-2.0. Siendo la ratio
promedio de la muestra 1.84, por lo tanto, existe un buen grado de pureza lo que no
significa calidad, pues esta también depende de la integridad del ADN y los otros
conceptos previamente mencionados.

4. ¿Cuáles son las características del plásmido y del marcador de tamaños de ADN
empleados? (5 puntos).

Si bien, no se pudo encontrar información del plásmido pJLN43 (al parecer a ningún grupo
logró encontrar información) sí se puede decir que posee 43.000 pares de bases y se
puede dar características de los plásmidos, los cuales son moléculas pequeñas de ADN
circular. Ellos pueden encontrarse en bacterias y otros organismos microscópicos.

Un plásmido es una molécula pequeña de ADN circular que se encuentra en las bacterias
Los plásmidos están separados físicamente del ADN cromosómico y poseen su propio
origen de replicación. “Habitualmente tienen un número reducido de genes (cabe señalar,
algunos asociados a la resistencia a los antibióticos), y se pueden transmitir de una célula a
otra. Los científicos utilizan métodos de ADN recombinante para insertar en un plásmido
genes que desean estudiar. Cuando el plásmido se copia a sí mismo, también hace copias
del gen insertado.” (National Human Genome Research Institute Home [NHGRI], 2022)

El marcador empleado en la experiencia de laboratorio fue el Lambda DNA/EcoRI+HindIII,

es importante mencionar que el termino Lambda DNA alude a la secuencia de nucleótidos
del fago lambda, el cual es un tipo de bacteriófago (virus que afectan principalmente a
bacterias).” Este es el más conocido, ya que ha servido como modelo de estudio en
biología molecular.” (Bioted, sin fecha)

Por otra parte, los términos EcoRI Y Hind III hacen referencia a enzimas de restricción que
digieren el DNA lambda (cortan en diferentes lugares la secuencia de DNA), luego “estas
digestiones se preparan comercialmente con el nombre de marcadores de peso molecular
conocido o estándar y se utilizan para determinar el tamaño de fragmentos de ADN en una
electroforesis en gel de agarosa.” (Bioted, sin fecha)

Las características destacadas de este marcador son:

 Dimensionamiento y cuantificación aproximada de grandes fragmentos de ADN

 Genera bandas nítidas
 Se suministra con colorante de carga para una muestra de ADN
5. Calcule el rendimiento de su preparación de ADN, en µg ADN/g de tejido. Para ello tome
en cuenta la concentración obtenida por absorbancia a 260 nm (5 puntos).

El rendimiento será calculado de acuerdo con la relación matemática:

Entonces, para 6 de ADN insertos en 725 ng/ul:

Notemos que, el rendimiento es bastante bajo para la cantidad de muestra empleada de

tejido celular. Lo anterior indica que efectivamente una una mala gestión en el proceso de
extracción de ADN. Siendo un porcentaje bastante pequeño que ha sido extraído del tejido
celular.

6. Calcule y evalúe el grado de pureza de su preparación (contaminación proteica) en función

de la relación de absorbancias 260nm/280nm obtenidas, considerando que un valor de
260/280 = 1,8 es una preparación pura de ADN (10 puntos).

El análisis cuantitativo de espectroscopia arrojo los siguientes resultados:

 Notamos que, para un rango de longitud de onda de luz UV de 260 nm tenemos una media
de 0.7 de absorbancia, siendo un valor muy menor a lo esperado de 1.8. Indicativo de que
la muestra contiene impurezas.

En el rango de 280 nm, la media es de 0.4, indicativo nuevamente de una muestra

contaminada con otras sustancias orgánicas.

Lo anterior concluye que, el procedimiento experimental presencio problemas en la

correcta extracción de ADN, resultando estar contaminada con otros compuestos
organicos.
Por otro lado, se aprecia que la concentración aproximada en 260 nm y 280 nm es 725
nm/ul y 696.5 nm/ul respectivamente.

Referencias

National Human Genome Research Institute Home. (6 de junio del 2022). Plásmido.
https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Plasmido#:~:text=Los%20pl
%C3%A1smidos%20est%C3%A1n%20separados%20f%C3%ADsicamente,de%20una
%20c%C3%A9lula%20a%20otra.

Bioted. (s.f.). Introducción a las enzimas de restricción.

https://www.bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-RESTRICCION.pdf

Departamento de control de calidad del Banco Nacional de ADN. (2020, octubre). Programa de
control de calidad de muestras de ADN y ARN. https://www.bancoadn.org/docs/programa-
control-calidad-muestras.pdf

Instituto Nacional de Ecología y Cambio Climático (INECC). Alejos, L., Aragón, M., & Cornejo, A.
(s.f.). Extracción y purificación de ADN.
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/extraccion.pdf

Productos y equipos biotecnológicos. (junio de 2014). Protocolo Sugerido.

http://www.probiotek.com/wp-content/uploads/2015/12/DNAzolES-PROTOCOLO.pdf
ThermoFisher Scientific. (s.f.). Extraction of DNA From Plants Using Plant DNAzol
Reagent. https://www.thermofisher.com/cl/es/home/references/protocols/nucleic-
acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/extraction-of-dna-from-plants-
using-plant-dnazol-reagent.html

Thermo Scientific. Marcador Lambda DNA/EcoRI plus HindIII. (s.f).

https://www.fishersci.es/shop/products/fermentas-lambda-dna-ecori-hindiii-marker-3/p-
4529818#:~:text=El%20marcador%20Lambda%20DNA%2FEcoRI,en%20un%20tamp%C3%B3n
%20de%20conservaci%C3%B3n.